一种仿生味觉传感器及其应用的制作方法

1.本发明涉及电化学传感器技术领域，具体涉及一种基于味觉受体的仿生味觉传感器及其应用。


背景技术：

2.作为自然化学感知之一，味觉知觉与人类的生活密切相关，因为它在营养识别、摄取以及避免有害和难以消化的物质方面起着重要作用。传统的味觉评估和检测方法可以分为两类：感官分析和化学分析。虽然人类感官评估可以直接获取味觉信息，但很难建立有效的评估准则来量化甜味。基于仪器测试的化学分析(如hplc、gc/lc-ms)虽然具有高分辨能力，高灵敏度的特点，但是受操作复杂和耗时程序的限制。此外，基于电化学技术和化学敏感材料(如聚合物、脂质膜等)的电子舌已被广泛发展，电子舌是一种利用多传感阵列为基础，感知样品的整体特征响应信号，对样品进行模拟识别和定量定性分析的一种检测技术，具有低成本和快速测量的优势。然而，电子舌的特异性和灵敏性尚未达到人类味觉感知的水平。因此，研究人员越来越关注基于高选择性生物活性材料的电化学味觉生物传感器，以提高电子舌的性能。
3.目前，一些使用味觉组织、味觉细胞和味觉受体的味觉生物传感器被广泛设计来模拟人类感官知觉。其中，基于味觉组织和细胞的生物传感器可以简单准确地区分和检测味觉物质，但受个体差异和寿命短的限制；基于味觉受体的生物传感器具有简单的结构和组成，已成为最有潜力的选择，例如，文献报道使用源自t1r1的鲜味配体结合结构域vft，将其固定在石墨烯基fet上制得鲜味生物电子舌，能够以高灵敏度检测l-谷氨酸单钠约1nm(high-performance bioelectronic tongue using ligand bindingdomain t1r1 vft for umami taste detection.biosensors and bioelectronics,2018.117:628-636)。
4.提高灵敏度对于增强味觉生物传感器的检测性能至关重要。一般来说，味觉生物传感器的灵敏度改进方法可以分为两类。第一种方法是通过各种纳米材料优化蛋白质的固定化，随着纳米技术的发展，越来越多的纳米材料被用于设计生物传感器。另一种方法是采用高灵敏的导体比如场效应晶体管(fet)器件进行有效的信号放大。例如，文献报道公开了一种带有浮动电极的t1r2 vft固定碳纳米管场效应晶体管被用作人造甜味感觉系统，可用于检测低至0.1fm的甜味剂溶液(ultrasensitivebioelectronic tongue based on the venus flytrap domain of a human sweettaste receptor.acs applied materials&interfaces,2022,14(2):2478-2487)。虽然应用场效应晶体管器件可显著提升检测灵敏度，但是其复杂的制作过程导致生产效率低、生产成本高，限制了fet放大的发展和实际应用。
5.因此，设计新的易操作、低成本的信号放大方法对于味觉生物传感器具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种制作简单、低成本的味觉生物传感器，利用味觉受体与配体或抗味觉受体抗体之间的特异性识别和竞争用于区分味觉物质，同时通过免疫放大原理提高检测灵敏度。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明提供了一种仿生味觉传感器，包括工作电极和与工作电极配套的抗体复合物，所述工作电极包括玻碳电极、修饰在玻碳电极表面的装载有金纳米颗粒的片层材料以及组装在片层材料上的味觉受体蛋白；所述抗体复合物为装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料与抗味觉受体的抗体复合而成。
9.本发明中仿生味觉传感器的工作原理：
10.在无味觉物质存在时，所述抗体复合物的抗体能够顺利识别味觉受体，导致出现较大的电化学阻抗(r
et
)；在存在味觉物质的情况下，味觉物质特异性识别味觉受体蛋白，且占据抗体的关键氨基酸残基位点，并同时触发味觉受体蛋白的局部构象变化和表面电荷重分布，阻碍了味觉受体和抗体之间的结合，导致r
et
减小。电化学阻抗变化值与味觉物质含量呈相关性，通过测定电化学阻抗变化值进而计算得出味觉物质的含量。
11.进一步的，所述工作电极的制备方法包括：将装载金纳米颗粒的片层材料重悬于壳聚糖水溶液中制得悬浊液，滴加在经抛光处理后的玻碳电极上，干燥后滴加味觉受体蛋白溶液，4℃条件下反应，然后滴加牛血清白蛋白溶液封闭，制得所述工作电极。
12.上述制备方法中，片层材料通过壳聚糖吸附在gce上，蛋白通过壳聚糖物理嵌入和au-s键组装在电极上。
13.进一步的，所述壳聚糖水溶液的质量百分比浓度为0.2％。
14.进一步的，所述片层材料包括但不限于碳化钛、镍磷硫、二硫化钼。
15.进一步的，味觉受体蛋白溶液的浓度为100μg/ml，滴加蛋白溶液后于4℃条件下反应数小时。
16.进一步的，所述装载有金纳米颗粒的片层材料为装载金纳米颗粒的碳化钛，其制备方法包括：在磁力搅拌下，将金纳米颗粒溶液加入ti3c2mxene水溶液中，反应制得所述装载金纳米颗粒的碳化钛。本发明研究表明在玻碳电极上修饰装载金纳米颗粒的碳化钛具有优良导电性。
17.进一步的，所述抗体复合物的制备方法包括：将抗味觉受体的抗体溶液加入到装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料悬浊液中孵育，离心洗涤后加入牛血清白蛋白溶液封闭，制得所述抗体复合物。
18.上述制备方法中，蛋白通过au-n键结合到纳米材料上。
19.进一步的，所述抗体为抗味觉受体抗原决定簇的抗体。所述抗体的作用位点针对味觉受体和味觉物质的结合位点，提高特异性识别的靶向性。
20.进一步的，所述金属有机框架材料可以为但不限于mil系列金属有机框架材料，具体为mil-101(fe)。
21.进一步的，所述装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料为装载金纳米粒子的mil-fe金属有机框架材料，其制备方法包括：将四氯金酸溶液加入到mil-fe金属有机框架材料悬浊液中，再加入还原剂反应，反应结束后离心收集沉淀，制得装载金纳米粒子的mil-fe金
属有机框架材料。
22.进一步的，所述还原剂可以为但不限于柠檬酸钠。
23.本发明中，所述味觉受体可以为但不限于人类味觉受体1型(t1rs)，人类味觉受体1型是一类能感知甜味和鲜味的受体家族，包括t1r1、t1r2、t1r3三个成员。根据具体的味觉物质选择相应的味觉受体修饰于工作电极上。
24.进一步的，所述味觉受体蛋白为氨基酸序列如seq id no.2所示的人类味觉受体1型成员2捕蝇草结构域蛋白；所述抗体为抗seq id no.1所示氨基酸序列中第150～450位点的抗体。上述修饰的仿生味觉传感器可以用于检测甜味物质。
25.进一步的，所述仿生味觉传感器由电化学三电极体系组成，包括工作电极、对电极和参比电极，对电极为铂丝电极，参比电极为银/氯化银电极。
26.本发明还提供了所述的仿生味觉传感器在检测味觉物质中的应用，所述应用包括：
27.(1)将待测样品稀释于磷酸盐缓冲液中得到待测液，滴加在工作电极表面工作区域，30-37℃孵育，洗涤；然后滴加抗体复合物溶液，30-37℃下免疫反应，洗涤后得到修饰工作电极；
28.(2)利用电化学工作站测试电化学阻抗谱，记录待测样品滴加前后的电化学阻抗，计算电化学阻抗变化值δr
et
＝r
0-r，其中r0为空白阻抗，r为测试阻抗，代入标准曲线中计算得出待测液中味觉物质的含量。
29.进一步的，步骤(1)中，滴加待测液后的孵育时间为10-20分钟。
30.进一步的，洗涤采用磷酸盐缓冲液。
31.进一步的，滴加抗体复合物溶液后反应时间为20-30分钟。
32.进一步的，当味觉物质为甜味物质时，所述标准曲线的绘制方法包括：首先称取蔗糖用水全部溶解后制成蔗糖母液；再将蔗糖母液与磷酸盐缓冲液混合，定容得到不同浓度的待测标准溶液；然后各取不同浓度的标准溶液滴加到工作电极表面工作区域，重复步骤(1)-(2)，记录不同浓度蔗糖的电化学阻抗变化值；最后绘制电化学阻抗变化值与浓度对数值之间的校准线性曲线。
33.进一步的，电化学阻抗谱测试的条件为频率范围为0.01hz至100khz，信号振幅为5mv。
34.进一步的，电化学测量的电解液为含有0.1m kcl的5mm[fe(cn)6]
3-/4-溶液。
[0035]
本发明具备的有益效果：
[0036]
(1)本发明提供了一种基于生物活性传感元素、免疫放大和纳米材料载体的新型仿生电化学味觉生物传感器。通过利用味觉受体与味觉物质或抗味觉受体抗体之间的特异性识别，设计的生物传感器能够有效区分味觉物质；同时在抗体上修饰装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料，通过免疫放大显著提升电化学响应性能，提高生物传感器的识别灵敏度。
[0037]
(2)本发明提供的仿生电化学味觉生物传感器制作简单、制造成本低，具有易操作、快速检测的优势，且检测灵敏度满足食品领域检测要求。
附图说明
[0038]
图1为本发明传感器的原理流程图。
[0039]
图2为传感器制备过程中用eis逐步表征图。
[0040]
图3为本发明在蔗糖存在时，传感器的电化学响应。
[0041]
图4为本发明在存在抗体复合物时具有免疫放大的电化学响应和不存在抗体复合物时的响应对比。
[0042]
图5为传感器电化学变化值和蔗糖浓度对数之间的线性校准曲线图。
[0043]
图6为传感器对商用苹果汁的检测响应图。
具体实施方式
[0044]
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。
[0045]
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0046]
下述实施例中haucl4、柠檬酸钠购买自国药；牛血清白蛋白购买自阿拉丁；ti3c
2 mxene购买自先丰纳米。
[0047]
实施例1
[0048]
以装载金纳米颗粒的碳化钛(ticau)为片层纳米材料，以mil-fe(au)为金属有机框架材料为例，设计生成的仿生味觉传感器，具体实施步骤如下：
[0049]
1、预测人类味觉受体1型成员2(t1r2)捕蝇草(vft)结构域蛋白的抗原决定簇位点
[0050]
人类t1r2 vft氨基酸序列如seq id no.1所示，利用隐形马可夫模型(hidden markov model，hmm)和倾向性评分方法的组合来预测线性b细胞表位的位置，得分超过阈值的残基被认为是抗原决定簇表位的一部分。
[0051]
预测结果显示抗原决定簇位点包括134-178、248-274和338-374，其中大部分和t1r2与糖类化合物结合位点重合。
[0052]
针对上述结果，委托生物公司针对t1r2 vft 150～450位的序列制备相应抗体。
[0053]
2、人类味觉受体1型成员2(ht1r2)捕蝇草(vft)结构域蛋白的制备
[0054]
从ht1r2中截取vft部分，氨基酸序列如seq id no.2所示，编码基因核苷酸序列如seq id no.3所示。合成t1r2-vft带有n-末端6
×
his标签的基因片段，克隆到pet28a载体中。质粒随后被转化到大肠杆菌bl21(de3)细胞中，并在含有卡那霉素的lb琼脂糖平板上进行筛选，转化后的细胞在含有卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中在37℃下培养。当光密度(od
600
)值达到0.5时，使用异丙基β-d-硫代半乳糖苷(1mm)在20℃下诱导t1r2 vft基因的表达，持续8小时。细胞培养后，通过离心(12000rpm，5分钟，4℃)收集。沉淀物转入裂解缓冲液中，然后以12000rpm、4℃下离心25分钟。不溶性部分包括t1r2 vft的包涵体蛋白(ibp)，被重新悬浮在ibp缓冲液中并通过超声处理使其断裂。接下来，溶解样品以30℃离心30分钟(12000rpm)收集，然后进行两次透析(1:8体积比)：先用分子量截止为10kda的透析膜对透析缓冲液i进行1.5小时的透析，然后进行过夜透析至透析缓冲液ii。透析后的样品经过0.45μm过滤器处理，并加载到预先平衡的his-trap亲和柱(5ml)中。柱子逐渐用洗涤缓冲液进行洗涤，最后使用洗脱缓冲液洗脱t1r2 vft，并在-80℃下储存以备后用。
[0055]
3、合成装载金纳米粒子的mil-fe金属有机框架材料(au@mil-101(fe))，与抗体的修饰
[0056]
3.1mil-101(fe)的制备
[0057]
首先，fecl3·
6h2o(1.62g)和对苯二甲酸(h2bdc,0.824g)在60毫升n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中均匀溶解，持续搅拌。其次，将得到的混合物倒入100毫升的teflon不锈钢容器中，密封，然后在烘箱中加热至110℃。反应20小时后，使混合物冷却至室温，并以1000转每分钟的速度离心10分钟。通过用dmf和乙醇依次洗涤两次去除mil-101(fe)中的过剩反应物和杂质。最后，在60℃下过夜干燥后，得到纯净的mil-101(fe)。
[0058]
3.2au@mil-101(fe)的制备
[0059]
首先，将mil-101(fe)用超声波处理30分钟，得到均匀悬浊液(浓度为1mg/ml)。将250μl haucl4溶液(浓度为40mm)加入10mlmil-101(fe)溶液中。经过30分钟后，加入1ml柠檬酸钠溶液(浓度为40mm)，并继续搅拌2小时。将反应液以11200rpm的速度离心10分钟。之后，用去离子水洗涤并离心三次以去除未反应的物质。最后，将最终的沉淀转移至4ml去离子水中，得到au@mil-101(fe)。
[0060]
3.3au@mil-101(fe)-抗体复合物的制备
[0061]
将步骤1获得的500μl抗体(100μg/ml)加入上述au@mil-101(fe)溶液中，在室温下搅拌孵育1小时。然后加入50μl牛血清白蛋白(bsa 1％)以阻断非特异性吸附位点。离心后，au@mil-101(fe)-抗体复合物重新悬浮于1ml磷酸盐缓冲液中，并存储在4℃以备进一步使用。
[0062]
4、合成装载金纳米颗粒的碳化钛(ticau)
[0063]
4.1aunps是按照turkevich/frens的柠檬酸盐还原法制备的。在典型的合成过程中，取50ml 1mm的haucl4，在强烈搅拌下加热至沸腾。迅速向溶液的旋涡部位加入5ml 38.8mm的柠檬酸钠，溶液的颜色由淡黄变为赤红。继续煮沸10分钟，然后移除加热磁套，继续搅拌直到溶液冷却至室温。aunps形成后存储于4℃。
[0064]
4.2合成ticau
[0065]
将ti3c
2 mxene超声处理得到均匀的悬浮液(浓度为1mg/ml)。然后，在磁力搅拌下，缓慢地将2ml aunps溶液加入10ml ti3c
2 mxene水溶液中。反应持续3小时后，将混合物以8000rpm的速度离心10分钟。通过连续两次用水洗涤去除过量反应物。最后，纯的ti3c2mxene/aunps(ticau，浓度约为0.25mg/ml)转移到含有0.2％壳聚糖(cs)的3ml去离子水中，得到ticau悬浮液。
[0066]
5、电化学传感器工作电极制备
[0067]
用氧化铝抛光粉(粒径分别为1.0、0.3和0.05μm)抛光玻碳电极(gce)，用蒸馏水和乙醇超声处理，并用氮气干燥，以备后续使用。
[0068]
工作电极修饰：首先在清洁的gce上滴加6μl步骤4制备的ticau悬浮液。干燥后，滴加6μl步骤2制备的t1r2 vft蛋白溶液(100μg/ml)反应6小时，温度保持在4℃。然后，滴加6μl的bsa(1％)反应1小时。
[0069]
6、利用电化学工作站测试电化学阻抗谱(eis)
[0070]
电化学实验在25℃下使用中国的chenhua chi 660e仪器进行，采用三电极体系。电化学电极体系由步骤5制备的工作电极、对电极和参比电极组成，对电极为铂丝电极
(pt)，参比电极为银/氯化银(ag/agcl)电极。
[0071]
电化学阻抗谱(eis)的频率范围为0.01hz至100khz，信号振幅为5mv；电化学测量的电解液为含有0.1m kcl的5mm[fe(cn)6]
3-/4-溶液。
[0072]
6.1传感器制备(未经条件优化)过程中用eis逐步表征
[0073]
传感器工作电极的制备流程如图1所示。eis表征结果如图2所示，裸露的玻璃碳电极(gce)具有较小的电阻(曲线a)。通过壳聚糖吸附将ticau固定在gce表面后，观察到明显的电阻下降(曲线b)。当生物敏感材料t1r2 vft(曲线c)和阻塞剂bsa(曲线d)通过壳聚糖物理嵌入和au-s键的帮助依次组装到电极上时，电阻呈现出逐渐增加的趋势，这是由于非导电蛋白质阻碍了电子在电极界面的传递(曲线c-d)。随后，通过蔗糖的加入引起的t1r2 vft和配体分子之间的特异识别进一步导致了电阻的增加(曲线e)。最后，通过免疫识别将au@mil-101(fe)固定到电极表面时，电阻明显增加(曲线f)。这种增加是由于au@mil-101(fe)纳米复合材料的引入。一方面，au@mil-101(fe)会产生大的空间阻碍，不利于电化学指示剂[fe(cn)6]
3-/4-与电极的接近。另一方面，au@mil-101(fe)带有负电荷，与带负电荷的[fe(cn)6]
3-/4-发生排斥作用，导致总阻抗的增加。
[0074]
结果表明t1r2 vft和ab在电极表面发生了识别和结合，表明传感界面成功制备。
[0075]
6.2上述传感器组装完成之后，取100μl 10μm蔗糖溶液或磷酸缓冲液(空白对照)滴加到工作电极表面工作区域，在37℃孵育10分钟，孵育结束后使用三倍体积的pbst清洗电极。然后滴加6μl的步骤3制备的au@mil-101(fe)-抗体复合物，在37℃进行30分钟的夹心免疫反应，最后使用三倍体积的pbst清洗修饰电极。
[0076]
测试电化学阻抗，结果如图3所示，在无甜味物质存在时(空白对照)，抗体能够顺利识别工作电极上的t1r2 vft并与之结合；加入蔗糖之后，t1r2 vft/蔗糖复合物结构形成，t1r2 vft构象发生改变并阻碍了vft和抗体之间的结合，导致r
et
减小。
[0077]
6.3上述传感器组装完成之后，取100μl 1μm蔗糖溶液滴加到工作电极表面工作区域，在37℃孵育10分钟，孵育结束后使用三倍体积的pbst清洗电极。然后滴加6μl的步骤3制备的au@mil-101(fe)-抗体复合物，在37℃进行30分钟的夹心免疫反应，最后使用三倍体积的pbst清洗修饰电极。测试au@mil-101(fe)-抗体复合物修饰前后的电化学阻抗。
[0078]
如图4所示，当存在装载金纳米粒子的mil-fe金属有机框架材料-抗体复合物时，电化学响应增加了约3.03倍，凸显了通过免疫放大设计仿生传感器的优势。
[0079]
7、标准曲线的绘制
[0080]
配制标准溶液：称取蔗糖固体，用水将其全部溶解，制成蔗糖母液；将蔗糖母液与1
×
pbs缓冲溶液混合，定容得到不同浓度的待测标准溶液。
[0081]
各取100μl的上述浓度的标准溶液，滴加到工作电极表面工作区域，在37℃孵育10分钟，孵育结束后使用三倍体积的pbst清洗电极。然后滴加6μl的步骤3制备的au@mil-101(fe)-抗体复合物，在37℃进行30分钟的夹心免疫反应，最后使用三倍体积的pbst清洗修饰电极。
[0082]
利用电化学工作站测试电化学阻抗谱(eis)，电化学阻抗谱(eis)的频率范围为0.01hz至100khz，信号振幅为5mv；电化学测量的电解液为含有0.1m kcl的5mm[fe(cn)6]
3-/4-溶液。记录滴加不同浓度标准溶液时的电化学阻抗变化值δr
et
＝r
0-r，其中r为测试电阻，r0为空白电阻。
[0083]
如图5所示，电化学阻抗变化值δr
et
与对数浓度(-logc)之间存在线性关系，蔗糖浓度50pm-50μm，相关系数r2为0.99643。
[0084]
8、实际样品的测定
[0085]
为展示我们的生物传感器在真实样品中的适用性，本实验对商用果汁中的甜味物质进行了检测。
[0086]
本实验中使用的商用苹果汁含有多种天然甜味物质，如蔗糖、葡萄糖和果糖，总浓度约为100mg/ml。商用苹果汁通过1
×
pbs缓冲溶液进行了连续稀释(10-10-10-5
)。
[0087]
如图6所示，该设备从10-10
(v/v)的稀释浓度开始显示响应，并在约10-5
(v/v)处达到饱和状态。显示了传感器对稀释的苹果汁在复杂环境中的标准化剂量依赖响应。
[0088]
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

技术特征：
1.一种仿生味觉传感器，其特征在于，包括工作电极和与工作电极配套的抗体复合物，所述工作电极包括玻碳电极、修饰在玻碳电极表面的装载有金纳米颗粒的片层材料以及组装在片层材料上的味觉受体蛋白；所述抗体复合物为装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料与抗味觉受体的抗体复合而成。2.如权利要求1所述的仿生味觉传感器，其特征在于，所述工作电极的制备方法包括：将装载金纳米颗粒的片层材料重悬于壳聚糖水溶液中制得悬浊液，滴加在经抛光处理后的玻碳电极上，干燥后滴加味觉受体蛋白溶液，4℃条件下反应，然后滴加牛血清白蛋白溶液封闭，制得所述工作电极。3.如权利要求1或2所述的仿生味觉传感器，其特征在于，所述装载有金纳米颗粒的片层材料为装载金纳米颗粒的碳化钛，其制备方法包括：在磁力搅拌下，将金纳米颗粒溶液加入ti3c
2 mxene水溶液中，反应制得所述装载金纳米颗粒的碳化钛。4.如权利要求1所述的仿生味觉传感器，其特征在于，所述抗体复合物的制备方法包括：将抗味觉受体的抗体溶液加入到装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料悬浊液中孵育，离心洗涤后加入牛血清白蛋白溶液封闭，制得所述抗体复合物。5.如权利要求1或4所述的仿生味觉传感器，其特征在于，所述装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料为装载金纳米粒子的mil-fe金属有机框架材料，其制备方法包括：将四氯金酸溶液加入到mil-fe金属有机框架材料悬浊液中，再加入还原剂反应，反应结束后离心收集沉淀，制得装载金纳米粒子的mil-fe金属有机框架材料。6.如权利要求1所述的仿生味觉传感器，其特征在于，所述抗体为抗味觉受体抗原决定簇的抗体；所述味觉受体蛋白为氨基酸序列如seq id no.2所示的人类味觉受体1型成员2捕蝇草结构域蛋白；所述抗体为抗seq id no.1所示氨基酸序列中第150～450位点的抗体。7.如权利要求1-6任一项所述的仿生味觉传感器在检测味觉物质中的应用，其特征在于，所述应用包括：(1)将待测样品稀释于磷酸盐缓冲液中得到待测液，滴加在工作电极表面工作区域，30-37℃孵育，洗涤，然后滴加抗体复合物溶液，30-37℃下免疫反应，洗涤后得到修饰工作电极；(2)利用电化学工作站测试电化学阻抗谱，记录待测样品滴加前后的电化学阻抗，计算电化学阻抗变化值δr
et
＝r
0-r，其中r0为空白阻抗，r为测试阻抗，代入标准曲线中计算得出待测液中味觉物质的含量。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，当味觉物质为甜味物质时，所述标准曲线的绘制方法包括：首先称取蔗糖用水全部溶解后制成蔗糖母液；再将蔗糖母液与磷酸盐缓冲液混合，定容得到不同浓度的待测标准溶液；然后各取不同浓度的标准溶液滴加到工作电极表面工作区域，重复步骤(1)-(2)，记录不同浓度蔗糖的电化学阻抗变化值；最后绘制电化学阻抗变化值与浓度对数值之间的校准线性曲线。9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，电化学阻抗谱测试的条件为频率范围为0.01hz至100khz，信号振幅为5mv。10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，电化学测量的电解液为含有0.1m kcl的5mm[fe(cn)6]
3-/4-溶液。

技术总结
本发明公开了一种基于味觉受体的仿生味觉传感器及其应用，属于电化学传感器技术领域。所述仿生味觉传感器，包括工作电极和与工作电极配套的抗体复合物，所述工作电极包括玻碳电极、修饰在玻碳电极表面的装载有金纳米颗粒的片层材料以及组装在片层材料上的味觉受体蛋白；所述抗体复合物为装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料与抗味觉受体的抗体复合而成。本发明通过利用味觉受体与味觉物质或抗味觉受体抗体之间的特异性识别，能够有效区分味觉物质；在抗体上修饰装载有金纳米颗粒的金属有机框架材料，通过免疫放大显著提升电化学响应性能，提高生物传感器的检测灵敏度。提高生物传感器的检测灵敏度。提高生物传感器的检测灵敏度。


技术研发人员：张迪鸣 叶景 范敏之 张小玉
受保护的技术使用者：之江实验室
技术研发日：2023.07.20
技术公布日：2023/10/15