一种外泌体冻干粉及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及包含外泌体冻干粉技术领域，具体涉及一种常温活性稳定的外泌体冻干粉及其制备方法与应用。


背景技术：

2.目前市面上的舒缓修护原料很多，但也只是对过敏后的症状进行了舒缓，并没有从根本上解决皮肤敏感的问题，如果再遇到过敏反应，还是会出现红、肿、痒等皮肤问题。而且敏感肌接触到一些特殊原料，比如防腐剂，表面活性剂等具有刺激性的原料会使过敏后的肌肤雪上加霜。
3.研究发现，动物外泌体可以有效转运mrna、micro rna及蛋白质等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能，在调控组织再生、细胞修护方面存在良好的临床应用前景，而且还可以携带其他功效成分进入皮肤深层，起到舒缓修护的效果。然而动物外泌体在常温下很难保证其活性及稳定性，对其应用、保存及运输带来了困难。因此，如何有效确保动物外泌体的活性，并进一步提升由动物外泌体制得的终产品的舒缓修护功效，对于从根本上解决皮肤敏感的问题具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明人惊讶地发现，加入了植物外泌体，例如马齿苋外泌体后，不仅稳定了动物外泌体的活性，而且还使得由动物外泌体制得的终产品具有更佳的舒缓修护功效。
5.本发明的一个目的是提供一种外泌体冻干粉，其常温活性稳定，刺激反应小、舒缓功效更好，并且生产工艺简单，易于实现。
6.本发明的另一目的是提供制备本发明的外泌体冻干粉的方法。
7.为了实现上述目的，本发明有如下技术方案：
8.一方面，本发明提供一种外泌体冻干粉，其通过包含以下组分的原料制成：冻干保护剂、植物外泌体、动物外泌体和水，以重量份数计，冻干保护剂1-15份、植物外泌体0.01-6份、动物外泌体10-60份、水19-88.99份。
9.发明人意外发现，加入植物外泌体后，有助于让动物外泌体在长时间内保持较高的活性，进而促进动物外泌体能够长时间发挥舒缓肌肤的性能，这可能是植物外泌体源于细胞质膜、内质网、共生菌或者真菌，包含植物所有次级代谢产物，因而能够调节植物与环境中其它生物之间的相互作用，所以，当将植物外泌体加入冻干粉中后，植物外泌体可能会参与介导植物对物理性和生物性胁迫的反应，并能与体系中与微生物相互作用，维持整个冻干粉的状态平衡，且植物外泌体自身有磷脂双分子层保护，具有较高的稳定性，从而使得冻干粉中各物质的活性在较长的时间内可保持相对稳定。
10.另外，动物外泌体和植物外泌体配合作用后，对肌肤的舒缓修护效果更佳，推测原因可能是由于动物外泌体和植物外泌体均可通过其特有的囊泡机构实现细胞间的活性物
质传递,当动物外泌体和植物外泌体携带马齿苋皂甙、黄酮等具有舒敏功效的活性成分进入皮肤深层时，可起到有效的舒缓修护效果，尤其是对长期使用激素类化妆品产生的皮肤过敏现象及皮肤湿疹、过敏性皮炎、接触性皮炎等皮肤病起到明显的舒缓作用。由此可见，动物外泌体和植物外泌体协同作用，发挥了一举两得的作用。
11.其次，本技术将以植物外泌体、动物外泌体、水及冻干保护剂为原料的终产品制成无菌化处理的冻干粉形式，对敏感肌不易产生副作用，且具有更加高效的修护作用。
12.优选地，在本发明所述的外泌体冻干粉中，其通过包含以下组分的原料制成：以重量份数计，冻干保护剂5-12份、植物外泌体1-5.5份、动物外泌体20-55份、水27.5-74份。
13.优选地，在本发明所述的外泌体冻干粉中，其通过包含以下组分的原料制成：以重量份数计，冻干保护剂8-11份、植物外泌体2-5份、动物外泌体30-50份、水34-60份。
14.优选地，在本发明所述的外泌体冻干粉中，所述冻干保护剂选自甘露醇、海藻糖以及葡聚糖中的至少一种。
15.优选地，在本发明所述的外泌体冻干粉中，所述植物外泌体为薰衣草外泌体、七里香外泌体、薄荷草外泌体、甘草外泌体、人参皂苷外泌体、山竹外泌体或者马齿苋外泌体。
16.优选地，在本发明所述的外泌体冻干粉中，所述动物外泌体为间充质干细胞外泌体。
17.优选地，所述间充质干细胞外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。
18.另一方面，本发明提供一种制备上述外泌体冻干粉的方法，所述方法包括以下步骤：
19.(1)将水、冻干保护剂加入容器中混合，加热至80-85℃，搅拌均匀，得到a相；
20.(2)将步骤(1)得到的a相冷却至40-45℃；
21.(3)向步骤(2)获得的冷却后的a相中加入植物外泌体和动物外泌体并搅拌，然后进行冷冻干燥，即得所述外泌体冻干粉。
22.本发明另一方面还提供了本发明的外泌体冻干粉在制备护肤品或化妆品中的应用。所述护肤品或化妆品为该领域常用产品，包括但不限于冻干粉、软膏、凝胶、面膜、柔肤水、精华、乳液、面霜、洁面乳、沐浴露。
23.由于采取了以上技术方案，本发明具有以下有益效果：
24.1.本发明中动物外泌体与马齿苋外泌体相互协同作用，不仅保证了动物外泌体的活性，而且由于在动物外泌体进行细胞修护的同时，马齿苋外泌体也可以直接进入细胞内部起作用，进一步提升了整个冻干粉的舒缓功效；
25.2.本发明采取冻干粉及无菌的形式，并且不含防腐剂、表面活性剂等刺激性原料，对敏感肌不会产生副作用；
26.3.本发明组合物的生产工艺简单，可操作性强，易于实现。
附图说明
27.以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
28.图1为本发明组合物1-6在45℃环境放置24小时前后蛋白含量对比图；
29.图2为通过visia仪对本发明组合物1进行人体功效测试获得的使用前后对比图；
30.图3为通过visia仪对本发明组合物2进行人体功效测试获得的使用前后对比图；
31.图4为通过visia仪对本发明组合物3进行人体功效测试获得的使用前后对比图；
32.图5为通过visia仪对本发明组合物4进行人体功效测试获得的使用前后对比图；
33.图6为通过visia仪对本发明组合物5进行人体功效测试获得的使用前后对比图；
34.图7为通过visia仪对本发明组合物6进行人体功效测试获得的使用前后对比图。
具体实施方式
35.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，应当理解，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
36.在本发明的具体实施方案中，马齿苋外泌体采购自陕西博鸿生物科技集团有限公司，批号为：201001。
37.动物外泌体为脐带间充质干细胞外泌体，商品名称为动物脐带提取物，采购自东莞芙金干细胞再生医学有限公司，批号为：202103。
38.bca蛋白浓度检测试剂盒采购自赛默飞世尔科技公司，批号为：20210516。
39.检测蛋白浓度，按bca法(《中华人民共和国药典》2010年版二部附录ⅶm第四法)对生物活性因子冻干粉原液进行测定。
40.冻干操作可以采用公开号为cn110897993a的专利中的冻干曲线来实现。
41.除非另外定义，本说明书中有关技术术语和科学术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中的定义为准。另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
42.在接下来的所述实施例中，除非另行指明，所有份数和百分数按重量给出。
43.实施例1
44.冻干粉组合物1-6的制备：
45.步骤1.按表1所示的重量比例称取原料：
46.步骤2.将步骤1称取的纯化水、冻干保护剂加入容器中混合，加热至80-85℃，搅拌均匀，得到a相；
47.步骤3.将步骤2得到的a相冷却至40-45℃；
48.步骤4.将步骤1称取的马齿苋外泌体和动物外泌体加入步骤3所得的a相中，搅拌20min，然后按照公开号为cn110897993a的专利中的冻干曲线进行冷冻干燥，即得所述冻干粉组合物。
49.表1.组合物配方(单位：g)
50.组成组合物1组合物2组合物3组合物4组合物5组合物6纯化水893434383433.5甘露糖醇101010101010葡聚糖0.40.40.40.40.40.4海藻糖0.60.60.60.60.60.6马齿苋外泌体0055155.5动物外泌体0550505050
51.实施例2
52.蛋白含量测试：
53.将实施例1制备的组合物1-6在45℃环境放置24小时，通过bca蛋白浓度检测试剂盒测定组合物1-6的蛋白含量。若蛋白含量和配制时的蛋白含量基本一致，说明蛋白含量损失率最小，即可证明外泌体的活性保存度好；若蛋白含量损失率最大，说明外泌体的活性没有很好的保存，从而相应的功效发挥将大打折扣。实验结果如图1所示。
54.从图1可以看出，将组合物1-6在45℃环境放置24小时后，不含动物外泌体的组合物1与组合物3无蛋白含量；同时含马齿苋外泌体与动物外泌体的组合物4的蛋白含量，与动物外泌体含量更高(高于组合物4)的组合物2的蛋白含量相当，这说明马齿苋外泌体与动物外泌体共存时，有助于稳定动物外泌体的活性；需要说明的是，本技术还进行了如下实验：将组合物4中的马齿苋外泌体替换为等量的马齿苋提取液后，放置24小时后，组合物4的蛋白含量是组合物2放置24后剩余蛋白含量的55％，这说明马齿苋外泌体与马齿苋提取液并不相同，且马齿苋提取液并不能起到有效稳定动物外泌体的作用。组合物4-组合物6中的蛋白含量损失率随着马齿苋外泌体的增加而降低，说明增加马齿苋外泌体后，蛋白含量损失率有所降低，进一步说明马齿苋外泌体有保护动物外泌体活性的能力，能保留更多的蛋白而发挥相应的舒缓修护功效，也有助于延长动物外泌体发挥舒缓效用的时间，提高整个冻干粉的舒缓性能。
55.实施例3
56.斑贴测试：
57.召集60个志愿者，年龄分布在28-55岁之间，10人一组，对组合物1-6进行手臂皮肤斑贴测试。具体的，取受试者左前臂屈侧1cm
×
1cm区域，进行造刺激试验，同一受试者造刺激区域不超过2个。
58.造刺激方法如下：
59.(1)胶带撕拉：使用3m胶带对皮肤受试区域进行反复粘拉10次；
60.(2)涂抹刺激物：使用辣椒素直接涂抹在受试区域；
61.(3)刺激物封闭斑贴：使用15％乳酸在受试区域进行24h封闭斑贴。
62.取掉斑贴后，分别涂抹组合物1-6，每天2次，涂抹14天后测试皮肤状态及指标变化。
63.舒缓功效通过德国ck仪进行测试，主要指征舒缓的指标包括：感官指标、红区、皮肤温度、tewl(经皮水分散失)。将涂抹14天后的效果数据进行平均值处理，计算涂抹前后的改善程度，从而得出缓解刺激症改善程度。结果如表2所示：
64.表2
[0065][0066]
从以上表2结果可以看出，志愿者分别涂抹组合物14天后，通过舒缓功效测试发现，受试者主观感受改善程度依次为：组合物6》组合物5》组合物4》组合物2》组合物3》组合物1；通过检测指标发现，涂抹了组合物2与组合物3的受试者的红区、皮肤温度、tewl指标均有一定的舒缓效果；而涂抹了同时含马齿苋外泌体与动物外泌体的组合物4后，与舒缓有关的指标优于动物外泌体含量更高的组合物2及马齿苋外泌体含量更高的组合物3；另外，在动物外泌体同一个浓度下，随着马齿苋外泌体浓度的增加(组合物4-组合物6)，舒缓效果逐渐加强，说明马齿苋外泌体与动物外泌体协同作用后，能够发挥更好的舒缓效果；且各组合物的舒缓效果由优到劣的次序依次为：组合物6》组合物5》组合物4》组合物2》组合物3》组合物1，由该结果可知，在一定的浓度下，动物外泌体的舒缓效果与相较于马齿苋外泌体而言，更胜一筹，但是，将动物外泌体与马齿苋外泌体在一定的比例下混合，二者能发挥协同增效的功能，可持续起到高效舒缓肌肤的作用。再结合实施例2的结论可知，当加入马齿苋外泌体能够稳定动物外泌体的活性时，马齿苋外泌体能够长时间发挥优异的舒缓性能，进而有助于提升整个冻干粉的舒缓效果。
[0067]
实施例4
[0068]
通过德国ck仪进行人体功效测试：
[0069]
召集60个皮肤比较敏感的志愿者，年龄分布在28-55岁之间，10人一组，分别对组合物1-6进行安全性和舒缓功效测试。安全性是通过将组合物下发给志愿者每天涂抹2次，
然后问卷调查来完成，若志愿者试用，无不良反馈，则为安全性通过；舒缓功效通过德国ck仪进行测试，主要指征舒缓的指标包括：水分含量、红区、皮肤温度、tewl(经皮水分散失)。志愿者每天涂抹2次，将涂抹4周后的效果数据进行平均值处理，计算使用前后的改善程度。结果如表3、表4所示：
[0070]
表3
[0071]
评测项目测试有效人数无不良反馈人数无不良反馈人数占比安全性6060100％
[0072]
从以上安全性测试结果可以看出，安全性测试无不良反馈人数占比100％，为安全。
[0073]
表4
[0074][0075][0076]
从以上表4结果可以看出，志愿者分别涂抹组合物4周后，通过检测受试者水分含量、红区、皮肤温度、tewl的指标发现，加入了动物外泌体的组合物2与加入了马齿苋外泌体的组合物3均有一定的舒缓效果，而涂抹了同时含马齿苋外泌体与动物外泌体的组合物4后，与舒缓有关的指标优于动物外泌体总含量更高的组合物2及马齿苋外泌体总含量更高的组合物3，说明动物外泌体与马齿苋外泌体有协同增效作用；在动物外泌体同一个浓度下，随着马齿苋外泌体浓度的增加(组合物4-组合物6)，舒缓效果逐渐加强，说明马齿苋外泌体可促进动物外泌体有更好的舒缓效果：组合物6》组合物5》组合物4》组合物2》组合物3》组合物1。从结果可知，说明动物外泌体比马齿苋外泌体在一定的浓度下有更好的舒缓效果，动物外泌体与马齿苋外泌体在一定的比例下能发挥协同增效的功能。
[0077]
实施例5
[0078]
通过visia仪进行人体功效测试：
[0079]
召集6个皮肤比较敏感的志愿者，年龄分布在28-55岁之间，分别对组合物1-6进行
舒缓功效验证。舒缓功效通过visia仪进行测试，主要指征舒缓的指标为：红区。志愿者每天涂抹2次，涂抹4周后进行舒缓功效检测。检测结果如图1、图2、图3、图4、图5、图6所示。
[0080]
从图2、图3、图4、图5、图6和图7可以看出，志愿者分别涂抹组合物4周后，通过检测受试者红区指标发现，加入了动物外泌体的组合物2与加入了马齿苋外泌体的组合物3均有一定的舒缓效果，而同时加入马齿苋外泌体与动物外泌体后的组合物与舒缓有关的指标表现显著；在动物外泌体同一个浓度下，随着马齿苋外泌体浓度的增加(组合物4-组合物6)，舒缓效果逐渐加强，说明马齿苋外泌体可促进动物外泌体有更好的舒缓效果：组合物6》组合物5》组合物4》组合物2》组合物3》组合物1。从结果可知，说明动物外泌体比马齿苋外泌体在一定的浓度下有更好的舒缓效果，动物外泌体与马齿苋外泌体在一定的比例下能发挥协同增效的功能。
[0081]
综上所述，本发明提供的外泌体冻干粉，将动物外泌体与植物外泌体加入相应的基质中，动物外泌体和植物外泌体的协同配合作用，有助于对肌肤发挥优异的舒缓修护作用，且有助于让动物外泌体在长时间内保持较高的活性，进而促进动物外泌体能够长时间发挥舒缓肌肤的性能，从而提升整个冻干粉的舒缓效果。
[0082]
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
[0083]
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

技术特征：
1.一种外泌体冻干粉，其通过包含以下组分的原料制成：冻干保护剂、植物外泌体、动物外泌体和水，以重量份数计，冻干保护剂1-15份、植物外泌体0.01-6份、动物外泌体10-60份、水19-88.99份。2.如权利要求1所述的外泌体冻干粉，其通过包含以下组分的原料制成：以重量份数计，冻干保护剂5-12份、植物外泌体1-5.5份、动物外泌体20-55份、水27.5-74份。3.如权利要求2所述的外泌体冻干粉，其通过包含以下组分的原料制成：以重量份数计，冻干保护剂8-11份、植物外泌体2-5份、动物外泌体30-50份、水34-60份。4.如权利要求1所述的外泌体冻干粉，其中所述冻干保护剂选自甘露醇、海藻糖、葡聚糖中的至少一种。5.如权利要求1所述的外泌体冻干粉，其中所述植物外泌体为薰衣草外泌体、七里香外泌体、薄荷草外泌体、甘草外泌体、人参皂苷外泌体、山竹外泌体或者马齿苋外泌体。6.如权利要求1-5任一所述的外泌体冻干粉，其中所述动物外泌体为间充质干细胞外泌体。7.如权利要求6所述的外泌体冻干粉，所述间充质干细胞外泌体为脐带间充质干细胞外泌体。8.如权利要求1-7任一项所述的外泌体冻干粉的制备方法，所述方法包括以下步骤：(1)将水、冻干保护剂加入容器中混合，加热至80-85℃，搅拌均匀，得到a相；(2)将步骤(1)得到的a相冷却至40-45℃；(3)向步骤(2)获得的冷却后的a相中加入植物外泌体和动物外泌体并搅拌，然后进行冷冻干燥，即得所述外泌体冻干粉。9.如权利要求1-7任一项所述的外泌体冻干粉在制备护肤品或化妆品中的用途。

技术总结
本发明涉及一种外泌体冻干粉及其制备方法与应用，所述外泌体冻干粉通过包含以下组分的原料制成：冻干保护剂、植物外泌体、动物外泌体及水，以重量份数计，冻干保护剂1-15份、植物外泌体0.01-6份、动物外泌体10-60份、水19-88.99份，所述冻干保护剂为甘露醇、海藻糖、葡聚糖中的至少一种。本发明提供的外泌体冻干粉常温活性稳定，其中的动物外泌体在进行细胞修护的同时，马齿苋外泌体也可以直接进入细胞内部起作用，进一步提升了舒缓功效。进一步提升了舒缓功效。进一步提升了舒缓功效。


技术研发人员：张婷婷
受保护的技术使用者：西安博鸿生物技术有限公司
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/10/15