一种红三叶多糖的酶提取方法

1.本发明涉及天然产物分离提取领域，特别是涉及一种红三叶多糖的酶提取方法。


背景技术：

2.红三叶(trifolium pratense l.)粗蛋白含量高，中性洗涤纤维含量低，富含异黄酮和多糖等生物活性物质，且具有固氮功能，对生态环境治理与恢复也具有重要作用，是世界温带气候地区重要的多年生豆科牧草和药用植物。
3.植物多糖又称植物多聚糖，它是一类由醛糖或酮糖经糖苷键连接而成的天然高分子聚合物，是植物内重要的大分子物质，不仅是植物细胞的结构物质，也是细胞能量的主要来源。多糖具有一定的生物相容性、生物降解性和稳定性，被广泛应用于保健食品和医药行业，具有抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、降血糖和免疫调节等多种生物学活性。在皮肤创伤、软骨和关节炎的治疗中发挥重要作用，易于加工和改性，在组织工程等领域具有良好的开发应用前景。
4.酶提取技术在天然植物多糖的发展利用中应用广泛，提取条件温和保证了多糖的活性。蛋白酶、纤维素酶、果胶酶是酶提取技术中常用的酶，可以提高多糖得率和抗氧化活性。酶提取主要是利用酶反应的专一性来提高提取效果，可以有选择性地降解植物的细胞壁和细胞膜，减少溶剂提取时来自细胞壁、细胞膜阻力，使有效成分得到释放，酶的使用也可将部分多糖降解为更小分子量的片段，从而更有利于多糖从细胞内分离出来。目前，红三叶多糖的提取方法有超声和热水提取法，超声提取制备的红三叶多糖具有良好的抗氧化性能，zhang等采用响应面法优化了热水提取法，也发现红三叶多糖具有良好的降血糖活性和抗氧化性能，但有关红三叶多糖的酶提取工艺以及三者提取效果的比较未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种红三叶多糖的酶提取方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过对酶解时间、酶用量、酶解温度、酶比例4个影响因素的考察，优化得到红三叶多糖提取最佳工艺条件，为红三叶多糖提取制备提供了新的理论依据。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种红三叶多糖的酶提取方法，包括以下步骤：
8.将红三叶、水以及复合酶混合后进行酶解，制得红三叶粗多糖；所述红三叶粗多糖经醇沉、透析、冷冻干燥，制得红三叶多糖；
9.其中，所述红三叶与所述水的质量体积比为1g：(30-50)ml；所述复合酶的用量为所述红三叶总质量的0.6％-1.0％，所述复合酶是由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶混合而成。
10.优选的是，所述复合酶是由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按照质量比(2-15)：(1-4)：(1-4)混合而成。
11.优选的是，所述木瓜蛋白酶、所述纤维素酶和所述果胶酶的质量比7：2：2。
12.优选的是，所述酶解的温度为45-65℃，时间为30-100min。
13.优选的是，所述酶解的温度为60℃，时间为90min。
14.优选的是，所述复合酶的用量为所述红三叶总质量的1.0％。
15.优选的是，所述红三叶粗多糖用无水乙醇进行醇沉；所述透析是采用3500da的透析袋进行。
16.本发明还提供一种红三叶多糖，其是由所述的酶提取方法制得。
17.优选的是，所述红三叶多糖甘露糖、鼠李糖(rha)、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其中，所述葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖占所述红三叶多糖的3/4，且所述葡萄糖的摩尔百分比最高。
18.本发明还提供所述的红三叶多糖在清除dpph和超氧阴离子方面的应用。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.本发明通过研究酶解时间、酶用量、酶比例、酶解温度4个单因素对红三叶多糖提取的影响，在此基础上，采用正交试验对酶提取工艺条件进行优化并筛选出酶提取最佳工艺。红三叶多糖的最佳酶提取工艺条件为：酶解时间90min，酶用量1.0％，酶解温度60℃，酶比例为木瓜蛋白酶：纤维素酶：果胶酶7：2：2，红三叶粗多糖含量为8.85
±
0.05％，精制多糖含量为28.42
±
0.68％。抗氧化活性结果表明：酶、超声和热水提取制备的红三叶多糖均具有较高的抗氧化活性，对超氧阴离子自由基的清除活性高于阳性对照vc。多糖组成成分分析结果表明：酶、超声和热水提取方法制备的红三叶多糖组成成分相同，均由8种单糖组成，但单糖组成比例差异明显，其中葡萄糖glu、半乳糖gal和阿拉伯糖ara占比均高，三者约占到单糖组分的四分之三。但不同提取方法导致这三种单糖的比例有明显差异，酶提取多糖中glu摩尔百分比最高，是热水提取多糖的1.6倍。本发明提供的酶提取法与超声和热水提取相比，除乙醇外未使用任何有机试剂，本发明的方法步骤少、条件温和、成本较低、绿色安全，最宜于工艺生产应用，为红三叶多糖提取制备提供了新的理论依据。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为不同提取因素对多糖含量的影响；小写字母代表同一因素下不同水平的差异水平(p《0.05)；a-d分别为酶解时间、酶用量、酶解温度和酶比例对多糖含量的影响。
23.图2为不同提取方法制备的红三叶多糖；
24.图3为不同提取方法的多糖抗氧化活性；a：dpph自由基清除能力；b：超氧阴离子自由基清除能力；
25.图4为单糖组成分析hplc色谱图；a为混合标准品；b为酶提取多糖；c为超声提取多糖；d为热水提取多糖；1、2、3、4、5、6、7、8分别为man、rha、glua、gala、glu、gal、xyl、ara。
具体实施方式
26.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限
制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
27.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
28.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
29.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
30.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
31.实施例1
32.1、材料与方法
33.1.1试验材料
34.红三叶叶片采自兰州大学榆中校区智能温室种植的初花期植株，50℃烘干至恒重，粉碎过60目筛，备用。木瓜蛋白酶(800u/mg)、纤维素酶(50u/mg)和果胶酶(500u/mg)，购自上海源叶生物科技有限公司。
35.1.2试验方法
36.1.2.1单因素试验
37.取1.0g红三叶粉末，置于100ml锥形瓶中，用超纯水提取(加入30ml超纯水)，酶在40℃下水浴活化10min后加入，提取后将溶液温度迅速升至90℃下灭活10min，过滤并收集上清液。
38.分别考察酶解时间(30、60、80、90、100min)，酶用量(物料的0.6、0.7、0.8、0.9、1.0％)，酶解温度(45、50、55、60和65℃)，酶比例(木瓜蛋白酶：纤维素酶：果胶酶分别为2：1：1、3：1：1、7：2：2、15：4：4和4：1：1)对红三叶多糖提取的影响，筛选最优提取条件。
39.1.2.2正交试验
40.在单因素试验的基础上，选择a酶解时间、b酶用量、c酶解温度和d酶比例，按照正交设计表安排试验，因素水平如表1所示，每组试验重复3次。
41.表1正交试验因素水平表
42.43.1.2.3多糖含量的测定
44.多糖含量采用苯酚-硫酸法，具体方法参考“史文娟.罗布麻和红三叶中多糖与黄酮的抗氧化活性研究”，在490nm处测定吸光度值，计算多糖含量。
45.多糖含量(％)＝待测液多糖浓度
×
提取体积/红三叶样品质量
×
100％
46.以葡萄糖为标品，横坐标为浓度(mg
·
ml-1
)，纵坐标为吸光度值(a)，其标准曲线为y＝5.7364x+0.0465，r2＝0.9991。
47.1.2.4红三叶多糖的提取方法比较
48.1.2.4.1酶提取
49.取50.0g红三叶粉末，按照正交试验所得最佳提取工艺进行多糖提取。
50.1.2.4.2超声提取
51.取50.0g红三叶粉末，置于100ml锥形瓶中，参照史文娟“罗布麻和红三叶中多糖与黄酮的抗氧化活性研究”中的方法提取，用40％的无水乙醇提取，料液比为1：30(g
·
ml-1
)，在50℃下超声浸提30min，过滤并收集上清液。
52.1.2.4.3热水提取
53.取50.0g红三叶粉末，置于100ml锥形瓶中，参照zhang h x,et al.“extraction,purification,hypoglycemic and antioxidant activities of red clover(trifolium pratense l.)polysaccharides”中的方法提取，用超纯水提取，料液比为1：21(g
·
ml-1
)，在93℃下水浴浸提95min，过滤并收集上清液。
54.1.2.5红三叶多糖的精制
55.按照1.2.4的三种方法分别提取，将上清液用旋转蒸发仪(rv10 digital flex，德国ika公司)减压浓缩至1/4体积，加入无水乙醇醇沉，采用sevage法除蛋白，用透析袋(3500da，北京索莱宝科技有限公司)透析24h，透析袋内溶液用大孔吸附树脂(d101，上海麦克林生化科技有限公司)精制，减压浓缩，冷冻干燥(coolsafe100-4,基因有限公司)后得到精制多糖。
56.1.2.6抗氧化活性的测定
57.清除dpph和超氧阴离子自由基活性测定，分别参考mishra k,et al.“estimation of antiradical properties of antioxidants using dpph'assay:a critical review and results”和halliwell b,et al.“the deoxyribose method:a simple“test-tube”assay for determination of rate constants for reactions of hydroxyl radicals”中的方法。多糖样品、阳性对照vc用超纯水配制，将每个待测物质配制成浓度为1mg
·
ml-1
的原液，再依次分别稀释到(0.1mg
·
ml-1
、0.2mg
·
ml-1
、0.4mg
·
ml-1
、0.5mg
·
ml-1
、0.6mg
·
ml-1
、0.8mg
·
ml-1
)和(0.4mg
·
ml-1
、0.5mg
·
ml-1
、0.6mg
·
ml-1
、0.8mg
·
ml-1
)不同浓度梯度待用。
58.1.2.7单糖组成分析
59.采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化法(参考文献：“丘娴.石菖蒲多糖的提取、分离纯化和结构鉴定”；xu z，et al.“characterization and antioxidant activities of polysaccharides from the leaves of lilium lancifolium thunb”；ren d,et al.“chemical characterization of a novel polysaccharide askp-1from artemisia sphaerocephala krasch seed and its macrophage activation via mapk,
pi3k/akt and nf-κb signaling pathways in raw264.7 cells”)，利用高效液相色谱(hplc)分析红三叶多糖的单糖组成。样品前处理及色谱条件如下所示：
60.红三叶多糖水解和单糖标准品溶液的制备：准确称取5mg多糖样品于具塞烧瓶中，加入2ml 2mol
·
l-1
的三氟乙酸在105℃条件下水解6h。反应完成后用甲醇反复多次将水解液洗出，将水解液减压旋干，然后用0.5ml超纯水溶解得到多糖水解液。分别称取甘露糖(man)、鼠李糖(rha)、葡萄糖醛酸(glua)、半乳糖醛酸(gala)、葡萄糖(glu)、半乳糖(gal)、木糖(xyl)和阿拉伯糖(ara)标准品10mg，用超纯水配制成1mg
·
ml-1
的混合单糖标准母液，再稀释2、4、8、16、32、64倍待用。
61.pmp衍生化步骤：取100μl多糖水解液或单糖标准品溶液，加入400μl 0.5mol
·
l-1
pmp和400μl 0.3mol
·
l-1
naoh混匀，在70℃水浴锅中反应1h，冷却后在反应体系中加入405μl0.3mol
·
l-1
hcl。将所得溶液用2ml三氯甲烷萃取，重复3次，获得pmp标记的单糖样品，过0.45μm水相滤膜后进样分析。
62.色谱条件：agilent 1260高效液相色谱仪(美国agilent公司)，eclipse plus c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，美国agilent公司)，紫外检测器波长为250nm，柱温箱温度为30℃，流动相为0.05mol
·
l-1
磷酸盐缓冲液(ph 6.7)：乙腈＝83:17(v/v)，流速为0.8ml/min，进样量为20μl，数据采集时间为55min。
63.1.5数据处理与分析
64.使用ibm spss statistics 26.0统计软件进行单因素anova方差分析，利用origin 2023绘图。
65.2、结果与分析
66.2.1单因素筛选
67.2.1.1酶解时间
68.在酶用量0.9％、酶解温度50℃和酶比例3：1：1不变的条件下，考察酶解时间对红三叶多糖提取的影响。如图1中a所示，酶解时间越长，多糖含量越高。酶解时间较短时，多糖含量急剧上升，60-80min增加趋于平缓，随后升高，但90与100min的多糖含量无显著性差异。从提取效率、时间成本等方面考虑，90min为最佳的酶解时间。
69.2.1.2酶用量
70.在酶解时间90min、酶解温度和酶比例不变的条件下，考察酶用量对红三叶多糖提取的影响。如图1中b所示，红三叶多糖含量随着酶用量的增多呈现先增大后降低的趋势，酶用量越多，多糖含量不一定高，多糖含量也与单酶用量有关。酶具有专一性，各单酶在提取过程中发挥着不同的作用，相同比例下，酶用量增加，各单酶对植物组织分解提取的能力不同。酶用量为0.9％时，多糖含量最高，随后多糖含量下降。故0.9％为最佳的酶用量。
71.2.1.3酶解温度
72.在酶解时间90min、酶用量0.9％和酶比例不变的条件下，考察酶解温度对红三叶多糖提取的影响。如图1中c所示，红三叶多糖含量随着酶解温度的增大呈现先增大后降低的趋势。55℃下多糖含量增加趋于平缓，而55℃、60℃和65℃下的多糖含量无显著性差异，60℃后多糖含量下降，可能是温度抑制了酶活性。故55℃为最佳的酶解时间。
73.2.1.4酶比例
74.在酶解时间90min、酶用量0.9％和酶解温度55℃的条件下，考察酶比例对红三叶
多糖提取的影响。如图1中d所示，红三叶多糖含量随着酶比例的增大呈现先增大后降低再增大的趋势。酶比例和酶用量对红三叶多糖含量的变化趋势大致相同，彼此相互联系和制约，酶比例为3：1：1时多糖含量最高，酶比例为7：2：2时多糖含量最低，故3：1：1为最佳的酶比例。
75.2.2正交试验结果
76.由表2和3可知，不同条件酶提取工艺中c(酶解温度)r值最大，即酶解温度对红三叶多糖含量的影响最大，酶解时间、酶用量、酶解温度3个因素对多糖含量影响均为极显著(p＜0.01)，酶比例对红三叶多糖含量的影响作用不显著(p＞0.05)。各因素不同水平程度依次为a2》a1》a3、b3》b2》b1、c2》c1》c3、d2》d3》d1，优选出酶提取的最佳工艺条件为a2b3c2d2，即酶解时间为90min，酶用量为1.0％，酶解温度为60℃，酶比例为7：2：2。用该工艺提取，红三叶多糖含量为8.85
±
0.07％。
77.表2红三叶多糖酶提取工艺正交设计与多糖含量结果
[0078][0079]
表3红三叶多糖酶提取工艺多糖含量方差分析结果
[0080][0081]
2.3酶、超声和热水提取方法比较
[0082]
2.3.1不同提取方法制备的红三叶多糖
[0083]
不同提取方法制备的红三叶多糖如图2所示，酶、超声和热水提取精制的多糖分别为0.23g、0.14g、0.26g，该多糖样品用来测定抗氧化活性和分析单糖组成。
[0084]
2.3.2红三叶多糖清除dpph和超氧阴离子自由基的能力
[0085]
红三叶多糖具有抗氧化能力，由图3中a可知，三种方法提取的红三叶多糖对dpph的清除率均弱于阳性对照vc。多糖浓度低于0.2mg
·
ml-1
时，酶和热水提取的多糖活性强于超声提取，多糖浓度在0.2-0.6mg
·
ml-1
之间对dpph的清除率变化趋势较大，且热水提取的多糖清除率最大。超声和热水提取的多糖浓度在0.6-1.0mg
·
ml-1
之间对dpph的清除率变化
趋于平缓，而酶提取的多糖随浓度增大对dpph的清除率增幅较大，1mg
·
ml-1
时，三种方法提取的多糖对dpph的清除率趋于接近70％。由图3中b可知，三种方法提取的红三叶多糖对超氧阴离子的清除率均强于阳性对照vc。超声和热水提取的多糖浓度在0.6-1.0mg
·
ml-1
之间对超氧阴离子的清除率变化趋较大，酶提取的多糖对超氧阴离子的清除率以0.8mg
·
ml-1
为拐点，随多糖浓度的增大先平缓后迅速增加。1mg
·
ml-1
时，三种方法提取的多糖对超氧阴离子的清除率趋于接近50％，超声和热水提取的多糖对dpph和超氧阴离子的清除率变化趋势基本一致。多糖浓度在0.6-1.0mg
·
ml-1
之间时，三种方法提取的红三叶多糖对dpph和超氧阴离子的清除能力依次为：超声、热水和酶提取多糖。
[0086]
2.3.3单糖组成分析
[0087]
如图4所示，红三叶多糖主要由8种单糖组成，分别为甘露糖(man)、鼠李糖(rha)、葡萄糖醛酸(glua)、半乳糖醛酸(gala)、葡萄糖(glu)、半乳糖(gal)、木糖(xyl)、阿拉伯糖(ara)组成。其中葡萄糖glu、半乳糖gal和阿拉伯糖ara占比均高，三者占到单糖组分的71％以上(表4)。但不同提取方法导致这三种单糖的比例有明显差异，酶提取多糖中glu摩尔百分比最高，是热水提取多糖的1.6倍。同时，酶提取多糖中glu略高于gal，组成比接近于1：1，而超声和热水提取多糖中，gal的比例最高，是glu的1.5-1.8倍。ara在酶提取中比例最低，为glu的64％，但在超声和热水提取多糖中比例均高于20％，是glu的1.1倍。三种提取多糖中，glua的摩尔百分比最低，不到4.1％。
[0088]
表4红三叶单糖组成
[0089][0090]
从上述实施例的结果可看出，本发明通过单因素和正交试验得到红三叶多糖的最佳提取工艺为：酶解时间90min，酶用量1.0％，酶比例7：2：2，酶解温度60℃。在此条件下，纯化精制多糖含量为28.42
±
0.68％，多糖由8种单糖组成，glu的占比最高。三种方法提取的多糖均有较高的抗氧化活性，尤其是对超氧阴离子的清除活性。在1mg
·
ml-1
时，酶提取的多糖对dpph和超氧阴离子的清除活性与热水和超声提取趋于接近。不同提取方法的单糖组成相同，但各单糖之间的摩尔百分比不同，三种方法提取中多糖均以glu、ara和gal为主的单糖组成。酶提取法与超声和热水提取相比，除乙醇外未使用任何有机试剂，该方法步骤少、条件温和、成本较低、绿色安全，最宜于工艺生产应用。
[0091]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种红三叶多糖的酶提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将红三叶、水以及复合酶混合后进行酶解，制得红三叶粗多糖；所述红三叶粗多糖经醇沉、透析、冷冻干燥，制得红三叶多糖；其中，所述红三叶与所述水的质量体积比为1g：(30-50)ml；所述复合酶的用量为所述红三叶总质量的0.6％-1.0％，所述复合酶是由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶混合而成。2.如权利要求1所述的红三叶多糖的酶提取方法，其特征在于，所述复合酶是由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶按照质量比(2-15)：(1-4)：(1-4)混合而成。3.如权利要求2所述的红三叶多糖的酶提取方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶、所述纤维素酶和所述果胶酶的质量比7：2：2。4.如权利要求1所述的红三叶多糖的酶提取方法，其特征在于，所述酶解的温度为45-65℃，时间为30-100min。5.如权利要求4所述的红三叶多糖的酶提取方法，其特征在于，所述酶解的温度为60℃，时间为90min。6.如权利要求1所述的红三叶多糖的酶提取方法，其特征在于，所述复合酶的用量为所述红三叶总质量的1.0％。7.如权利要求1所述的红三叶多糖的酶提取方法，其特征在于，所述红三叶粗多糖用无水乙醇进行醇沉；所述透析是采用3500da的透析袋进行。8.一种红三叶多糖，其特征在于，其是由权利要求1-7任一项所述的酶提取方法制得。9.如权利要求7所述的红三叶多糖，其特征在于，所述红三叶多糖甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其中，所述葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖占所述红三叶多糖的3/4，且所述葡萄糖的摩尔百分比最高。10.如权利要求8-9任一项所述的红三叶多糖在清除dpph和超氧阴离子方面的应用。

技术总结
本发明公开了一种红三叶多糖的酶提取方法，属于天然产物分离提取领域。上述酶提取方法包括：将红三叶、水以及复合酶混合后进行酶解，制得红三叶粗多糖；再经醇沉、透析、冷冻干燥，制得红三叶多糖；红三叶与水的质量体积比为1g：(30-50)mL；复合酶的用量为红三叶总质量的0.6％-1.0％，复合酶是由木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶混合而成。通过实验筛选出酶提取最佳工艺条件为：酶解时间90min，酶用量1.0％，酶解温度60℃，木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶质量比为7：2：2，红三叶粗多糖含量为8.85


技术研发人员：刘权 祁兆奔
受保护的技术使用者：兰州大学
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/10/15