一种提高转移载体中IRES序列介导筛选基因表达效率的方法

一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法。


背景技术：

2.病毒拯救为研究病毒基因功能及开发疫苗载体等方面的研究提供了重要平台。同源重组在病毒拯救过程中发挥重要功能。转移载体携带外源基因和/或筛选基因，外源基因和/或筛选基因的两侧为插入位点上下游同源序列，通过转移载体和病毒基因组同源序列之间重组的原理，从而将外源基因和/或筛选基因整合到病毒基因组中，从而实现预期的病毒拯救目的。
3.转移载体中外源基因和/或筛选基因的表达效率直接影响重组病毒的筛选，为此，在进行转移载体和病毒基因组同源重组之前客观上需先开展转移载体中外源基因尤其是筛选基因表达效率的验证工作，只有当外源基因或筛选基因能正常表达，方可进行后续的病毒拯救工作。转移载体的有效性验证是病毒拯救过程中关键性环节。
4.内部核糖体进入位点(ires)或类似功能序列使得外源基因及筛选基因可同时整合到病毒基因组中，使得外源基因和筛选基因同时表达，对病毒纯化和验证工作提供了极大便利。然而，由于ires所介导筛选基因的表达效率不及其5端外源基因的表达效率，通常筛选基因的表达效率仅为其5端外源基因的1/10。为此，当对筛选基因进行检测时，常因筛选基因表达效率低而导致信号弱甚至“假阴性”情况的发生，严重影响转移载体的有效性验证。针对该问题，目前尚无有效的解决方法。因此，能否提高病毒拯救所需转移载体中筛选基因的表达效率，是事关病毒能否成功拯救的一个共性关键技术问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于：为了解决背景技术中提出的问题，而提出的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，将转移载体转染靶细胞后，用病毒进行感作。
8.作为上述技术方案的进一步描述：
9.所述病毒为转移载体对应的病毒。
10.作为上述技术方案的进一步描述：
11.所述病毒为伪狂犬病病毒，伪狂犬病病毒为活病毒。
12.作为上述技术方案的进一步描述：
13.病毒粒子以伪狂犬病病毒的ge基因为插入位点，在ge起始密码子之前优选加入cmv启动子，以增强目的基因pcv2 cap的转录和表达。
14.作为上述技术方案的进一步描述：
15.在外源基因终止密码子后连接ires介导的egfp基因，以egfp为筛选标记来筛选重组病毒。
16.作为上述技术方案的进一步描述：
17.所述转移载体筛选基因为egfp基因、yfp基因和rfp基因中的任意一种。
18.作为上述技术方案的进一步描述：
19.所述转移载体为两端携带同源重组所需的病毒同源臂序列。
20.作为上述技术方案的进一步描述：
21.将ge基因上游1081bp、下游1246bp的序列作为转移载体与伪狂犬病病毒(prv)基因组的同源左、右臂。
22.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
23.本发明要解决ires介导筛选标记(或其他介导蛋白)表达效率低的问题，即把转移载体质粒转到细胞中后，发现筛选标记表达效率低，以egfp为例，egfp表达量常为其上游外源基因的1/10左右，导致筛选信号弱，不利于评判转移载体是否有效。先把转移载体质粒转染到细胞内，再用病毒感作前述细胞(用病毒去感染宿主细胞)，结果发现能大幅增强转移载体质粒中ires介导的筛选标记的表达效率，这有利于后续对筛选标记的观察，有利于转移载体的有效性判定，转移载体在进入正式实验(将转移载体和病毒基因组一起转染宿主细胞，希望能得到重组病毒，即转移载体中感兴趣的目的基因通过同源重组的方式整合到病毒组特定位置中，获得新的重组病毒)前的质控环节，确保转移载体质粒是有效的，避免因转移载体质粒无效而导致重组病毒失败的问题。
附图说明
24.图1为本发明提出的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法的同源重组转移载体构建的示意图；
25.图2为本发明提出的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法的表达猪圆环病毒2型cap蛋白转移载体转染细胞后，经或不经伪狂犬病病毒hd/c毒株感作后转移载体中筛选基因egfp的表达情况的示意图；
26.图3为本发明提出的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法的表达猪流感病毒ha1蛋白转移载体转染细胞后，经或不经伪狂犬病病毒hd/c毒株感作后转移载体中筛选基因egfp的表达情况的示意图。
具体实施方式
27.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例1
29.请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：
30.一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，将转移载体转染靶细胞后，用病毒进行感作，感染的病毒为转移载体对应的病毒，所述病毒为伪狂犬病病毒，
伪狂犬病病毒为活病毒(灭活病毒无法感染细胞，必须是活的病毒)，本实施例表达猪圆环病毒2型cap蛋白重组伪狂犬病病毒带egfp筛选基因转移载体的构建，实施例中利用2011年后爆发的prv的灭活ge-tk-‑
prv ii型疫苗株(prv hd/c毒株，ncbi序列号mz063026，专利号zl201710774869.5)作为疫苗载体，用以表达去核定位信号的pcv2 cap(cap，seq id no.1)，即用cap基因替换tk-/ge-‑
prvii型疫苗株(ncbi序列号mz063026)的ge基因，ge蛋白的蛋白序列如seq id no.3所示(见序列表)，cap基因为seq id no.1(见序列表)，其翻译cap蛋白序列如seq id no.2所示(见序列表)；
31.所述病毒粒子以伪狂犬病病毒的ge基因为插入位点，在ge起始密码子之前优选加入cmv启动子，以增强目的基因pcv2 cap的转录和表达；在ge终止密码子后连接ires介导的egfp基因，以egfp为筛选标记来筛选重组病毒；在此基础上，将ge基因上游1081bp、下游1246bp的序列作为转移载体与prv基因组的同源左、右臂，形成本发明的转移载体：seq id no.4：左臂(1-1081bp)-cmv启动子(1082-1670bp)-kozak序列(1671-1676bp)-整合的pcv2 cap(1677-2964bp)-ires(2965-3549bp)-egfp基因(3550-4303bp)-右臂(4304-5549bp)，seq id no.4的蛋白序列(见序列表)，上述序列由浙江尚亚生物技术有限公司合成，并最终构建至puc18载体上，得到puc18-cmv/ge-pcv2cap
+
/egfp
+
转移载体。
32.分别将等量的空白puc18质粒、重组转移载体转染至pk15细胞，其中一个重组转移载体转染组在转染24h后于37℃下进行prv hd/c活毒株的感作，感作1h后弃上清，换液继续培养；继续培养24h后小时观察egfp荧光蛋白表达情况。结果见图2，转移载体转染细胞后，经prv hd/c活病毒感作后，egfp基因表达的绿色荧光信号数量明显强于未经病毒感作实验组，说明经活病毒感作后可显著提高筛选基因的表达效率。
33.实施例2
34.请参阅图1和图3，本发明提供一种技术方案：
35.一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，将转移载体转染靶细胞后，用病毒进行感作，感染的病毒为转移载体对应的病毒，所述病毒为伪狂犬病病毒，伪狂犬病病毒为活病毒，本实施例表达猪流感病毒ha1蛋白重组伪狂犬病病毒带egfp筛选基因转移载体的构建，本实施例中利用2011年后爆发的prv的灭活ge-tk-‑
prv ii型疫苗株(prv hd/c毒株，ncbi序列号mz063026，专利号zl201710774869.5)作为病毒载体，用以表达猪流感病毒ha1蛋白(ha1，seq id no.5(见序列表))，即用猪流感病毒siv的ha1基因片段替换tk-/ge-‑
prvii型毒株(ncbi序列号mz063026)的ge基因。ha1基因(seq id no.5：翻译ha1蛋白序列如seq id no.6(见序列表)所示；
36.本实施例所述病毒粒子以伪狂犬病病毒的ge基因为插入位点，在ge起始密码子之前优选加入cmv启动子，以增强目的基因siv ha1的转录和表达；在外源基因终止密码子后连接ires介导的egfp基因，以egfp为筛选标记来筛选重组病毒；在此基础上，将ge基因上游1081bp、下游1246bp的序列作为转移载体与prv基因组的同源左、右臂，形成本发明的转移载体：seq id no.7(见序列表)：左臂(1-1081bp)-cmv启动子(1082-1670bp)-kozak序列(1671-1676bp)-整合的siv ha1(1677-2816bp)-ires(2817-3984bp)-egfp基因(3985-4738bp)-右臂(4739-5984bp)；
37.上述序列由浙江尚亚生物技术有限公司合成，并最终构建至puc18载体上，得到puc18-cmv/ge-siv ha1
+
/egfp
+
转移载体。重组病毒转移载体介导同源重组的策略见图1。分
别将等量的表达ha1蛋白的重组转移载体转染至vero细胞，其中一个重组转移载体转染组在转染24h后于37℃下进行prv hd/c活毒株的感作，感作1h后弃上清，换液继续培养；继续培养24h后小时观察egfp荧光蛋白表达情况。结果见图3，转移载体转染细胞后，经prv hd/c病毒感作后，绿色荧光信号明显强于未经病毒感作实验组，说明经活病毒感作后可显著提高筛选基因的表达效率。
38.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，其特征在于，将转移载体转染靶细胞后，用病毒进行感作。2.根据权利要求1所述的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，其特征在于，感染的病毒为转移载体对应的病毒，所述病毒为伪狂犬病病毒，伪狂犬病病毒为活病毒。3.根据权利要求2所述的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，其特征在于，病毒粒子以伪狂犬病病毒的ge基因为插入位点，在ge起始密码子之前优选加入cmv启动子，以增强目的基因pcv2 cap的转录和表达。4.根据权利要求1所述的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，其特征在于，在外源基因终止密码子后连接ires介导的转移载体筛选基因，以转移载体筛选基因为筛选标记来筛选重组病毒。5.根据权利要求4所述的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，其特征在于，所述转移载体筛选基因为egfp基因、yfp基因和rfp基因中的任意一种。6.根据权利要求5所述的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，其特征在于，所述转移载体为两端携带同源重组所需的病毒同源臂序列。7.根据权利要求6所述的一种提高转移载体中ires序列介导筛选基因表达效率的方法，其特征在于，将ge基因上游1081bp、下游1246bp的序列作为转移载体与伪狂犬病病毒基因组的同源左、右臂。

技术总结
本发明公开了一种提高转移载体中IRES序列介导筛选基因表达效率的方法，属于分子生物学技术领域，将转移载体转染靶细胞后，用病毒进行感作。本发明中利用伪狂犬病病毒的gE基因为插入位点，插入的外源基因为猪圆环病毒2型Cap基因或猪流感病毒HA1基因，外源基因下游连接IRES序列介导的EGFP筛选基因，将转移载体转染靶细胞后，用病毒进行感作，感作所用的病毒为伪狂犬病病毒，病毒感作后可提高筛选基因表达效率，避免IRES序列介导筛选基因表达信号弱甚至“假阴性”情况的发生，有利于转移载体的有效性判定，避免因转移载体无效而导致病毒重组失败情况的发生。失败情况的发生。失败情况的发生。


技术研发人员：金玉兰 丁书香 董伟仁 颜焰 曾卫东 洪奇华
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/10/15