脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计的制作方法

1.本发明涉及组织工程技术领域，尤其是涉及脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计。


背景技术：

2.目前的大多数尿道组织工程支架缺乏合适的微孔结构来诱导尿道平滑肌细胞的双向排列的再生。wei jia等采用静电纺丝法制备了聚乳酸-乙醇酸共聚物(plga)基无序多孔结构尿道支架。在狗的模型中将这些支架作为尿道替代物以评价其效果，结果显示形成了疤痕组织，以及尿道上皮层的不完全的再生，只有有限程度的结构紊乱的平滑肌再生。与大多数合成材料聚合物相比，脱细胞细胞外基质(decm)为细胞渗透和内源性组织再生提供了有益的环境，因为其在成分、微观结构和生物力学性能方面与天然尿道相似。j.chen等人制备了脱细胞膀胱粘膜下层，并评价了其重建尿道的能力。由于脱细胞膀胱黏膜下层结构致密，只有少数细胞渗透到脱细胞膀胱基质支架中。l.song等人通过用5％过氧乙酸处理来改善脱细胞膀胱基质(dbm)的孔隙率和孔径。尽管他们观察到完整的尿道上皮再生，但再生的平滑肌结构仍然是杂乱无章和离散的。koichiro等人将取向排列的石英纤维放入圆柱形玻璃模具中，用合成的柔性高分子材料p(cl-co-dlla)溶液浇筑石英纤维的空隙，80℃加热2h后p(cl-co-dlla)交联固化，从圆柱形模具中取出p(cl-co-dlla)与石英纤维的复合物，用氢氟酸洗脱石英纤维，即可得到具有微通道结构的p(cl-co-dlla)支架材料。s.chen等人将消化处理的dbm与微纤化的细菌纤维素冷冻干燥，制备了多孔支架，细菌纤维素的加入增加了dbm的孔径和孔隙率。在兔尿道重建模型中，这些多孔dbm支架可促进尿路上皮再生和血管生成。然而，尿道平滑肌再生是不充分的和无序的。尿道平滑肌再生的不充分和无序可能与失禁和尿道狭窄的发生有关。因此，进一步的研究应该集中在构建具有适当结构的支架上，以通过必要的方法使尿道上皮和平滑肌像天然尿道一样再生。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其管状decm支架具有良好的生理功能和机械性能，具有多种天然尿道的生理功能，有望研发成为满足临床治疗要求的人工尿道材料。
4.为实现上述目的，本发明提供了脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，包括如下步骤：
5.s1、获取兔天然尿路平滑肌的组织结构特征；
6.s2、研究聚合物模板的结构参数对支架的影响规律；
7.s3、制备聚合物纤维模板；
8.s4、通过体内组织化和脱细胞处理制备管状decm支架；
9.s5、在管状decm支架上种植人膀胱平滑肌细胞；
10.s6、检测在管状decm支架上培养的平滑肌细胞的功能蛋白表达。
11.优选的，在步骤s1中，取一段兔尿路，用来表征尿路组织，通过冰冻切片法，并根据α-sma抗体染色的免疫荧光图像，定量分析兔平滑肌束的直径、结构走行和空间关系。
12.优选的，在步骤s2中，以pcl为原料，在医用硅胶管上制备了三种不同纤维排布角度的聚合物纤维模板；在扫描电子显微镜下观察聚合物纤维模板的孔隙率，将聚合物纤维模板植入大鼠皮下，观察组织化进程对埋植部位的生理影响；取出管状decm支架，在体视显微镜下探究管腔及管壁的形态参数，初步评价管状decm支架的弹性及力学性能。
13.优选的，在步骤s3中，首先将a型明胶溶解在超纯水中，在60
°
c下搅拌30min，得到25％w/v的溶液，然后，将明胶溶液滴落涂布在外直径为3mm、100rpm转速和前进速度5cm/min的硅胶管的外表面上，并将明胶在室温下固化8h；以pcl为原料，以裸硅胶管和包裹明胶涂层的硅胶管为接收器，通过纵向片状纺丝条带包裹和环状纺丝分别制成模板的双层结构，制备出参数相同，纤维直径不同的三种聚合物纤维模板，分别将大、中、小直径的双层pcl纤维骨架包裹的明胶硅胶管定义为g-template-l，g-template-m和g-template-s；
14.用体视显微镜观察聚合物纤维模板的宏观图像，用扫描电子显微镜分析了聚合物纤维模板在15kv加速电压下的形态和结构；使用image-pro plus软件，基于扫描电子显微镜图像测量了管状decm支架的形态参数，主要包括明胶层厚度、内外纤维层厚度和纤维直径。
15.优选的，在步骤s4中，将聚合物纤维模板灭菌后，用小切口植入小动物皮下埋植，于4周的时间点将聚合物纤维模板材料连同周围的包裹组织一起取出，移除硅胶管并清理残余pcl纤维，经脱细胞即可制得管状decm支架；
16.用体视显微镜观察管状decm支架的宏观图像，用sem和ipp软件分析了管状decm支架，主要包括壁厚、模板纤维直径、微通道尺寸和管腔表面孔隙率；对所获得管状decm支架进行渗漏试验；从应力-应变曲线测量力学参数，包括抗拉强度和杨氏模量，通过测量弹性范围内应力-应变曲线的斜率，得到杨氏模量；分别用biocolol胶原法、fastin弹性蛋白法和blyscan糖胺聚糖试剂盒检测decm支架的胶原蛋白、弹性蛋白和硫酸糖胺聚糖。
17.优选的，用剂量为25kgy的co-60对聚合物纤维模板进行γ辐照灭菌后，将三种聚合物纤维模板分别用小切口植入大鼠或兔的皮下，所有动物均于植入4周后安乐死并取出组织化的聚合物纤维模板；
18.清理残余pcl和脱细胞过程简单叙述：将组织化的聚合物纤维模板取出后磷酸盐缓冲盐水pbs清洗，用乙醇梯度浓度脱水后，将硅胶管从组织化的聚合物纤维模板中移除；组织化的聚合物纤维模板中的残余pcl纤维通过在氯仿中温和摇动来清洗，循环4次，每次12h，然后用乙醇梯度浓度进行再水化来去除组织化的聚合物纤维模板中的残余pcl纤维，并用蒸馏水冲洗；
19.然后在无菌条件下对不含聚合物纤维的组织化的聚合物纤维模板进行脱细胞处理；将组织化的聚合物纤维模板放置在1％十二烷基硫酸钠的pbs无菌溶液中，循环6次，每次2小时；间隔3h后，在无菌pbs中清洗72h；用溶解了4u/ml dnase i的pbs在37℃下处理管状decm支架，每次12h，然后无菌pbs清洗3次，每个周期4h；所有上述步骤均在4℃连续摇动下进行，管状decm支架冷冻干燥48h进行结构分析，剩余管状decm支架储存在4℃下供后续使用；
20.用g-template-l，g-template-m和g-template-s制备的管状decm支架分别命名为
decm-gtl、decm-gtm和decm-gts。
21.优选的，在步骤s5中，将管状decm支架切割成圆盘，用于体外细胞培养，将细胞接种在冷冻干燥的decm支架圆盘上；用细胞计数试剂盒8检测接种于decm支架上1、3、7d的细胞增殖情况；细胞培养7d后，用鬼笔环肽-af488标记和dapi染色观察细胞骨架结构，以进行细胞形态分析；第7天用imagej软件测量细胞核的扩散面积和周长，计算细胞核形态指数nsi；decm支架样品冰冻切片后he染色和masson三色染色以进行组织学分析。
22.优选的，在步骤s6中，在细胞在支架上培养的第7天，在冰上加入细胞裂解缓冲液提取细胞总蛋白；使用小鼠抗β-肌动蛋白抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg抗体测定分离的肌球蛋白重链myh蛋白表达及其调控规律。
23.因此，本发明采用上述脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其管状decm支架具有良好的生理功能和机械性能，具有多种天然尿道的生理功能，有望研发成为满足临床治疗要求的人工尿道材料。
24.下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
25.图1是本发明的总体技术路线图；
26.图2是本发明兔天然尿道平滑肌的特性研究图；
27.图3是本发明用扫描电子显微镜观察了三种缠绕角度的模板的外表面图；
28.图4是本发明三种纤维缠绕角度的模板形态表征图；
29.图5是本发明大鼠皮下植入后背部创面愈合的过程图；
30.图6是本发明组织化支架的形态特征图；
31.图7是本发明对pcl模板和组织化支架的管壁厚度(左)和内径(右)进行定量分析图；
32.图8是本发明硅胶管上涂有明胶的双层pcl纤维模板的外观表征图；
33.图9是本发明明胶层厚度定量分析图；
34.图10是本发明定量分析内、外取向pcl纤维的层厚图；
35.图11是本发明pcl内、外纤维直径定量分析图；
36.图12是本发明手术组、假手术组和正常组对比图；
37.图13是本发明扫描电子显微镜下的decm支架的横截面、纵截面和外表面图；
38.图14是本发明对管状decm支架的力学性能进行表征(抗拉强度和杨氏模量)图；
39.图15是本发明管状decm支架残留dna定量分析图；
40.图16是本发明westernblotting分析图；
41.图17是本发明细胞在管状decm支架上种植示意图，显示纵向微通道(i)和周向微通道(ii)；
42.图18是本发明cck-8法检测hbdsmc在管状decm支架上的增殖图；
43.图19是本发明hbdsmc免疫荧光染色图；
44.图20是本发明免疫印迹分析平滑肌细胞标记物myh在第7天的表达图；
45.图21是本发明半定量分析hbdsmcs myh表达图。
具体实施方式
46.以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
47.除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
48.实施例一
49.如图1所示，本发明提供了脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，包括如下步骤：
50.s1、获取兔天然尿路平滑肌的组织结构特征。
51.人天然尿道壁的平滑肌是一种双层双向结构，由与上皮层紧密附着的纵向走行的内层平滑肌和位于外层的环状走行平滑肌层组成。
52.兔的麻醉采取静脉注射麻醉，注射戊巴比妥钠溶液(30mg/kg)。
53.在距尿道口2cm处取兔尿路，用来表征尿路组织。将兔尿路固定在4％多聚甲醛中，在最佳切割温度(oct)化合物(tissue tek)下冰冻切片，切片厚度为6μm，与小鼠抗α-平滑肌肌动蛋白(a-sma，1：100，abcam7817，美国)一抗在4℃孵育过夜，用pbs冲洗5次后，以alexa fluor 594山羊抗鼠免疫球蛋白(1：200，invitrogen,)为二抗。未与一抗孵育的切片作为阴性对照。用含有固定液的dapi(dapi-fluoromount-g，southern biotech，英格兰)对细胞核进行复染色。在荧光显微镜(zeissaxio imagerz1，德国)下观察载玻片，并用数码相机(axio cam mrm，德国)获取图像。根据α-sma抗体染色的免疫荧光图像，测量时至少包含5个样本，每个样本5个图像，每个图像3个平滑肌束，以定量分析兔平滑肌束的直径。对于环向排列的平滑肌束，利用横截面免疫荧光图像计算其直径。对于纵向排列的平滑肌束，用纵截面免疫荧光图像计算其直径。
54.在此，α-sma免疫荧光染色图像显示，兔天然尿道平滑肌由纵向内层和环状外层组成，如图2所示，这与以前的报道一致，与人的尿道相似。定量分析表明，正常兔尿路平滑肌的内层和外层的肌束的直径相近，约为60μm。
55.s2、研究聚合物模板的结构参数对支架的影响规律。
56.采用自制的熔融纺丝系统，以pcl(mn＝70,000-90,000da；
57.sigma-aldrich；us)为原料，在医用硅胶管上制备了pcl纤维模板，在此次熔融纺丝过程中，先通过外加热器将腔室中的pcl颗粒加热到120℃，以产生聚合物熔体，喷丝头是一根16g的钝头针，在120
°
c的纺丝温度下进行熔融纺丝。
58.制备了不同缠绕夹角(小、中、大)的纤维模板，小角度(30.48
°±
1.48
°
)、中角度(53.81
°±
2.12
°
)、大角度(111.50
°±
2.77
°
)，如图3所示。
59.根据扫描电子显微镜(phenom pro,netherlands)的图像进行测量，每个样本至少5张图像。所有模板的纤维的直径相似，如图4a，变异程度较小(≈60μm)，且与不同的纤维缠绕角度无关，如图4b。纤维缠绕角越大，孔径越大。所有模板的孔径都在100μm以上，如图4c，这可以促进细胞快速渗透生长。
60.大鼠手术前腹腔麻醉，注射戊巴比妥钠(60mg/kg)。将所有模板通过小切口植入大鼠背侧皮下后缝合，以评价其通过组织化形成支架的能力。皮下植入后，大鼠伤口迅速愈合，模板并未引起植入部位发生肿胀等不良反应，如图5所示。
61.皮下植入后30天，体视显微镜和苏木精-伊红(h&e)分析显示，所有的模板中都充
满了宿主动物的组织和细胞，如图6所示。通过比较模板的外表面，我们观察到，皮下植入后30天，所有类型的模板都保持了原有的纤维结构。不同类型的支架的壁厚均约为440μm，与组织化前的原始模板相比，壁厚增加了约90μm，每种类型的支架的内径都显示出可以忽略的变化，如图7所示。这些结果说明，通过构建pcl支架后在体内组织化可以制成具有可用性的组织化支架。
62.对组织化支架进行初步的弹性性能测试。所有类型的支架在被挤压、扩张、拉伸或折叠后都能恢复初始的形状。在扩张时，与中角度支架和大角度支架相比，小角度支架因径向包裹的纤维较致密，缺乏径向弹性，故小角度支架的扩张形变能力较差。在拉伸时，与中角度支架和小角度支架相比，大角度支架的拉伸形变能力较差。在180
°
折叠后，在大角度支架中，轴向包裹的纤维致密，缺乏轴向弹性，导致在折叠时形成蜷曲。中角度支架在径向和轴向均具有良好的弹性，经挤压、扩张和拉伸后容易恢复原始形状，在180
°
折叠时可保持管腔通畅而不发生蜷曲。
63.根据先前的报告，使用负荷能力为100n(instron-33)的拉伸试验机测试了从大鼠获得的支架的纵向和径向机械性能。在纵向力学性能方面，以20mm/min的速率纵向拉伸3.0cm长的大鼠支架，直至断裂。对于径向力学性能，取自大鼠的0.3cm长的支架固定在两个钢环上，用机器卡盘夹紧，然后以10mm/min的速度径向拉伸，直到断裂。测定了支架的极限拉伸应力和极限断裂伸长率。将极限拉伸以拟设定为应力-应变曲线的峰值应力。根据应力-应变曲线计算杨氏模量。对径向和轴向力学性能(杨氏模量、拉伸应力和断裂伸长率)的综合分析表明，中角度支架的力学性能与天然组织空腔管状结构最相似。这些结果表明，中角度支架作为一种候选支架材料具有相对最佳的力学性能，因此，在随后的实验中只选择中角度纤维排布模板。
64.s3、制备聚合物纤维模板。
65.将a型明胶(meilunbio；中国)溶解在超纯水中，在60℃下搅拌30min，得到25％w/v的溶液。然后，将明胶溶液滴落涂布在外直径为3mm、100rpm转速和前进速度5cm/min的硅胶管的外表面上。将明胶在室温下固化8h。在直径4.0cm的旋转铝合金棒上制备纵向排列的片状模板，然后将其切割成宽度适当的矩形条带，使其可以包裹在外直径为3mm的裸硅胶管上。接下来，将周向取向的pcl纤维通过相同的熔融纺丝制备在纵向取向pcl纤维的外层，最后即可获得具有明胶层的双层取向的聚合物纤维模板，通过调节纺丝工艺参数，制备了三种不同直径的pcl纤维，分别将大、中、小直径的双层pcl纤维骨架包裹的明胶硅胶管定义为g-template-l，g-template-m和g-template-s，制备pcl纤维模板的参数如表1所示。
[0066][0067]
如图8所示，展示了三种不同直径的纤维在体视显微镜(leica s8ap0，germany)下都表现出良好的完整性。用扫描电子显微镜分析了双层pcl纤维模板在15kv加速电压下的形态和结构。三种双层pcl纤维模板横截面的扫描电子显微镜图像显示，在双层pcl纤维骨架中，在纵向(内层)和周向(外层)都形成了明确的纤维排列。
[0068]
使用扫描电子显微镜测量明胶层厚度为240μm，三组明胶层厚度差异无统计学意义，如图9所示。所有双层pcl纤维模板的内外pcl纤维层的厚度相似，差异较小(≈450μm)，如图10所示，与不同的纤维直径无关。g-template-l，g-template-m和g-template-s的pcl纤维直径分别为260.23
±
2.54μm、167.67
±
3.89μm和64.93
±
2.17μm，图11所示。
[0069]
植入双层pcl纤维模板的大鼠的体温与假手术组(手术组)和正常组(非手术组)相当，如图12所示。另一方面，与假手术组和正常组相比，大鼠体重增加，这意味着明胶涂层的加入不会刺激宿主体内的严重炎症。
[0070]
s4、通过体内组织化和脱细胞处理制备管状decm支架。
[0071]
用剂量为25kgy的co-60对聚合物纤维模板进行γ辐照灭菌后，将三种聚合物纤维模板分别用小切口植入大鼠或兔的皮下，所有动物均于植入4周后安乐死并取出组织化的聚合物纤维模板。
[0072]
清理残余pcl和脱细胞过程简单叙述：将组织化的聚合物纤维模板取出后磷酸盐缓冲盐水pbs清洗，用乙醇梯度浓度脱水后，将硅胶管从组织化的聚合物纤维模板中移除。组织化的聚合物纤维模板中的残余pcl纤维通过在氯仿中温和摇动来清洗，循环4次，每次12h，然后用乙醇梯度浓度进行再水化来去除组织化的聚合物纤维模板中的残余pcl纤维，并用蒸馏水冲洗。
[0073]
然后在无菌条件下对不含聚合物纤维的组织化的聚合物纤维模板进行脱细胞处理。将组织化的聚合物纤维模板放置在1％十二烷基硫酸钠的pbs无菌溶液中，循环6次，每次2小时。间隔3h后，在无菌pbs中清洗72h。用溶解了4u/ml dnase i的pbs在37℃下处理管状decm支架，每次12h，然后无菌pbs清洗3次，每个周期4h；所有上述步骤均在4℃连续摇动下进行，管状decm支架冷冻干燥48h进行结构分析，剩余管状decm支架储存在4℃下供后续使用。
[0074]
用g-template-l，g-template-m和g-template-s制备的管状decm支架分别命名为decm-gtl、decm-gtm和decm-gts。
[0075]
扫描电子显微镜照片表明，内层微通道是纵向排列的，而外层微通道是周向排列的，扫描电子显微镜进一步显示管状decm支架的管腔表面是完整和连续的，如图13所示。decm-gtl、decm-gtm和decm-gts支架微通道直径分别为268.08
±
8.68、160.50
±
3.73和59.99
±
4.36μm。此外，外层与内层的微通道直径相当。
[0076]
管状decm支架具有完整的管腔表面，有效地防止了液体渗漏。三种管状decm支架的渗漏压力均大于60cm
·
h2o，其中decm-gts支架的漏水压力最高(74.00
±
4.18cm
·
h2o)。
[0077]
为了分析管状decm支架的生物力学性能，进行了破裂压力、拉伸试验和缝合力实验。简单来说，用自制仪器测量破裂压力，方法是在长度为1cm的支架中填充凡士林，一端紧固，另一端密闭连接于改良管状decm支架上。应用13ml/min的恒定填充速度，并记录填充压力，直到支架壁破裂。对于每组，总共评估了五个样本以进行破裂压力测量。使用载荷能力为100n的拉伸试验机(instron-3345，norwood，ma，usa)测量管状decm支架的力学性能。支架(n＝5，规格长度1厘米)以5mm/min的应变率进行拉伸测试，直到断裂。可缝合性一般由有经验的外科医生来评价，此次进行缝合力实验，在距支架边缘2.0mm处用方结固定5-0缝线，并留下5cm自由端。将管状decm支架的一端固定在拉力试验机的夹子上，缝线自由端固定在另一夹子上。夹子之间的距离设置为5.0cm。速度设置为2.9mm/min，计算直到样品破裂的缝合线张力。每组使用5根缝线进行缝合保留试验。
[0078]
decm-gtl、decm-gtm和decm-gts支架的缝合力分别为2.50
±
0.21n、3.73
±
0.19n和3.43
±
0.22n，符合0.8n的手术要求。decm-gts的平均破裂压力为141.70
±
4.67kpa，显著高于decm-gtl(109.10
±
7.12kpa)和decm-gtm支架(125.20
±
8.56kpa)。管状decm支架排尿时的破裂压力明显高于闭合尿路内压力，说明管状decm支架具有足够的强度来防止排尿时的破裂。
[0079]
管状decm支架的抗拉强度和杨氏模量，如图14所示，随着微通道直径的减小而增加，两者都高于人的天然尿道性能，表明这些管状decm支架具有良好的机械性能。
[0080]
将管状decm支架固定在4％多聚甲醛中，并将其浸泡在最佳切割温度化合物中进行冷冻切片。将样品切成6μm切片。随后，切片进行苏木精-伊红(h&e)染色和masson’s三色染色
[0081]
h&e和masson
‘
s三色染色显示管状decm支架的细胞核被去除，胶原为主要成分。此外，两种类型的染色均显示所有管状decm支架中的微通道呈单向排列，这表明pcl纤维已被完全去除。
[0082]
用木瓜蛋白酶消化管状decm支架后，用改良的dnasy血液和组织试剂盒(qiagen，上海，中国)进行dna定量检测。三种管状decm支架在残留dna含量方面没有显著差异，如图15所示。残留dna含量在干组织重量的33.26至37.16ng/mg范围内，在可接受的水平(50ng/mg)。
[0083]
三种管状decm支架的十二烷基硫酸钠残留量(分别为湿体积的58.38
±
2.36、60.63
±
3.80和63.78
±
3.84μg/cm～3)也与其他临床使用的脱细胞支架相当。
[0084]
western印迹结果显示，管状decm支架脱细胞后未检测到细胞内蛋白——β-肌动蛋白和细胞膜相关蛋白-2-微球蛋白，如图16所示。这些结果表明，本研究制备的管状decm支架具有作为脱细胞产品的条件。
[0085]
s5、在管状decm支架上种植人膀胱平滑肌细胞。
[0086]
将管状decm支架切割成圆盘状，用于体外细胞培养。hbdsmcs(中国，上海)在含90％改良伊格尔氏培养基(gibco，life technologies，carlsbadca，ca，us)、10％胎牛血清(fbs，gibco，life technologies，carlsad，ca，us)和100iu/ml青霉素和100μg/ml链霉素(gibco，life technologies，carlsad，ca，ca，美国)的培养液中，37℃，5％二氧化碳条件下培养，如图17所示。
[0087]
随后，将细胞接种在冻干的decm支架圆盘上(1
×
105个/cm2)。用细胞计数试剂盒8(cck-8)检测接种于支架上第1、3、7天的细胞增殖情况。cck-8检测显示，在7天的体外培养期间，hbdsmc在三种不同大小的微通道支架上持续增殖，如图18所示。
[0088]
细胞培养7天后，用鬼笔环肽-af488标记(sigma-aldrich)和dapi(sigma-aldrich)染色观察细胞骨架结构，进行细胞形态分析，结果显示内外微通道分别诱导hbdsmc纵向(图19i)和周向(图19ii)生长。
[0089]
第7天用imagej软件v1.5(美国马里兰州nih)测量细胞核的扩散面积(s)和周长(l)，计算核形状指数(nsi)。nsi显示，无论微通道的直径如何，在纵向和周向排列的微通道上，细胞核都被拉长。此外，在decm-gts支架上培养的细胞的nsi明显低于种植在decm-gtl和decm-gtm支架上的细胞，这表明decm-gts支架对hbdsmcs的生长和排列具有最强的指导能力。
[0090]
s6、检测在管状decm支架上培养的平滑肌细胞的功能蛋白表达。
[0091]
第7天通过myh抗体免疫印迹法，检测在管状decm支架上培养的hbdsmcs的功能蛋白表达，如图20所示。简单来说，对于细胞接种的decm支架，在第7天加入细胞裂解缓冲液提取细胞总蛋白。裂解产物在4℃下以12000转/分的速度离心10分钟。收集培养上清液，采用碱性磷酸酶(bca)法(beyotime，中国)检测蛋白质浓度。蛋白质样品在热水浴中和十二烷基硫酸钠-page负载缓冲液煮沸后，用8％的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳法分离。然后，将分离的蛋白转移并与下一级抗体孵育：myh(1：1,000；abcam，英国剑桥)和小鼠抗β-肌动蛋白抗体(1：1,000；cell signaling technology，美国马萨诸塞州丹弗斯)。以辣根过氧化物酶标记的羊抗兔ig g(h+l)抗体(1：1,000；beyotime，上海，中国)和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ig g(h+l)抗体(1：5,000，beyotime，上海，中国)作为二抗。使用quantity one v.4.62软件(bio-rad laboratories，hercules，加利福尼亚州，美国)使用β-肌动蛋白作为蛋白质负载对照来定量所有条带的强度。
[0092]
统计分析表明，hbdsmcs的myh表达随着微通道直径的减小而增加，在decm-gts支架上培养的hbdsmcs的myh表达显著高于decm-gtl和decm-gtm支架，如图21所示。
[0093]
因此，本发明采用上述脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其管状decm支架具有良好的生理功能和机械性能，具有多种天然尿道的生理功能，有望研发成为满足临床治疗要求的人工尿道材料。
[0094]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其特征在于：包括如下步骤：s1、获取兔天然尿路平滑肌的组织结构特征；s2、研究聚合物模板的结构参数对支架的影响规律；s3、制备聚合物纤维模板；s4、通过体内组织化和脱细胞处理制备管状decm支架；s5、在管状decm支架上种植人膀胱平滑肌细胞；s6、检测在管状decm支架上培养的平滑肌细胞的功能蛋白表达。2.根据权利要求1所述的脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其特征在于：在步骤s1中，取一段兔尿路，用来表征尿路组织，通过冰冻切片法，并根据α-sma抗体染色的免疫荧光图像，定量分析兔平滑肌束的直径、结构走行和空间关系。3.根据权利要求1所述的脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其特征在于：在步骤s2中，以pcl为原料，在医用硅胶管上制备了三种不同纤维排布角度的聚合物纤维模板；在扫描电子显微镜下观察聚合物纤维模板的孔隙率，将聚合物纤维模板植入大鼠皮下，观察组织化进程对埋植部位的生理影响；取出管状decm支架，在体视显微镜下探究管腔及管壁的形态参数，初步评价管状decm支架的弹性及力学性能。4.根据权利要求1所述的脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其特征在于：在步骤s3中，首先将a型明胶溶解在超纯水中，在60℃下搅拌30min，得到25％w/v的溶液，然后，将明胶溶液滴落涂布在外直径为3mm、100rpm转速和前进速度5cm/min的硅胶管的外表面上，并将明胶在室温下固化8h；以pcl为原料，以裸硅胶管和包裹明胶涂层的硅胶管为接收器，通过纵向片状纺丝条带包裹和环状纺丝分别制成模板的双层结构，制备出参数相同，纤维直径不同的三种聚合物纤维模板，分别将大、中、小直径的双层pcl纤维骨架包裹的明胶硅胶管定义为g-template-l，g-template-m和g-template-s；用体视显微镜观察聚合物纤维模板的宏观图像，用扫描电子显微镜分析了聚合物纤维模板在15kv加速电压下的形态和结构；使用image-proplus软件，基于扫描电子显微镜图像测量了管状decm支架的形态参数，主要包括明胶层厚度、内外纤维层厚度和纤维直径。5.根据权利要求1所述的脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其特征在于：在步骤s4中，将聚合物纤维模板灭菌后，用小切口植入小动物皮下埋植，于4周的时间点将聚合物纤维模板材料连同周围的包裹组织一起取出，移除硅胶管并清理残余pcl纤维，经脱细胞即可制得管状decm支架；用体视显微镜观察管状decm支架的宏观图像，用sem和ipp软件分析了管状decm支架，主要包括壁厚、模板纤维直径、微通道尺寸和管腔表面孔隙率；对所获得管状decm支架进行渗漏试验；从应力-应变曲线测量力学参数，包括抗拉强度和杨氏模量，通过测量弹性范围内应力-应变曲线的斜率，得到杨氏模量；分别用biocolol胶原法、fastin弹性蛋白法和blyscan糖胺聚糖试剂盒检测decm支架的胶原蛋白、弹性蛋白和硫酸糖胺聚糖。6.根据权利要求5所述的脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其特征在于：用剂量为25kgy的co-60对聚合物纤维模板进行γ辐照灭菌后，将三种聚合物纤维模板分别用小切口植入大鼠或兔的皮下，所有动物均于植入4周后安乐死并取出组织化的聚合物纤维模板；清理残余pcl和脱细胞过程简单叙述：将组织化的聚合物纤维模板取出后磷酸盐缓冲
盐水pbs清洗，用乙醇梯度浓度脱水后，将硅胶管从组织化的聚合物纤维模板中移除；组织化的聚合物纤维模板中的残余pcl纤维通过在氯仿中温和摇动来清洗，循环4次，每次12h，然后用乙醇梯度浓度进行再水化来去除组织化的聚合物纤维模板中的残余pcl纤维，并用蒸馏水冲洗；然后在无菌条件下对不含聚合物纤维的组织化的聚合物纤维模板进行脱细胞处理；将组织化的聚合物纤维模板放置在1％十二烷基硫酸钠的pbs无菌溶液中，循环6次，每次2小时；间隔3h后，在无菌pbs中清洗72h；用溶解了4u/mldnasei的pbs在37℃下处理管状decm支架，每次12h，然后无菌pbs清洗3次，每个周期4h；所有上述步骤均在4℃连续摇动下进行，管状decm支架冷冻干燥48h进行结构分析，剩余管状decm支架储存在4℃下供后续使用；用g-template-l，g-template-m和g-template-s制备的管状decm支架分别命名为decm-gtl、decm-gtm和decm-gts。7.根据权利要求1所述的脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其特征在于：在步骤s5中，将管状decm支架切割成圆盘，用于体外细胞培养，将细胞接种在冷冻干燥的decm支架圆盘上；用细胞计数试剂盒8检测接种于decm支架上1、3、7d的细胞增殖情况；细胞培养7d后，用鬼笔环肽-af488标记和dapi染色观察细胞骨架结构，以进行细胞形态分析；第7天用imagej软件测量细胞核的扩散面积和周长，计算细胞核形态指数nsi；decm支架样品冰冻切片后he染色和masson三色染色以进行组织学分析。8.根据权利要求1所述的脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其特征在于：在步骤s6中，在细胞在支架上培养的第7天，在冰上加入细胞裂解缓冲液提取细胞总蛋白；使用小鼠抗β-肌动蛋白抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔igg抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗鼠igg抗体测定分离的肌球蛋白重链myh蛋白表达及其调控规律。

技术总结
本发明公开了脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，包括如下步骤：S1、获取兔天然尿路平滑肌的组织结构特征；S2、研究聚合物模板的结构参数对支架的影响规律；S3、制备聚合物纤维模板；S4、通过体内组织化和脱细胞处理制备管状dECM支架；S5、在管状dECM支架上种植人膀胱平滑肌细胞；S6、检测在管状dECM支架上培养的平滑肌细胞的功能蛋白表达。本发明采用上述的脱细胞基质尿道材料的双层微通道结构设计，其管状dECM支架具有良好的生理功能和机械性能，具有多种天然尿道的生理功能，有望研发成为满足临床治疗要求的人工尿道材料。发成为满足临床治疗要求的人工尿道材料。发成为满足临床治疗要求的人工尿道材料。


技术研发人员：关勇 徐欣丽 王欣 吴勇 李盛斌 王聪 马雄
受保护的技术使用者：天津市儿童医院
技术研发日：2023.07.19
技术公布日：2023/10/15