一种胡椒醛有关物质的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析检测技术领域，具体设计一种胡椒醛有关物质的检测方法。


背景技术：

2.胡椒醛(c8h6o3)，又名洋茉莉醛、胡椒甲醛、天芥菜精、天芥菜醛等，学名3,4-亚甲二氧基苯甲醛，分子量为150.13，沸点为264℃；外观为白色或淡黄色结晶体。因其具有清甜的豆香兼茴香香气，想起较淡而留长而被广泛用于各类日用化妆品香精、使用香精中，并且在香料加工、医药、农药和电镀行业也都有广泛的应用，例如根据文献报道，他达拉非的合成主要途径多是以d-色氨酸甲酯和胡椒醛为启示原料，通过皮克特-施彭格勒(pietet-spengler，简称p-s缩合)反应制备顺式四氢咔啉衍生物，然后再与氯酰氯和甲胺反应得到他达拉非。为了提高胡椒醛的生产纯度，避免其中含有的杂质给后续生产利用带来影响，需要控制胡椒醛生产过程中产生的有关物质的含量，目前胡椒醛中的已知杂质为胡椒环、邻位胡椒醛、硝基胡椒醛。
3.针对上述杂质，工业和信息化部2014年出台了关于洋茉莉醛(胡椒醛)的要求、实验方法、检测规则等的规定——qb/t 1788-2014，其中采用毛细管柱气相色谱法、氢火焰例子化检测器检测胡椒醛的含量进行检测。中国专利cn 115184527a公开了一种洋茉莉醛杂质的检测方法，其采用高效液相色谱法进行检测，色谱条件为色谱柱为c8柱；辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相a为体积比85:15的体积分数0.1％的三氟乙酸溶液和乙腈混合溶液；流动相b为体积比5:95的体积分数0.1％的三氟乙酸溶液和乙腈混合溶液；线性梯度洗脱。
4.但现行的标准只涉及了胡椒醛纯度和含量的检测分析，对于其他杂质如胡椒环、邻位胡椒醛、硝基胡椒醛的定位和含量检测均没有做出规定。而采用高效液相色谱法虽然不受式样挥发性的限制，但鉴于胡椒醛有关物质的沸点均不易受热分解、沸点处于中等水平，且高效液相色谱法的成本较高、灵敏度较低，因此对胡椒醛有关物质的检测达不到准确度和精密度的要求。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种胡椒醛有关物质的检测方法，采用毛细管柱-气相色谱法，并采用梯度升温程序，简单准确的检测出胡椒醛有关物质的含量，其中检测的定量限约为样品浓度的0.030％，检测限约为样品浓度的0.015％。
6.本发明采用的技术方案如下：
7.一种胡椒醛有关物质的检测方法，具体包括以下步骤：
8.(1)将胡椒醛供试品溶解于无水乙醇中，得到供试品溶液；
9.(2)根据已知的各杂质种类，配制杂质储备液，并配制系统适用性溶液；
10.(3)采用毛细管柱-气相色谱法对供试品溶液、系统适用性溶液进行分离检测，计算杂质含量。
11.优选的，供试品溶液的浓度为0.5-1.0mol/l。
12.优选的，步骤(2)所述杂质储备液的配制方法为取各杂质样品各10mg混合，用无水乙醇溶解并定容至10ml；系统适用性溶液的配制方法为取胡椒醛供试品150mg，加入杂质储备液1.5ml溶解混匀即得。
13.优选的，步骤(3)所述毛细管柱-气相色谱法的色谱条件为：色谱柱为db-ffap(30m
×
0.53mm
×
1.0μm)；梯度升温；进样分流比为10:1，进样口温度240℃；检测器温度为250℃，进样体积1μl。
14.进一步优选的，所述梯度升温的升温程序为120℃、8℃/min，160℃、5℃/min，240℃、end。
15.优选的，步骤(3)所述的计算方法为峰面积归一化法。
16.优选的，所述杂质包括胡椒环、邻位胡椒醛、硝基胡椒醛中的一种或多种。
17.本发明的有益效果在于：本发明根据胡椒醛生产工艺及他达拉非杂质研究控制策略，对胡椒醛中的已知杂质胡椒环、邻位胡椒醛、硝基胡椒醛的检测方法进行了探索优化，最终得到了胡椒醛有关物质的最佳检测方法为采用毛细管柱气相色谱法，其中升温程序为120℃、8℃/min；160℃、5℃/min；240℃、end；进样口温度为240℃、检测器温度为250℃。同时通过系统适用性、专属性、检测限、定量限均符合要求，其中胡椒醛及有关物质的定量限检测范围约为样品浓度的0.030％，检测限范围约为样品浓度的0.015％；同时耐用性结果表明流速(
±
0.5ml/min)、初始柱温(
±
5℃)、进样口温度(
±
5℃)、检测器温度(
±
5℃)变化对本品有关物质及有关物质测定影响较小。表明该分析方法适用于用于胡椒醛有关物质检测。
18.本发明采用的采用毛细管柱气相色谱法进行胡椒醛有关物质的检测，具有操作简单，灵敏度高、成本低等优点。
附图说明
19.图1为实施例1中1-1组升温程序下的色谱图。
20.图2为实施例1中1-2组升温程序下的色谱图。
21.图3为实施例1中1-3组升温程序下的色谱图。
22.图4为实施例1中1-4组升温程序下的色谱图。
23.图5为实施例1中1-5组升温程序下的色谱图。
具体实施例
24.下述实施例中采用的各种溶液的配制方法如下：
25.供试品溶液：取胡椒醛供试样品1g(精确到小数点后4位)置于10ml容量瓶中，加入无水乙醇溶解并定容即得；
26.杂质储备液：取每个杂质样品各10.0mg，无水乙醇溶解并定容至10ml；
27.系统适用性溶液：取胡椒醛供试品150.0mg，加入杂质储备液1.5ml溶解混匀即得。
28.空白溶液：无水乙醇；
29.对照品储备液：分别称取胡椒环30.15mg、邻位胡椒25.40mg和硝基胡椒26.11mg，置于25ml量瓶中，加入无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得；
30.对照品溶液：取对照品储备液1.0ml，于10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度摇匀即得；
31.未加标溶液：取胡椒醛供试样品1.0320g，于10ml量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀即得；
32.80％加标溶液：取胡椒醛供试样品约1g(精确到小数点后4位)，于10ml量瓶中，加无水乙醇约8ml溶解后，精密量取对照品储备液0.8ml并加入，然后用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，平行配制3份；
33.100％加标溶液：取胡椒醛供试样品约1g(精确到小数点后4位)，于10ml量瓶中，加无水乙醇约8ml溶解后，精密量取对照品储备液1.0ml并加入，然后无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得，平行配制3份；
34.120％加标溶液：取胡椒醛供试样品约1g(精确到小数点后4位)，于10ml量瓶中，加无水乙醇约8ml解后，精密量取对照品储备液1.2ml并加入，然后无水乙醇稀释至刻度，摇匀即得，平行配制3份。
35.实施例1色谱条件的确定
36.采用毛细管柱气相色谱法，并以db-ffap(30m
×
0.53mm
×
1.00μm)为色谱柱，8.0ml/min氮气为载气进行胡椒醛、胡椒环、邻位胡椒醛和硝基胡椒醛的检测，确定升温程序和检测器的温度，其中固定相为硝基对苯二酸改性的聚乙二醇，分流比为10:1，进样量为1.0μl。
37.检测方法为取系统适用性溶液进样1针，主峰与各杂质峰之间分离度不小于1.5。取供试品溶液进样1针，同时采用溶剂进样进行分析作为空白对照，按峰面积归一化法计算杂质含量。
38.(1)升温程序的确定
39.将同一批次配制的供试品溶液分为5组，采用分流进样进行检测，其中进样口温度为210℃，检测器fid的温度为210℃，具体升温程序如表1。
40.表1 5组升温程序
[0041][0042][0043]
结果如图1-5所示，采用1-1组中的升温程序进行系统适应溶液中各物质的检测时，胡椒醛和邻位胡椒醛的分离度最小，为3.98，分离度良好，但是主峰出峰较晚，采集时间较长(图1)；将色谱柱初始温度由80℃提高至100℃再进行检测时(1-2组)，胡椒醛和邻位胡椒醛分离度为3.96，分离度良好，但是主峰出峰时间略有提前，采集时间仍较长(图2)；再次提高色谱柱初始温度，并提高升温速率进行检测时(1-3组)，胡椒醛和邻位胡椒醛分离度为3.63，分离度良好，采集时间较为合适但是主峰出峰仍较晚(图3)。在1-3组的升温程序的基础上，将温度分为3个阶段并改变升温速率再次进行检测(1-4组)，结果显示胡椒醛和邻位胡椒醛分离度为3.54，分离度良好，主峰出峰和采集时间均较为合适(图4)。在1-4组的基础上进一步优化色谱柱升温程序进行检测(1-5组)，结果显示升温程序进行优化后，胡椒醛和邻位胡椒醛分离度为3.57，分离度良好，主峰出峰和采集时间较合适，柱温最高温度为240℃，有利于沸点高杂质的检出，且该色谱条件方法的分析时间更短。
[0044]
(2)1-5组检测准确度的测试
[0045]
以(1)中1-5组的升温程序进行方法准确度的考察，检测80％加标溶液、100％加标溶液和120％加标溶液的回收率，确定方法的可行性，结果如表2：
[0046]
表2 1-5组条件下的准确度检测结果
[0047][0048][0049]
结果显示，在9份加标溶液中各杂质的回收率rsd均小于2.0％，平行性良好，胡椒环回收率在106％-110％范围内，邻位胡椒醛回收率在111％-117％范围内，硝基胡椒醛回收率在107％-114％范围内，回收率略偏高。
[0050]
(3)进样口和检测器温度的确定
[0051]
由于1-5组采用的升温程序进行色谱时得到的检测结果最好，因此在该色谱条件上进行进一步优化。由于在1-5组中柱温最高为240℃，而进样口和检测器的温度为210℃，进样口温度较低不利于样品气化，且检测器温度低于柱温可能导致样品在检测器中冷凝，影响检测器寿命，因此将进样口温度提高至240℃，检测器温度提高至250℃，再次考察方法的准确度，结果如表3所示：
[0052]
表3准确度检测结果
[0053][0054]
由表3表明，在该色谱条件下，9份加标溶液中各杂质回收率rsd均不大于2.0％，平行性良好胡椒环回收率在101％-106％范围内，邻位胡椒醛回收率在109％～115％范围内，硝基胡椒醛回收率在108％-114％范围内。准确度结果和1-5的结果基本一致，说明本品胡椒醛杂质检出回收率略高。
[0055]
在该条件下，与1-5组结果一致，各杂质回收率均略高，可能导致样品检测结果偏高，考虑到杂质回收率偏高对本品杂质控制更为严格，产品中杂质实际值小于检测值；从患者获益角度，对患者的安全风险影响更小。因此将升温程序为120℃、8℃/min；160℃、5℃/min；240℃、end；进样口温度为240℃、检测器温度为250℃初步确定为胡椒醛有关物质分析方法色谱条件。
[0056]
实施例2专属性实验
[0057]
以实施例1(3)中确定的色谱条件，将空白溶液、胡椒环定位溶液、邻位胡椒醛定位溶液、硝基胡椒醛定位溶液、分离度溶液分别进行色谱，统计峰与峰之间的分离度，进行专属性实验，结果见表4，其中各溶液的配制方法如下：
[0058]
胡椒环定位溶液：取胡椒环10.0002g，置10ml量瓶中，加无水乙醇溶解并定容，即得；
[0059]
邻位胡椒醛定位溶液：取邻位胡椒醛10.0mg，置10ml量中，加无水乙醇溶解并定容，即得；
[0060]
硝基胡椒醛定位溶液：取硝基胡椒醛10.0mg，置10ml量中，加无水乙醇溶解并定容，即得；
[0061]
分离度溶液：取胡椒醛供试品150mg，加入上述杂质定位溶液各1.5ml溶解混匀即得。
[0062]
表4专属性实验结果
[0063]
组分名称定位溶液中rt(min)分离度溶液中rt(min)分离度溶液中分离度胡椒环3.113.11/邻位胡椒醛10.7610.7767.70硝基胡椒醛14.8314.846.64胡椒醛/11.373.54
[0064]
结果表明：空白溶液对主峰及杂质无干扰，分离度溶液中主峰与各杂质峰之间分离度最小为3.54，大于1.5，符合要求。
[0065]
实施例3系统适用性实验
[0066]
分别取实施例2中的胡椒环定位溶液、邻位胡椒醛定位溶液以及硝基胡椒醛定位溶液各1.0ml于10ml容量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得到对照溶液，然后分别取各对照溶液进样6针，以实施例1(3)中确定的色谱条件检测各杂质峰面积rsd，结果如表5：
[0067]
表5系统适用性实验结果
[0068][0069]
结果显示，各杂质峰面积rsd最大为2.3％，小于3.0％，符合要求。
[0070]
实施例4定量限实验
[0071]
分别取实施例2中的分离度溶液、胡椒环定位溶液、邻位胡椒醛定位溶液以及硝基胡椒醛定位溶液，并用无水乙醇稀释至各自主峰的s/n值不小于10，得到定量限溶液，然后分别取各定量限溶液进样6针，以实施例1(3)中确定的色谱条件对胡椒醛、胡椒环、邻位胡椒醛、硝基胡椒醛的定量限浓度进行检测，结果见表6-9：
[0072]
表6胡椒醛定量限检测结果
[0073][0074]
表7胡椒环定量限检测结果
[0075][0076][0077]
表8邻位胡椒醛定量限检测结果
[0078][0079]
表9硝基胡椒醛定量限检测结果
[0080][0081]
结果显示，定量限溶液进样6针，目标峰的信噪比大于10，6份定量限溶液峰面积rsd均小于10.0％，符合要求。胡椒醛定量限浓度为29.820μg/ml，相当于样品度的0.030％(表6)；胡椒环定量限浓度为30.270μg/ml，相当于样品浓度的0.030％(表7)；邻位胡椒醛定量限浓度为29.100μg/ml，相当于样品浓度的0.029％(表8)；硝基胡椒醛定量限浓度为31.110μg/ml，相当于样品浓度的0.031％(表9)。
[0082]
实施例5检测限验证
[0083]
分别取实施例2中的分离度溶液、胡椒环定位溶液、邻位胡椒醛定位溶液以及硝基
胡椒醛定位溶液，并用无水乙醇稀释至各自主峰的s/n值不小于3，摇匀，得到检测限溶液，然后分别取各检测限溶液进样3针，以实施例1(3)中确定的色谱条件检测胡椒醛有关物质的检测限浓度，结果如表10-13：
[0084]
表10胡椒醛检测限结果
[0085][0086]
表11胡椒环检测限结果
[0087][0088]
表12邻位胡椒醛检测限结果
[0089][0090]
表13硝基胡椒醛检测限结果
[0091][0092]
结果表明：检测限溶液进样3针，目标峰的信噪比均大于3，符合要求。胡椒醛检测限浓度为14.910μg/ml，相当于样品浓度的0.015％；胡椒环检测限浓度为15.135μg/ml，相当于样品浓度的0.015％；邻位胡椒醛检测限浓度为14.550μg/ml，相当于样品浓度的0.015％；硝基胡椒醛检测限浓度为15.555μg/ml，相当于样品浓度的0.016％。
[0093]
实施例6耐用性实验
[0094]
以实施例1(3)中确定的色谱条件，取系统适用性溶液进样1针，检测主峰与各杂质峰的分离度，并取供试品溶液进样1针，按峰面积归一化法计算总杂及杂质含量，结果见表15。其中，耐用性考察参数变化范围见表14。
[0095]
表14耐用性考察参数变化范围
[0096]
项目变化范围氮气流速
±
0.5ml/min初始柱温
±
5℃进样口温度
±
5℃检测器温度
±
5℃
[0097]
表15耐用性实验结果
[0098]
[0099][0100]
结果显示：当色谱条件中的氮气流速、进样口温度以及检测器温度发生变化时，系统适用性溶液中主峰与杂质峰之间分离度在3.50-3.60之间；其中分离度最小为3.50，为检测器温度为255℃时的检测结果；上述结果中的分离度均大于1.5，符合要求。各杂质含量极差最大为0.01％，具体为胡椒环的含量极差，该极差小于0.05％，符合要求。总杂质的rsd为0，小于4.0％，也符合要求。综上所述，当氮气流速在8.0ml/min
±
0.5ml/min范围内变化时、初始柱温在120℃
±
5℃范围内变化时、进样口温度在240℃
±
5℃范围内变化时、检测器温度在250℃
±
5℃范围内变化时，对胡椒醛、胡椒环、邻位胡椒醛、硝基胡椒醛等含量的测定影响较小，耐用性佳。

技术特征：
1.一种胡椒醛有关物质的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将胡椒醛供试品溶解于无水乙醇中，得到供试品溶液；（2）根据已知的各杂质种类，配制杂质储备液，并配制系统适用性溶液；（3）采用毛细管柱-气相色谱法对供试品溶液、系统适用性溶液进行分离检测，计算杂质含量。2.根据权利要求1所述的一种胡椒醛有关物质的检测方法，其特征在于：步骤（1）所述的供试品溶液的浓度为0.5-1.0mol/l。3.根据权利要求1所述的一种胡椒醛有关物质的检测方法，其特征在于：步骤（2）所述杂质储备液的配制方法为取各杂质样品各10mg混合，用无水乙醇溶解并定容至10ml；系统适用性溶液的配制方法为取胡椒醛供试品150mg，加入杂质储备液1.5ml溶解混匀即得。4.根据权利要求1所述的一种胡椒醛有关物质的检测方法，其特征在于：步骤（3）所述毛细管柱-气相色谱法的色谱条件为：色谱柱为db-ffap（30m
×
0.53mm
×
1.0μm）；梯度升温；进样分流比为10:1，进样口温度240℃；检测器温度为250℃，进样体积1μl。5.根据权利要求4所述的一种胡椒醛有关物质的检测方法，其特征在于：所述梯度升温的升温程序为120℃、8℃/min，160℃、5℃/min，240℃、end。6.根据权利要求1所述的一种胡椒醛有关物质的检测方法，其特征在于：步骤（3）所述的计算方法为峰面积归一化法。7.根据权利要求1或3所述的一种胡椒醛有关物质的检测方法，其特征在于：所述杂质包括胡椒环、邻位胡椒醛、硝基胡椒醛中的一种或多种。

技术总结
本发明提供了一种胡椒醛有关物质的检测方法，具体为采用毛细管柱-气相色谱法，并采用梯度升温对胡椒醛有关物质进行检测，所述毛细管柱-气相色谱法色谱条件为色谱柱为DB-FFAP（30m


技术研发人员：杜胜 赵园媛
受保护的技术使用者：宜昌天仁药业有限责任公司
技术研发日：2023.03.30
技术公布日：2023/9/23