一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的荧光探针及其制备方法与应用

1.本发明属于药物筛选及生物检测领域，具体涉及一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的荧光探针及其制备方法与应用。


背景技术：

2.乙酰胆碱酯酶(ache)是α/β水解酶超家族酶类的一种，该酶是生物神经传导中的一种关键性酶。乙酰胆碱酯酶能够把乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。近年来的研究证明，乙酰胆碱酯酶的活性与阿尔兹海默症，hirschsprung症，神经元细胞的发育与成熟以及心脑血管类疾病等有着密切关系，以乙酰胆碱酯酶为药物靶点开发新型药物是十分有必要的。
3.自古以来，中药就被用于治疗多种疾病和改善人类健康，药用植物在降低乙酰胆碱酯酶活性，治疗与乙酰胆碱酯酶失调相关的神经性系统疾病方面显示出巨大的潜力。而且相比较于传统药物，具有适宜长期服用，毒副作用小，且作用面广的优点。因此从天然药物中筛选合适的乙酰胆碱酯酶抑制剂是一项有前景的工作。
4.荧光探针是一种分子传感器，其与待测物质特异性结合后做出相应变化，选择性的将化学信息转化为仪器可以测量的光学信号，从而达到检测化合物的目的。该方法与传统的方法比较，具有操作简单方便，合成成本低，选择性高，灵敏度高，生物相容性好等优点，广泛应用于医学，环境科学，生命科学等方面。近些年来，大量的用于乙酰胆碱酯酶检测的荧光探针被开发。然而，许多荧光探针存在着水溶性差，灵敏度低，发射波长短等原因，未进行乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选。因此，开发一种新型荧光探针，用于筛选中药中乙酰胆碱酯酶的天然抑制剂是十分有必要的。


技术实现要素：

5.本发明的主要内容是：提供一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的荧光探针及其制备方法与应用。该类探针合成方便，水溶性好，灵敏度高而且具有合适的发射波长，在中药中乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选方面具有良好的应用前景。
6.为了达到以上目的，本发明的技术方案如下所述：
7.在本发明的第一方面，提供了一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的荧光探针，所述荧光探针是式i所示结构的化合物：
[0008][0009]
在本发明的第二方面，提供一种所述荧光探针的制备方法，制备方法概述如下：
[0010]
(1)将6-羟基-1-四酮，4-(二乙氨基)水杨醛与高氯酸溶于冰醋酸中，回流反应，反应完毕，冷却至室温，加入乙酸乙酯与石油醚的混合溶液，沉淀过滤，得到10-(二乙氨基)[c]-3-羟基-5，6-苯并二氢杂蒽；
[0011]
(2)在乙腈中加入10-(二乙氨基)[c]-3-羟基-5，6-苯并二氢杂蒽与无水碳酸钾，氮气保护下回流反应，反应完毕，冰水冷却，加入二甲氨基甲酰氯，继续回流反应，反应结束后，除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到10-(二乙氨基)[c]-3-((二甲氨基甲酰)氧基)-5，6-苯并二氢杂蒽，即荧光探针。
[0012]
本发明中，以摩尔比计，6-羟四基-1-酮：4-(二乙氨基)水杨醛＝1：1。
[0013]
乙酸乙酯与石油醚的混合溶液中，以体积比计，乙酸乙酯：石油醚＝1：1。
[0014]
以摩尔比计，10-(二乙氨基)[c]-3-羟基-5，6-苯并二氢杂蒽：无水碳酸钾：二甲氨基甲酰氯＝1：1.5：1.5。
[0015]
硅胶柱色谱纯化时，采用甲醇与二氯甲烷的混合溶液为洗脱剂，以体积比计，甲醇：二氯甲烷＝1：1。
[0016]
与现有荧光探针相比，本发明具有如下优势：
[0017]
1、本发明的荧光探针具有较好的水溶性，良好的化学、光稳定性，高灵敏度，并且激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体副作用较小。
[0018]
2、本发明荧光探针发射光谱在近红外区，可以有效规避中药化学成分中的荧光干扰，提高检测的灵敏度，在中药有效物质筛选方面具有独特优势。
附图说明
[0019]
图1为实施例1制备的荧光探针的核磁氢谱图。
[0020]
图2为实施例1制备的荧光探针的质谱图。
[0021]
图3为荧光探针与ache作用的荧光发射图。
[0022]
图4为荧光探针与ache及其他活性物质作用的荧光柱状图，其中，1.探针、2.半胱氨酸、3.谷氨酸、4.钠离子、5.锰离子、6.铜离子、7.钾离子、8.铁离子、9.铝离子、10.丙氨酸、11.天冬氨酸、12.羟脯氨酸、13.蛋氨酸、14.苯丙氨酸、15.脯氨酸、16.苏氨酸、17.丁酰胆碱酯酶、18.乙酰胆碱酯酶。
[0023]
图5为荧光探针筛选中药钩藤中不同萃取部位的乙酰胆碱酯酶抑制活性的荧光柱状图。
[0024]
图6为荧光探针筛选中药钩藤中正丁醇萃取部位不同馏分的乙酰胆碱酯酶抑制活
性的荧光柱状图。
[0025]
图7为荧光探针筛选中药钩藤中不同单体的乙酰胆碱酯酶抑制活性的荧光柱状图。
[0026]
图8为本发明所述荧光探针化学结构。
具体实施方式：
[0027]
实施例1
[0028]
荧光探针的合成与表征
[0029]
(1)6-羟基-1-四酮(1.93g，10mmol)，4-(二乙氨基)水杨醛(1.62g，10mmol)与3.0ml的高氯酸溶于20.0ml的冰醋酸，置于50ml圆底烧瓶中，氮气保护下回流反应1.5h。冷却至室温，加入乙酸乙酯(15ml)与石油醚(15ml)的混合溶液，沉淀过滤，即得到10-(二乙氨基)[c]-3-羟基-5，6-苯并二氢杂蒽，产率80％。
[0030]
(2)在50ml两口烧瓶中加入20ml乙腈，然后加入10-(二乙氨基)[c]-3-羟基-5，6-苯并二氢杂蒽(320mg，1mmol)和无水碳酸钾(207mg，1.5mmol)，氮气保护下回流反应0.5h，冰水冷却，滴加二甲氨基甲酰氯(600μl，1.5mmol)，继续回流反应3h。反应结束后，除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化(采用甲醇与二氯甲烷的混合溶液为洗脱剂，以体积比计，甲醇：二氯甲烷＝1:1)，得到褐色固体10-(二乙氨基)[c]-3-((二甲氨基甲酰)氧基)-5，6-苯并二氢杂蒽，产率为30％。
[0031]
实施例2
[0032]
配制ph＝7.4、浓度为10mm的tris缓冲溶液，并用dmso配置10mm的荧光探针溶液，配制500u/ml的ache的tris缓冲溶液。取939μl tris缓冲溶液，加入不同梯度体积的ache的tris缓冲溶液(500u/ml)及最终浓度为10μm荧光探针的dmso溶液，混合溶液置于2ml ep管中；37℃振摇7h，反应之后的溶液加入到荧光比色皿中，在荧光光谱仪上检测，随着ache含量的增加，荧光强度逐渐增强。见图3。
[0033]
实施例3
[0034]
配制ph＝7.4、浓度为10mm的tris缓冲溶液，并用dmso配置10mm的荧光探针溶液，加入最终稀释浓度为10μm荧光探针的dmso溶液，以及最终浓度为50μm各种分析物:cys,glu,ala,asp,hyd,met,thr,phe,pro,bche,nacl,mncl2,feso4,cuso4·
5h2o,kcl，alcl3和50u/ml的bche、30u/ml的ache。分别置于ep管中，37℃振摇7h，反应之后的溶液加入到荧光比色皿中，在荧光光谱仪上检测，ache使得615nm处荧光强度明显增加，bche使得荧光强度略有增加，其他分析物基本没有引起荧光强度的变化，见图4。
[0035]
实施例4
[0036]
将钩藤药材粉碎，取10kg，分三次加入10倍量乙醇-水(v/v＝7/3)混合溶液浸泡，于室温下浸泡15天，重复三次。将浸泡后所得的钩藤提取液减压浓缩至无醇味，获得总浸膏。
[0037]
取钩藤总浸膏适量，加水超声使溶解，得浸膏水溶液。采用正己烷、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇分别与浸膏水溶液在体积比为1：1比例下置于分液漏斗中萃取，各静置一段时间后取有机相旋蒸，回收溶剂，得到4个不同极性萃取部位。
[0038]
配制ph＝7.4、浓度为10mm的tris缓冲溶液，并用dmso配置10mm的荧光探针溶液，
配制500u/mlache的tris缓冲溶液。
[0039]
(a)ep管中加入荧光探针(终浓度为10μm，下同)和10μl无水乙醇，再加入989μltris缓冲溶液(ph＝7.4，浓度为10mm，下同)，作为空白对照，反应体系为1ml(下同)；
[0040]
(b)ep管中加入荧光探针、ache(终浓度为30u/mol，下同)和10μl无水乙醇，再加入929μltris缓冲溶液；
[0041]
(c)取5mg钩藤总浸膏于ep管中，加入500μl无水乙醇和500μl tris缓冲溶液，超声使溶解。取10μl上述溶液于另一ep管中，加入荧光探针、ache和5μl无水乙醇，再加入924μltris缓冲溶液；
[0042]
(d-f)分别取5mg正己烷、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取部位于三个ep管中，各加入1000μl无水乙醇，超声使溶解。取上述三种溶液各10μl于三个新的ep管中，均加入荧光探针、ache和929μltris缓冲溶液，分别记为d、e、f；
[0043]
(g)取5mg浸膏水溶液于ep管中，加入1000μltris缓冲溶液，超声使溶解。取10μl上述溶液于另一ep管中，加入荧光探针、ache和10μl无水乙醇，再加入919μl tris缓冲溶液。
[0044]
将上述配制好的样品置于温度为37℃的恒温孵育箱上孵育7个小时，使用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度。正丁醇部位荧光强度明显降低，抑制活性最好，见图5。
[0045]
实施例5
[0046]
正丁醇部位浸膏(实施例4中萃取所得的正丁醇部位溶液蒸干溶剂所得)经过大孔吸附树脂分离，回收溶剂，分别得到7-3、5-5、3-7、1-9(水-乙醇)四个组分。分别用乙醇稀释为最终浓度为5mg/ml的待测溶液。配制ph＝7.4、浓度为10mm的tris缓冲溶液，并用dmso配置10mm的荧光探针溶液，配制500u/mlache的tris缓冲溶液。
[0047]
(a)ep管中加入荧光探针(终浓度为10μm，下同)和10μl无水乙醇，再加入989μltris缓冲溶液(ph＝7.4，浓度为10mm，下同)，作为空白对照，反应体系为1ml(下同)；
[0048]
(b)ep管中加入荧光探针、ache(终浓度为30u/mol，下同)和10μl无水乙醇，再加入929μltris缓冲溶液，做模型对照组；
[0049]
(c-f)分别取不同组分待测溶液10μl于ep管中，分别加入荧光探针、ache，再加入924μl tris缓冲溶液。
[0050]
将上述配制好的样品置于温度为37℃振摇7个小时，使用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度。7-3组分荧光强度降低明显，抑制活性最好，见图6。
[0051]
实施例6
[0052]
对7-3组分化学成分进行液质分析鉴定，共解析出毛钩藤碱，去氢毛钩藤碱，异钩藤碱，钩藤碱，柯诺辛碱，去氢钩藤碱，柯诺辛碱b，缝籽嗪甲醚等八个主要成分。将八个单体用乙醇溶解，分别配置成10mm的待测溶液。配制ph＝7.4、浓度为10mm的tris缓冲溶液，并用dmso配置10mm的荧光探针溶液，配制500u/mlache的tris缓冲溶液。
[0053]
(a)ep管中加入荧光探针(终浓度为10μm，下同)和10μl无水乙醇，再加入989μltris缓冲溶液(ph＝7.4，浓度为10mm，下同)，作为空白对照，反应体系为1ml(下同)；
[0054]
(b)ep管中加入荧光探针、ache(终浓度为30u/mol，下同)和10μl无水乙醇，再加入929μltris缓冲溶液做模型对照组；
[0055]
(c)ep管中加入荧光探针和10μl无水乙醇，再加入多哌奈齐tris缓冲溶液10μl(终浓度为100μm)，最后加入919μltris缓冲溶液，做阳性药对照组
[0056]
(d-k)分别取不同单体(按上述顺序)待测溶液10μl于ep管中，分别加入荧光探针、ache，再加入929μltris缓冲溶液。
[0057]
将上述配制好的样品置于温度为37℃振摇7个小时，使用荧光分光光度计测定各溶液的荧光强度。相比于其他单体，柯诺辛碱b抑制活性最好。见图7。

技术特征：
1.一种乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针，其特征在于，所述荧光探针是式i所示结构的化合物：2.权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针的制备方法，其特征在于，其具体步骤为：(1)将6-羟基-1-四酮，4-(二乙氨基)水杨醛与高氯酸溶于冰醋酸中，回流反应，反应完毕，冷却至室温，加入乙酸乙酯与石油醚的混合溶，沉淀过滤，得到10-(二乙氨基)[c]-3-羟基-5，6-苯并二氢杂蒽；(2)在乙腈中加入10-(二乙氨基)[c]-3-羟基-5，6-苯并二氢杂蒽与无水碳酸钾，氮气保护下回流反应，反应完毕，冰水冷却，加入二甲氨基甲酰氯，继续回流反应，反应结束后，除去溶剂并将粗产物进行硅胶柱色谱纯化，得到10-(二乙氨基)[c]-3-((二甲氨基甲酰)氧基)-5，6-苯并二氢杂蒽。3.根据权利要求2所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针的制备方法，其特征在于，以摩尔比计，6-羟基-1-四酮：4-(二乙氨基)水杨醛＝1:1。4.根据权利要求2所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针的制备方法，其特征在于，以摩尔比计，高氯酸：6-羟基-1-四酮＝3：1。5.根据权利要求2所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针的制备方法，其特征在于，以摩尔比计，冰醋酸：6-羟基-1-四酮＝30：1。6.根据权利要求2所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针的制备方法，其特征在于，以体积比计，乙酸乙酯：石油醚＝1：1。7.根据权利要求2所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针的制备方法，其特征在于，以摩尔比计，10-(二乙氨基)[c]-3-羟基-5，6-苯并二氢杂蒽：无水碳酸钾：二甲氨基甲酰氯＝1：1.5：1.5。8.根据权利要求2所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针的制备方法，其特征在于，硅胶柱色谱纯化时，采用甲醇与二氯甲烷的混合溶液为洗脱剂，以体积比计，甲醇：二氯甲烷＝1:1。9.权利要求1所述的乙酰胆碱酯酶抑制剂检测荧光探针在筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂中的应用。

技术总结
本发明属于药物筛选及生物检测领域，具体涉及一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的荧光探针及其制备方法与应用。本发明所述荧光探针是式I所示结构的化合物，具有较好的水溶性，良好的化学、光稳定性，高灵敏度，并且激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体副作用较小，其发射光谱在近红外区，可以有效规避中药化学成分中的荧光干扰，提高检测的灵敏度，在中药有效物质筛选方面具有独特优势且操作简单方便，合成成本低，在中药中乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选方面具有良好的应用前景。应用前景。应用前景。


技术研发人员：唐志新 闫志 王小明 田振华
受保护的技术使用者：山东中医药大学
技术研发日：2023.03.21
技术公布日：2023/9/23