一种DHA-PS制剂、制备方法及其应用

一种dha-ps制剂、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及天然产物技术领域，尤其是涉及一种dha-ps制剂、制备方法及其应用。


背景技术：

2.dha-ps为磷脂酰丝氨酸型dha，是一种富含dha的特殊海洋磷脂，其分子结构中通过酯乙酰基与dha结合，不同来源的dha-ps中的酯乙酰残基不同，因此dha-ps不是单一组分化合物，而是一类化合物，现有技术《富dha-磷脂酰丝氨酸对高脂饮食诱导的肝肾损伤及肠道菌群紊乱的修复作用》中公开了dha-ps在治疗肝部脂肪代谢异常以及肾损伤中的具有良好的应用效果。
3.环磷酰胺(ctx)是临床上应用及其广泛的光谱烷化剂类抗肿瘤药物，对实体瘤等症状有疗效，但其代谢产物丙烯醛的毒性会引起受治患者产生药物性肝、肾组织损伤，其主要表现为血清转氨酶升高和肝肾组织抗氧化功能降低，且长时间使用会对受治患者骨髓及免疫系统造成不可逆的损伤，ctx副作用较大致死率较高。
4.目前能够有效抑制ctx引发的肝肾损伤的产品较少，现有技术《藻蓝蛋白对环磷酰胺致小鼠肝肾损伤的保护作用》中指出了藻蓝蛋白对ctx致小鼠肝肾损伤具有明显的改善作用，目前能够有效抑制ctx引发的肝肾损伤的天然产物较少，其中dha-ps是活性较高的一类天然产物，且现有技术中也公开了其对肝肾损伤具有较好的改善作用，当目前dha-ps在ctx引发的肝肾损伤的应用中作用如何产生的效果如何并未公开。


技术实现要素：

5.本技术针对现有技术中未公开dha-ps在ctx引发的肝脏损伤的应用，提供了一种dha-ps制剂、制备方法及其应用，该制剂的有效分为dha-ps，该制剂中的dha-ps能够恢复ctx引发的小鼠肝脏损伤。
6.本发明的具体技术方案为：一种dha-ps制剂，包括主料和辅料，所述主料的有效成分包括dha-ps，所述有效成分可恢复ctx引发的小鼠肝脏损伤。
7.作为优选，所述dha-ps制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂和粉剂中的一种。
8.本技术提供的dha-ps制剂优选为口服一种dha-ps制剂的制备方法，包括以下制备步骤：将主料和辅料混合均匀后压制成dha-ps片剂。
9.作为优选，所述主料按质量份数计包括1～2份的dha-ps。
10.作为优选，所述辅料按质量份数计包括9～18份的淀粉、0.25～0.5份的羧甲基纤维素钠、0.25～0.5份的微晶纤维素以及0.1～0.2份的抗氧化剂。
11.本技术提供了一种dha-ps的片剂制备方法，该方法中的主料为dha-ps，辅料为常见的药物载体辅料，通过压片工艺将主料与辅料的混合物压制成dha-ps片剂，该片剂复合
《中国药典》的要求。
12.一种dha-ps制剂和dha-ps制剂的制备方法在抑制ctx引发的肝脏损伤中的应用。
13.作为优选，该应用能够显著降低小鼠肝脏损伤时的血清肝功能指标，所述血清肝功能指标包括alt和ast。
14.作为优选，该应用能够显著降低小鼠肝脏损伤时的促炎因子，所述促炎因子包括il-6、il-1β和tnf-α中的一种或几种，该应用能够显著增加抗炎因子的分泌，所述炎症作用为促进分泌和抑制抗炎因子分泌，所述抗炎因子为il-10。
15.作为优选，该应用能够显著降低小鼠肝脏损伤时mda含量，该应用能够显著增加内源性抗氧化酶含量，所述内源性抗氧化酶包括sod、cat和gsh-px中的一种或几种。
16.本技术还提供了一种上述dha-ps制剂和dha-ps制剂制备方法的应用，该应用提供了一种dha-ps制剂在恢复ctx引发的小鼠肝脏损伤中应用模型，该应用中使用上述dha-ps制剂对ctx引发肝脏损伤的小鼠进行处理，处理后的小鼠与未处理的小鼠相比，血清肝功能指标alt和ast显著降低，小鼠肝脏损伤作用得到恢复，促炎因子il-6、il-1β和tnf-α显著降低，抗炎因子il-10显著增加，炎症因子作用得到控制，肝脏中促炎因子小鼠肝脏损伤得到恢复，内源性抗氧化酶含量增加，丙二醛(mda)含量显著降低。本技术中发现能够通过调节损伤肝脏中的内源性抗氧化酶含量来调控mda含量，通常ctx在经过脂质的过氧化作用后，会生成丙烯醛类物质，最终氧化为mda，mda会引起蛋白质、核酸等生命大分子发生交联聚合，具有极强的细胞毒性。本技术的制剂在应用在ctx引发肝脏损伤的小鼠上后，能够显著提高小鼠肝脏中内源性抗氧化酶的表达，从而抑制ctx在小鼠肝脏中氧化生成mda的代谢途径，达到降低ctx氧化生成mda途径对小鼠肝脏产生损伤的作用。
17.作为优选，该应用中的应用剂量为0～100mg/kg ctx。
18.与现有技术相比，本技术具有以下技术效果：(1)本技术提供的dha-ps制剂恢复ctx引发的小鼠肝脏损伤；(2)本技术提供的dha-ps制剂制备方法制备得到的dha-ps片剂符合《中国药典》的各项指标；(3)本技术提供的应用表明本技术提供的dha-ps制剂及制备方法应用在ctx引发肝脏损伤的小鼠中时，能够恢复小鼠的肝脏损伤作用，通过dha-ps制剂增加小鼠肝脏中内源性抗氧化酶的含量降低ctx氧化生成mda途径对小鼠肝脏产生损伤的作用，通过dha-ps制剂增加抗炎因子降低促炎因子来抑制小鼠损伤肝脏的炎症作用。
附图说明
19.图1是本发明的dha-ps制剂处理ctx引发肝脏损伤小鼠的血清肝功能指标柱形图。
20.图2是本发明的dha-ps制剂处理ctx引发肝脏损伤小鼠的炎症作用指标柱形图。
21.图3是本发明的dha-ps制剂处理ctx引发肝脏损伤小鼠的氧化酶应激指标柱形图。
22.图4是本发明的dha-ps制剂处理ctx引发肝脏损伤小鼠的肝脏组织病理切片图。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
24.实施例1：
一种dha-ps制剂，包括主料和辅料，主料的有效成分包括dha-ps，dha-ps制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂和粉剂中的一种；一种dha-ps制剂的制备方法，包括以下制备步骤：按质量份数计，将2份的dha-ps粉末与18份可压性淀粉混合均匀后，再加入0.5份的微粉纤维素和0.5份的羧甲基纤维素钠以及0.2份的抗氧化剂充分研磨均匀后，倒入压片机压片制成dha-ps片剂；一种上述dha-ps制剂和dha-ps制剂的制备方法在恢复ctx引发的小鼠肝脏损伤中的应用，包括以下步骤：对小鼠进行ctx腹腔注射处理，ctx处理完成后在使用上述dha-ps片剂口服摄入处理，dha-ps制剂口服摄入处理的剂量为100mg/kg。
25.实施例2：一种dha-ps制剂，包括主料和辅料，主料的有效成分包括dha-ps，dha-ps制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂和粉剂中的一种；一种dha-ps制剂的制备方法，包括以下制备步骤：按质量份数计，将2份的dha-ps粉末与18份可压性淀粉混合均匀后，再加入0.5份的微粉纤维素和0.5份的羧甲基纤维素钠以及0.2份的抗氧化剂充分研磨均匀后，倒入压片机压片制成dha-ps片剂；一种上述dha-ps制剂和dha-ps制剂的制备方法在恢复ctx引发的小鼠肝脏损伤中的应用，包括以下步骤：对小鼠进行ctx腹腔注射处理，ctx处理完成后在使用上述dha-ps片剂口服摄入处理，dha-ps制剂口服摄入处理的剂量为50mg/kg。
26.实施例3：一种dha-ps制剂，包括主料和辅料，主料的有效成分包括dha-ps，dha-ps制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂和粉剂中的一种；一种dha-ps制剂的制备方法，包括以下制备步骤：按质量份数计，将1份的dha-ps粉末与9份可压性淀粉混合均匀后，再加入0.25份的微粉纤维素和0.25份的羧甲基纤维素钠以及0.1份的抗氧化剂充分研磨均匀后，倒入压片机压片制成dha-ps片剂；一种上述dha-ps片剂和dha-ps制剂的制备方法在恢复ctx引发的小鼠肝脏损伤中的应用，包括以下步骤：对小鼠进行ctx腹腔注射处理，ctx处理完成后在使用上述dha-ps片剂口服摄入处理，dha-ps制剂口服摄入处理的剂量为0mg/kg。
27.测试例：对实施例1中制得dha-ps片剂，进行质量检查，检查方法参照《中国药典》，测试指标包括脆碎度检测、崩解时限检测、重量差异检测、硬度检测以及活性评价。
28.外观检测：本技术提供的dha-ps片剂呈白色略带黄色，表面光滑均匀，无明显色斑，形状大小一致，本技术提供的dha-ps片剂外观检测符合《中国药典》的要求。
29.脆碎度检测检测步骤包括：取若干片完整均匀的dha-ps片剂，把dha-ps片上多余粉末搽拭干净后，进行精密称重并记录，。然后把dha-ps片剂放入智能片剂四用仪的圆筒中，开始转动后，转数到达100次后停止运转，再把dha-ps片剂取出，同样把上面所带有粉末搽拭干净，并再次进行精密称重。然后用第一次所得重量减去第二次所得重量，减少的重量不能超过第一次所得重量不能超过1％，并且片剂不能出现破碎、断裂等情况，若无上述情况，则认为合格；检测结果表明，初始状态时的dha-ps片剂总重量为3.008g，智能片剂四用仪进行脆碎度
检测后的dha-ps片剂总重量为3.001g，减轻的重量为0.23％(《1％)，且未出现碎裂或断裂的dha-ps片，本技术提供的dha-ps片剂的脆碎度检查符合《中国药典》的要求。
30.崩解时限检侧将崩解仪的水槽水温度调节至37
±
1℃，升降篮取出，并放入6片均匀完整的dha-ps片剂，等温度达到设定值后，再将升降篮放入崩解仪中，并开启仪器同时开始计时。当升降篮中的dha-ps片完全溶解后且没有细小碎片，则停止计时，所得时间即为dha-ps片剂的崩解时限；检测结果表明，当温度到达设定值后，将装有dha-ps片的升降篮放入的崩解仪中，开始测定并计时，当dha-ps片完全溶解，并且升降篮中没有出现细小碎片和不溶物，则停止计时。最后测得dha-ps片的崩解时限为5分12秒，没有超出15分钟，本技术提供的dha-ps片剂的崩解时限检查符合《中国药典》的要求。
31.重量差异检测取20片均匀完整的dha-ps片剂，精密称重20片的总重量以及各片重量，然后计算出平均重量以及相应的重量差异。比较每片重量和重量差异范围，若超出重量差异范围的片剂少于两片且都没有超出规定限度的一倍，则认为重量差异检查合格，重量差异测试结果见表1；表1重量差异检测结果如表1所示，测试后的dha-ps片剂的平均片重为0.200g，《中国药典》中规定片重差异限度为0.215g～0.185g，测试后的dha-ps片剂无重量低于片重差异限度且无重量超出重量差异限度的1倍，因此，本技术提供的dha-ps片剂的重量差异检查符合《中国药典》的要求。
32.硬度检测取3片均匀完整的dha-ps片剂，并直立放入智能片剂四用仪中，然后开启仪器，对dha-ps片剂进行硬度测试，得到每片的硬度并计算平均值，硬度检测结果见表2；表2硬度检测结果序号123平均值硬度(n)152153152152.3如表2所示，可得dha-ps片剂的平均硬度为152.3n，符合《中国药典》的要求。
33.活性评价步骤：小鼠模型建立：
6周龄雄性icr小鼠(15-17g)购自杭州子源实验动物科技有限公司，动物实验经浙江海洋大学动物伦理委员会批准(许可证no.2023004)。所有小鼠均置spf级动物房中饲养，动物房恒定湿度(60
±
5％)和温度(23
±
2℃)，连续12小时光照/黑暗循环；经过一周的适应性喂养后，将小鼠随机分为3组(n＝8)：正常组(con)、模型组(mod)和dha-ps组(dha-ps，100mg/kg)。整个实验周期为19天，前5天con组腹腔注射给予0.1ml 0.9％生理盐水，其余组分别腹腔注射给予同等体积的80mg/kg ctx；后7天dha-ps组灌胃给予100mg/kg dha-ps，而正常组和模型组灌胃给予等量生理盐水。此外，每日收集并记录小鼠饲料摄入量和饮水摄入量，监测并记录小鼠体重变化。实验结束时，所有小鼠禁食12h后采用颈椎脱臼法处死，完整取出肝脏。同时，收集小鼠血清，置-80℃保存以供进一步研究；小鼠血清肝功能指标检测：通过眼眶取血收集小鼠新鲜全血，在4℃条件下经5000rpm离心10min，获取血清，将血清分装后保存至-80℃备用。按照相应试剂盒说明书，对血清ast和alt指标进行测定；如图1所示，血清ast和alt用于评估肝脏功能状态，ctx诱导小鼠血清alt和ast显著提高(p《0.01)，表明ctx引起了小鼠的肝脏功能异常；而相比于ctx组，dha-ps组血清肝功能指标显著降低(alt：17.69
±
2.77vs 29.19
±
3.99u/l，p《0.01；ast：15.83
±
1.45vs 33.27
±
3.16u/l，p《0.01)，这表明dha-ps能够改善ctx诱导的肝功能异常，这表明本技术提供的dha-ps制剂在能够恢复ctx引发的小鼠肝脏损伤，小鼠肝脏功能经过dha-ps制剂处理后得到了有效恢复。
34.小鼠肝脏炎症作用指标检测称取适量小鼠肝脏组织，使用手持均质仪和适量生理盐水制备成10％的组织匀浆，根据bca试剂盒说明书测定组织匀浆蛋白浓度，按照elisa试剂盒制造商提供的方法测定肝组织匀浆中炎症因子il-10、il-6、il-1β及tnf-α的表达水平；如图2所示，与con组相比，ctx组中的il-10水平显著降低，il-6、il-1β以及tnf-α水平显著升高(p《0.01)。而给予dha-ps干预处理后，肝脏il-10(6298.93
±
82.79vs 4187.87
±
217.40pg/ml，p《0.01)水平显著升高，il-6(1204.83
±
14.36vs 2157.86
±
33.93pg/ml，p《0.01)、il-1β(39.97
±
0.94vs 102.52
±
1.61pg/ml，p《0.01)以及tnf-α(29.64
±
0.27vs 66.23
±
1.22pg/ml，p《0.01)水平显著降低；上述结果表明本技术提供的dha-ps制剂可以通过调节炎症因子的表达来改善ctx诱导的肝脏损伤。
35.小鼠肝脏氧化应激指标检测：称取适量小鼠肝脏组织，使用手持均质仪和适量生理盐水制备成10％的组织匀浆，根据bca试剂盒说明书测定组织匀浆蛋白浓度，按照相应试剂盒说明书，测定肝组织匀浆cat、sod、mda及gsh-px水平；如图3所示，与con组相比，ctx组mda水平显著升高，而cat、sod以及gsh-px活力显著降低(p《0.01)。而dha-ps治疗后可显著减少mda(2.15
±
0.17vs 2.76
±
0.14nmol/mgprot，p《0.01)表达，提高cat(38.15
±
0.34vs 25.85
±
0.25u/mgprot，p《0.01)、sod(10.69
±
1.02vs 7.71
±
0.21u/mgprot，p《0.01)以及gsh-px(345.78
±
19.70vs 235.09
±
8.68u/mgprot，p《0.01)活力，上述结果表明，本技术提供的dha-ps制剂可增强增加小鼠肝脏中内源性抗氧化酶的含量降低ctx氧化生成mda途径对小鼠肝脏产生损伤的作用。
36.小鼠肝脏组织病理学切片分析
处死小鼠后，取出肝脏组织，将组织进行适当的修剪后置4％多聚甲醛中固定24小时，再参照相关研究人员的方法对肝脏组织进行脱水、包埋以及切片，随后按照试剂盒说明书进行h&e染色，最后在显微镜cx31(奥林巴斯，东京，日本)下拍摄照片并分析；如图4所示，h&e染色显示dha-ps对ctx诱导的肝损伤有改善作用。如图4所示，con组小鼠肝小叶结构完整，肝细胞分布整齐，肝索呈放射状排列；而mod组小鼠肝小叶结构模糊，肝索排列紊乱，并伴有大量炎症细胞浸润现象，这表明ctx导致了小鼠肝脏正常结构的破坏。而给予dha-ps后，上述肝脏组织病变显著减少，表明dha-ps能够改善ctx诱导的小鼠肝脏损伤。
37.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

技术特征：
1.一种dha-ps制剂，包括主料和辅料，其特征是，所述主料的有效成分包括dha-ps，所述有效成分可恢复环磷酰胺引发的小鼠肝脏损伤。2.如权利要求1所述的一种dha-ps制剂，其特征是，所述dha-ps制剂的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂和粉剂中的一种。3.一种如权利要求1~2任一所述的dha-ps制剂的制备方法，其特征是，包括以下制备步骤：将主料和辅料混合均匀后压制成dha-ps片剂。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述主料按质量份数计包括1~2份的dha-ps。5.如权利要求3所述的制备方法，其特征是，所述辅料按质量份数计包括9~18份的淀粉、0.25~0.5份的羧甲基纤维素钠、0.25~0.5份的微晶纤维素以及0.1~0.2份的抗氧化剂。6.一种如权利要求1~2任一所述的dha-ps制剂和权利要求3~5任一所述的dha-ps制剂的制备方法在恢复环磷酰胺引发的小鼠肝脏损伤中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征是，该应用能够显著降低小鼠肝脏损伤时的血清肝功能指标，所述血清肝功能指标包括alt和ast。8.如权利要求6所述的应用，其特征是，该应用能够显著降低小鼠肝脏损伤时的促炎因子，所述促炎因子包括il-6、il-1β和tnf-α中的一种或几种，该应用能够显著增加抗炎因子的分泌，所述炎症作用为促进分泌和抑制抗炎因子分泌，所述抗炎因子为il-10。9.如权利要求6所述的应用，其特征是，该应用能够显著降低小鼠肝脏损伤时mda含量，该应用能够显著增加内源性抗氧化酶含量，所述内源性抗氧化酶包括sod、cat和gsh-px中的一种或几种。10.如权利要求6所述的应用，其特征是，该应用中的应用剂量为0~100 mg/kg。

技术总结
本发明涉及天然产物制剂技术领域，公开了一种DHA-PS制剂、制备方法及其应用，该制剂的主料有效成分包括DHA-PS，该制剂具备恢复环磷酰胺引发的小鼠肝脏损伤；本申请提供的DHA-PS制剂制备方法制备得到的DHA-PS片剂符合《中国药典》的各项指标；本申请提供的应用表明本申请提供的DHA-PS制剂及制备方法应用在CTX引发肝脏损伤的小鼠中时，能够恢复小鼠的肝脏损伤作用，通过DHA-PS制剂增加小鼠肝脏中内源性抗氧化酶的含量降低CTX氧化生成MDA途径对小鼠肝脏产生损伤的作用，通过DHA-PS制剂增加抗炎因子降低促炎因子来抑制小鼠损伤肝脏的炎症作用。作用。作用。


技术研发人员：唐云平 韩涛 王骥腾 陈强 余方苗 杨最素 陈艳
受保护的技术使用者：浙江海洋大学
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/15