用于测定ATP的试剂盒的制作方法

用于测定atp的试剂盒
技术领域
1.本发明涉及用于测定atp的试剂盒，具体而言，涉及一种耐久性优异的用于测定atp的试剂盒。


背景技术：

2.对于生物大分子的检测受到各国科学家的广泛关注，因为生物大分子在人体内的含量与构象是与人类疾病息息相关的。在众多的带负电荷的磷酸化合物中，三磷酸腺苷(atp)(adenosine triphosphate)是一种多功能的核苷酸由1分子腺嘌呤，1分子核糖和3分子磷酸组成。atp在生物体内发挥着重要的作用，是所有生物体生存和细胞繁殖的能量来源。细胞中dna复制、转录、细胞分裂、细胞内生物合成、各种酶促反应等都存在着atp的身影。研究发现，atp的异常通常显示着比如局部贫血、低血糖症、帕金森氏综合症等的发生。因此，对atp进行检测已经成为对上述这些疾病进行诊断的一个重要指标。
3.比较经典的检测atp的手段是“荧光素酶-荧光素”方法，以外，还包括高效液相色谱法、核酸适配体法以及电泳法等等。这些方法虽然灵敏度高，但是通常需要专业设备或者专业的操作，不仅对于设备和操作者的要求较高，而且对于操作环境也有一定的要求。
4.对于上述问题，有报道提出了一种通过显色剂与过氧化氢的反应进行显色来检测样品中atp含量的试剂盒，该试剂盒操作简单易行，对于操作者和操作环境的要求比较低。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题
6.本发明的发明人对于通过上述显色剂与过氧化氢的反应进行显色来待测样品中atp含量的试剂盒进行研究之后发现，虽然该试剂盒操作简单，但是其灵敏度和时间呈负相关，即耐久性较差。例如，经过一个月以上的存放，该试剂盒的通过显色来测定待测atp浓度准确度出现明显降低。也就是说，对于atp浓度完全相同的待测而言，在不同时间对其测定时，获得的测定结果是不同的。对于这些长期存放后的试剂盒，虽然可以通过atp标准溶液重新进行校准，但是，不同试剂盒的准确度变化也是不同的，这导致，即使进行了校准，仍无法获得准确的测定结果。
7.该试剂盒通过其中的过氧化氢与显色剂的显色反应来检测atp的存在和含量，本发明经过研究之后注意到，该试剂盒中使用的显色剂尚且算是较为稳定的物质，但是可能是由于显色剂长期处于强氧化环境中，经过一段时间之后，显色剂的部分结构被氧化，导致其显色效果大打折扣，基于显色效果来确定待测样品atp浓度的准确度下降，导致难以准确地测定待测样品中atp的浓度。
8.因此，本发明的所要解决的技术问题是提供一种能够长期保持atp检测准确的耐久性优异的用于检测atp的试剂盒。
9.解决技术问题的技术方案
10.方案1.一种用于测定atp的试剂盒，其特征在于，包括试剂1，
11.所述试剂1包含：氧化剂、显色剂、第一酸、超氧化物歧化酶(sod)以及依地酸和/或其盐。
12.方案2.方案1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述超氧化物歧化酶为cu/zn-sod。
13.方案3.方案1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述试剂1进一步含有第二酸，所述第二酸选自硼酸或硅酸。
14.方案4.方案3所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述硼酸或硅酸在试剂1中的含量为0.1重量％～3重量％。
15.方案5.方案1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述依地酸在试剂1中的含量为0.01～0.1重量％。
16.方案6.方案1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述氧化剂为过氧化氢。
17.方案7.方案1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述第一酸为选自氢卤酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲酸、乙酸以及丙酸中的至少一种。
18.方案8.方案1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述超氧化物歧化酶在所述试剂1中的含量为0.1重量％～5重量％。
19.方案9.方案1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，其进一步包括试剂2，所述试剂2为atp标准溶液。
20.本发明的技术效果
21.本发明的用于测定atp的试剂盒，其包括试剂1，所述试剂1包含：氧化剂、显色剂、第一酸、超氧化物歧化酶(sod)以及依地酸和/或其盐。通过采用含有依地酸和/或其盐的溶液作为显色剂与过氧化氢的基础液体，解决了上述的问题，获得了显色剂即使经过很长时间仍可以显示出与刚刚制备时同样优异的显色效果、检测准确度高、耐久性优异的atp检测试剂盒。
具体实施方式
22.本发明的发明人在对上述显色剂与过氧化氢的反应进行显色来检测样品中atp含量的试剂盒进行研究之后注意到，虽然其中使用的显色剂在通常条件下较为稳定，但是由于这些显色剂在试剂盒中处于过氧化氢形成的强氧化环境之下，因此，经过一段时间之后，其显色的灵敏度和准确度会有所下降。对于，本发明的发明人采用含有依地酸和/或其盐的溶液作为显色剂与过氧化氢的基础液体，从而解决了上述的问题，获得了显色剂即使经过很长时间仍可以显示出与刚刚制备时同样优异的显色效果、检测准确度高、耐久性优异的atp检测试剂盒。
23.具体地，本发明涉及一种用于测定atp的试剂盒，其包括试剂1，所述试剂1包含：氧化剂、显色剂、第一酸、超氧化物歧化酶(sod)以及依地酸和/或其盐。
24.在本发明中，采用含有依地酸和/或其盐的edta缓冲液作为试剂1的基础液体，从而实现了能够保持显色剂即使经过很长时间，仍可以显示出与刚刚制备时同样优异的显色效果。
25.本发明中使用的显色剂，只要是能够在在第一酸的存在下与氧化剂发生显色反应即可，没有特别的限定，可以使用3,3,5,5-四甲基联苯胺(tmb)或邻苯二胺等。这些显色剂
可以在第一酸的存在下与氧化剂(例如过氧化氢)发生显色反应而变为蓝绿色。第一酸在该反应中处于类似催化剂的角色，然而，atp的存在可以抑制第一酸的这种“催化活性”，使得上述显色反应进行得不完全。不同浓度的atp对于上述显色反应的抑制也不同，因此，根据显色反应的颜色变化，就可以测定样品中atp的含量。
26.具体而言，当atp浓度越高时，显色反应越弱，而atp浓度低或不存在atp时，其显色反应越强。据此，利用紫外可见分光光度计可以定量检测atp的含量。
27.本发明的发明人注意到，上述显色剂在试剂盒中与氧化剂接触，处于强氧化环境之中。经过一段时间之后，其显色反应的强度会有所下降，导致其显色效果大打折扣，基于显色效果来确定待测样品atp浓度的准确度下降。对于上述问题，发明人采用含有依地酸和/或其盐的液体作为环境基础液体，能够解决上述的问题。本发明中，解决该问题的机理尚不完全明确，本发明的发明人对于该机理推测如下。
28.依地酸和/或其盐可能起到了络合剂的作用，使得已经发生了显色反应的显色剂被依地酸和/或其盐的离子所包裹，使得其与环境中剩余的氧化剂隔离开来，从而保证了显色反应的颜色的长期稳定的保持。另外，依地酸和/或其盐可以在溶液中形成缓冲液，这为依地酸和/或其盐提供了较好的形成包裹状态的稳定ph环境，因此，可以使得该包裹能够更加持久和严密。
29.本发明的atp检测试剂盒中，包括试剂1。其中，所述试剂1包含：氧化剂、显色剂、第一酸、超氧化物歧化酶(sod)以及依地酸和/或其盐。
30.试剂1中，所述氧化剂为过氧化氢，过氧化氢在试剂1中的浓度只要是能够与显色剂发生显色反应即可，并没有特别的限定，优选为0.1mm～10mm，更为优选的是1mm～5mm。本发明中也可以使用其他的氧化剂，只要能够与显色剂发生显色反应即可。
31.在试剂1中，显色剂可以是通常使用的显色剂，可以使用3,3,5,5-四甲基联苯胺(tmb)或邻苯二胺等，优选使用毒性较低的3,3,5,5-四甲基联苯胺(tmb)。显色剂在试剂1中的浓度没有特别的限制，优选为0.1mm～10mm，更为优选的是1mm～5mm。
32.在试剂1中，所述第一酸可以是氢卤酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲酸、乙酸以及丙酸中的至少一种，其中，氢卤酸可以是盐酸、氢溴酸、氢氟酸、氢碘酸。第一酸在试剂1中的浓度以氢离子计算为0.01mm～1m，优选0.05mm～0.5mm。从容易获得的角度来看，优选盐酸或乙酸。
33.在试剂1中，还进一步含有超氧化物歧化酶(sod)。在本发明中，由于过氧化氢与显色剂的反应而实现显色。然而，过氧化氢容易挥发，从而影响显色效果。本发明发现，在试剂1中添加超氧化物歧化酶之后，可以长期保持过氧化氢的浓度，从而维持优异的显色效果。添加超氧化物歧化酶实现上述效果的机理尚不明确。发明人推测如下，超氧化物歧化酶似乎并不能保证过氧化氢不分解或不挥发，但是在超氧化物歧化酶的存在下，似乎可以对过氧化氢进行补充。
34.上述超氧化物歧化酶的种类可以使用cu/zn-sod、mn-sod或者fe-sod。但是，由于超氧化物歧化酶本身具有颜色，有时会对显色造成影响。因此，可以根据显色剂的颜色来选择超氧化物歧化酶的种类。优选的是，在选择3,3,5,5-四甲基联苯胺(tmb)作为显色剂时，优选使用cu/zn-sod。因为，3,3,5,5-四甲基联苯胺(tmb)在显色时显示蓝绿色，而cu/zn-sod本身也是与显色的蓝绿色相似的蓝绿色。这样，不仅不会影响显色，反而有增强显色效果的作用。
35.所述超氧化物歧化酶在所述试剂1中的含量为0.1重量％～5重量％。所述超氧化物歧化酶的浓度在上述上限之上时，维持过氧化氢的浓度进一步提高，可以长时间(一年以上)维持过氧化氢的浓度；而浓度在上述下限以下时，对于显色效果的影响很小，可以保证也优异的显色效果。优选的浓度是1～5重量％，更为优选2重量％。
36.本发明的试剂1还包括依地酸和/或其盐。所述依地酸和/或其盐可以使用依地酸或者依地酸二钠(edta-2na)，从溶解性优异的角度而言，优选使用依地酸二钠(edta-2na)。所述依地酸和/或其盐在试剂1中的浓度可以为0.01～0.1重量％，该浓度范围内的依地酸和/或其盐可以对显色剂实现更好的包裹保护效果，进一步延长显色剂不受强氧化环境影响的时间。另外，优选的浓度可以是0.05～0.1重量％。
37.另外，依地酸和/或其盐溶解于水后可以形成缓冲溶液。就该缓冲溶液的ph值而言，可以为6.5～8，优选6.7～7.8。
38.在本发明中，试剂1中还可以含有第二酸，所述第二酸选自硼酸或硅酸。本发明的发明人的研究发现，通过在试剂中添加硼酸或硅酸，有助于维持依地酸形成的缓冲液的稳定性，特别是有利于维持依地酸形成的缓冲液的ph的稳定性，从而使得能够实现长时间维持显色性的效果。
39.在本发明中，所述试剂盒可以进一步包括试剂2，所述试剂2为atp标准溶液。所述试剂盒也可以不包括试剂2。所述试剂2可以在即将对待测样品进行测定之前配置。
40.在即将对待测样品进行测定之前，配置该atp标准溶液，可以分别配置atp浓度不同的标准溶液，也可以配置单一浓度的标准溶液后通过稀释获得atp浓度不同的标准溶液。
41.配置好的各atp标准溶液用于在对待测样品进行测定之前，先与试剂1进行接触，从而根据这些atp浓度不同的标准溶液与试剂1接触后的显色变化，绘制atp浓度与吸光值的对应曲线。
42.需要注意的是，atp标准溶液的atp浓度的具体设计应当根据待测样品的浓度进行设计。围绕待测样品可能的atp浓度，在该可能的atp浓度的周围密集地设计多个标准atp标准样品，从而提高待测样品中atp的测定准确度。例如，估计待测样品的atp浓度大约为12μm，那么，可以这些atp标准溶液的浓度的一个例子是0μm、5μm、7μm、8μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、16μm、20μm。即，在12μm附近密集设计多个atp标准溶液。
43.下面，介绍采用本发明的atp试剂盒进行待测样品的atp浓度进行测定的方法进行说明。
44.步骤一，估计待测样品的atp浓度。
45.根据样品的来源、类型等，初步估计atp浓度。在估计待测样品atp浓度时，如果能估计的比较准确自然最好，但是如果确实难以估计，也并不需要估计得特别精确，只需要知晓一个大概的区间即可。估计待测样品atp浓度的最低限度是不要超出试剂2中atp标准溶液的atp浓度范围。只要不超出试剂2中atp标准溶液的atp浓度范围，均可进行测定。
46.步骤二，制备试剂2，并进行atp标准溶液的浓度设计。
47.制备浓度已知的atp溶液作为试剂2。并且在样品atp浓度的估计值的附近，密集设计多个atp浓度不同的标准溶液。本实施方式中，试剂2中的atp标准溶液的浓度是一定的，可以通过对试剂2进行稀释来获得浓度不同的atp标准溶液。
48.步骤三，获得atp标准溶液的显色结果(吸光值)
49.将多个不同atp浓度的atp标准溶液分别与试剂1进行混合，得到各种atp浓度标准溶液与试剂1的混合溶液，得到各种atp浓度下的显色结果。
50.采用紫外线可见光分光光度计测定上述各混合溶液在可见光波段的吸光值。根据需要可以根据各吸光度的值拟合成关于atp浓度与吸光度的函数。
51.步骤四，获得待测样品的吸光值并通过比对得到atp浓度
52.将待测样品与试剂1进行混合，得到待测混合溶液。采用紫外线可见光分光光度计测定上述待测混合溶液在可见光波段的吸光值。通过将该吸光值与步骤三中测定的各atp标准溶液的吸光值进行对比，从而可以得知待测样品的atp浓度。另外，也可以将待测样品的吸光值代入上述拟合函数中，从而获得atp浓度的精确值。
53.下面，对于上述测定的条件进行简单说明。
54.上述测定的环境温度并无特别限定，只要能够正常发生显色反应即可，优选在5～50℃的温度范围进行，特别优选在常温下进行。上述测定的压力通常为大气压下。无需仅额外的加压或减压。上述测定中，将atp标准溶液或待测样品与试剂进行混合并反应的时间也没有特别的限制，根据待测样品的atp浓度可以稍有差异，一般而言，反应的时间在30分钟～3小时的范围即可。在这样的时间范围内，都可以实现充分的反应。
55.在本发明中，采用特定的atp标准溶液设计方式，在以简单方式进行测定的情况下，确保了测定的精确性。即，在测定之前，先对待测样品的atp浓度进行估计，而后，在该atp浓度的估计值附近密集设计相应浓度的atp标准样品，从而，增加了atp浓度估计值附近的测定分辨率，使得拟合函数也更能体现真实浓度，从而能够更为精确地测定待测样品中的atp浓度。这样一来，即使是atp浓度非常微量的样品，也能精准地进行测定，而不会因为方法简单而丧失精准度。
56.实施例
57.下面，通过具体的实施例进一步详细说明本发明的技术方案。
58.本发明的实施例主要涉及验证本发明的atp检测试剂盒的耐久性。
59.耐久性的测定方法
60.采用组成完全相同的试剂1。
61.实验1：在其刚刚制造完成时，对待测样品进行测定，获得吸光值；
62.实验2：在常温常压下将上述试剂1保存一个月后，对待测样品进行测定，获得吸光值；
63.实验3：在常温常压下将上述试剂1保存三个月后，对待测样品进行测定，获得吸光值。
64.实施例1～9以及比较例1～3
65.(1)待测样品
66.采用atp浓度已知的样品作为待测样品。待测样品中atp浓度为5μm。atp为陕西康禾制药有限公司生产(食品级)。
67.(2)试剂1的制备
68.根据表1所示的成分来选用以下的产品。
69.氧化剂：3％过氧化氢溶液(山东德州医疗器械有限公司)
70.显色剂：3,3,5,5-四甲基联苯胺粉末(福州飞净生物科技有限公司)
71.第一酸：10％稀盐酸(山东德州医疗器械有限公司)
72.第一酸：5％醋酸(苏州金邦化工有限公司)
73.超氧化物歧化酶：cu/zn-sod(陕西中鸿药业有限公司)
74.依地酸和/或其盐：依地酸二钠(苏州金邦化工有限公司)。
75.硼酸：(山东一澄化工科技有限公司)
76.硅酸：(山东一澄化工科技有限公司)
77.将上述成分按照表1所示的浓度比例添加到蒸馏水中，缓慢搅拌，得到试剂1。
78.(3)试剂2的制备
79.将atp溶解于蒸馏水中，制成1mm的atp标准溶液作为试剂2。
80.需要注意的是，本实施例的目的是为了检验试剂1的耐久性，因此，试并不对剂2进行测定，试剂的制备仅为形式步骤。
81.(4)待测样品的测定
82.在试剂1刚刚配置好的8小时内，取待测样品0.5ml与试剂1(0.5ml)进行混合，混合溶液的体积为1ml。
83.采用紫外可见分光光度计(济南爱来宝仪器设备有限公司uv-3100)在420nm波长下测定待测样品混合溶液的吸光值。
84.将试剂1在常温常压下密封放置一个月，与上述同样地进行操作，用放置一个月后的试剂1对待测样品进行测定。
85.将试剂1在常温常压下密封放置三个月，与上述同样地进行操作，用放置一个月后的试剂1对待测样品进行测定。
86.测定结果如下表1～2所示。
87.[0088][0089]
工业实用性
[0090]
本发明涉及一种用于测定atp的试剂盒，该试剂盒具有优异的耐久性，即使长时间放置，仍然能确保与刚刚制备出来时的测定精确度，可以广泛用于生物医药医疗等各种领域。

技术特征：
1.一种用于测定atp的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括试剂1，所述试剂1包含：氧化剂、显色剂、第一酸、超氧化物歧化酶(sod)以及依地酸和/或其盐。2.权利要求1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述超氧化物歧化酶为cu/zn-sod。3.权利要求1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述试剂1进一步含有第二酸，所述第二酸选自硼酸或硅酸。4.权利要求3所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述硼酸或硅酸在试剂1中的含量为0.1重量％～3重量％。5.权利要求1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述依地酸和/或其盐在试剂1中的含量为0.01～0.1重量％。6.权利要求1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述氧化剂为过氧化氢。7.权利要求1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述第一酸为选自氢卤酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲酸、乙酸以及丙酸中的至少一种。8.权利要求1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，所述超氧化物歧化酶在所述试剂1中的含量为0.1重量％～5重量％。9.权利要求1所述的用于测定atp的试剂盒，其特征在于，其进一步包括试剂2，所述试剂2为atp标准溶液。

技术总结
本发明涉及一种用于测定ATP的试剂盒，其包括试剂1和试剂2，所述试剂1包含：氧化剂、显色剂、第一酸、超氧化物歧化酶(SOD)以及依地酸和/或其盐，试剂2为ATP标准溶液。所述用于测定ATP的试剂盒具有优异的耐久性，即使长时间放置仍可以准确地测定ATP的浓度。置仍可以准确地测定ATP的浓度。


技术研发人员：王强 葛娟 孙广义
受保护的技术使用者：南京峦创生命科技有限公司
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/10/15