渗透或ABA胁迫响应的GsSRKpro启动子及其应用

渗透或aba胁迫响应的gssrkpro启动子及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及渗透或aba胁迫响应的gssrkpro启动子及其应用。


背景技术：

2.环境中水分缺失导致的渗透胁迫，是非生物胁迫中最普通且常见的胁迫，对植物生长发育等有着极其严重的影响。当植物细胞失水时，细胞质膜分子结构紊乱，膜的透性发生改变导致了正常代谢的破环，严重时导致细胞死亡。因此，研究植物渗透胁迫的应答机制对细胞生存至关重要。
3.随着功能基因组学、分子生物学的高速发展，越来越多的功能基因得到克隆和解析。然而，相比之下，基因启动子的研究比较滞后。启动子是基因的重要组成部分，可通过与转录因子结合调控基因起始与表达强度。启动子可活化rna聚合酶，使其与模板dna特异性结合，从而具有转录起始功能。目前开发利用启动子成为基因工程技术的研究热点之一。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种渗透胁迫或aba胁迫响应的启动子及其应用。
5.第一方面，本发明要求保护一种dna分子，所述dna分子为如下a1)或a2)：
6.a1)序列表序列1所示的dna分子；
7.a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的dna分子。
8.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的dna分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明提供的dna分子的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要具有启动子功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
9.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的dna分子的核苷酸序列具有75％或更高，80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
10.第二方面，本发明要求保护与上述dna分子相关的生物材料，所述生物材料为下述b1)至b4)中的任一种：
11.b1)含有上述dna分子的表达盒；
12.b2)含有上述dna分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
13.b3)含有上述dna分子的重组微生物、或含有b1)所述表达盒的重组微生物、或含有b2)所述重组载体的重组微生物；
14.b4)含有上述dna分子的转基因植物细胞系、或含有b1)所述表达盒的转基因植物
细胞系。
15.上述生物材料中，所述表达盒(5’至3’)可包括启动子区(由所述dna分子组成)、转录起始区、目的基因区、转录终止区和任选的翻译终止区。所述启动子区和目的基因区对宿主细胞而言可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和目的基因区相互之间可为天然的/类似的，或者，所述启动子区和/或目的基因区对宿主而言或者其相互之间为异源的。“异源的”指序列为源自外来物种的序列，或，如果来自相同物种，则通过刻意的人为干预在组分和/或基因组位点方面对天然形式进行了实质性修饰。任选含有的转录终止区可与转录起始区同源，与可操作地连接的目的基因区同源，与宿主同源；或；目的基因区、宿主为外源或异源。
16.所述表达盒还可包括5’引导序列。5’引导序列可增强翻译。
17.在制备表达盒时，可应用衔接头连接dna片段、或、可涉及其它操作以提供适当的限制酶切位点、去除多余的dna、去除限制酶切位点等。为达到这一目的，可进行体外突变、引物修复、限制性酶切、退火、重新替换，例如转换和颠换。
18.所述表达盒还可包括用于筛选已转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因可用于筛选已转化细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因。其它选择性标记包括表型标记例如荧光蛋白。以上列出的选择性标记不具有限制性。本发明可使用任何选择性标记基因。
19.上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
20.上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌可为农杆菌(如根癌农杆菌lba4404)。
21.上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述dna分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述dna分子，也可用常规育种技术将所述dna分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
22.第三方面，本发明要求保护上述dna分子或生物材料的新用途。
23.本发明要求保护上述dna分子在作为启动子或渗透胁迫启动子或aba胁迫启动子中的应用。
24.本发明要求保护上述dna分子或生物材料在启动目的基因表达中的应用。
25.本发明要求保护上述dna分子或生物材料在制备转基因植物或植物育种中的应用。
26.上述任一所述应用中，所述制备转基因植物或所述植物育种的目的为培育耐逆植物品种(如耐渗透胁迫植物品种或耐aba胁迫植物品种)。
27.第四方面，本发明要求保护一种目的基因的表达方法，所述方法为如下c1)-c4)中任一种：
28.c1)包括如下步骤：以上述dna分子作为启动子来启动目的基因表达；
29.c2)包括如下步骤：将上述dna分子插入到目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因表达；
30.c3)包括如下步骤：将目的基因插入上述表达盒中的上述dna分子的下游，由所述
dna分子启动所述目的基因表达；
31.c4)包括如下步骤：将目的基因插入上述重组载体中的上述dna分子的下游，由所述dna分子启动所述目的基因表达。
32.上述任一所述启动目的基因表达可为在植物中启动目的基因表达。
33.上述任一所述启动目的基因表达可为在渗透胁迫或aba胁迫条件下启动目的基因表达。
34.进一步的，所述渗透胁迫为甘露醇胁迫。
35.更进一步的，所述甘露醇胁迫为350mm甘露醇胁迫或400mm甘露醇胁迫。
36.所述aba胁迫为0.5μm aba胁迫或5μm aba胁迫。
37.上述任一所述目的基因可为植物内源基因，也可为外源基因(如gus基因)。
38.上述任一所述植物可为双子叶植物或单子叶植物。
39.进一步的，所述双子叶植物可为十字花科植物。
40.更进一步的，所述十字花科植物可为拟南芥。
41.在本发明的具体实施例中，所述拟南芥为野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)。
42.本发明提供了一种dna分子，通过实验证明：该dna分子是一个渗透胁迫或aba胁迫响应启动子，具有重要的应用价值。
附图说明
43.图1为植物组织定位载体pcambia3300 nls-gfp-gus u-gssrkpro的构建。a为载体结构示意图。b为gssrkpro启动子的pcr扩增，其中，1-5分别为不同退火温度的pcr产物。c为重组质粒的pcr检测，其中，m：marker；-：ddh2o阴性对照；+：阳性对照；1-8：菌落1-8号。
44.图2为转gssrkpro启动子抗性拟南芥植株的pcr检测和组织化学gus染色。a为基因组pcr检测，其中，-：ddh2o阴性对照；wt：野生型阴性对照，#1-13：抗性苗。b为组织化学gus染色。
45.图3为不同胁迫处理前后的gus基因表达分析。a和b为渗透胁迫处理前后的gus基因表达分析。c和d为aba胁迫处理前后的gus基因表达分析。
46.图4为gssrkpro启动子受mannitol和aba胁迫诱导。a为t2代gssrkpro启动子转基因拟南芥#4和#5种子在渗透或aba胁迫处理后的组织化学gus染色。b为t2代gssrkpro启动子转基因拟南芥#4和#5幼苗在渗透或aba胁迫处理后的组织化学gus染色。
具体实施方式
47.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
48.下述实施例中的大豆材料g07256记载于文献“ge y,li y,zhu ym,bai x,lv dk,guo dj,ji w,cai h:global transcriptome profiling of wild soybean(glycine soja)roots under nahco3 treatment[j].bmc plant biology 2010,10.”和“葛瑛,朱延
gfp-gus载体的其他序列不变后得到的载体。
[0062]
3、采用冻融法将重组载体pcambia3300 nls-gfp-gus u-gssrkpro转化至根癌农杆菌lba4404中，经菌落pcr鉴定为阳性，说明重组载体成功转入农杆菌，并将阳性重组菌记作pcambia3300 nls-gfp-gus u-gssrkpro/lba4404。
[0063]
4、采用floral-dip法用pcambia3300 nls-gfp-gus u-gssrkpro/lba4404重组菌侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)，将收取的t0代拟南芥种子在含有25mg/l草铵膦的1/2ms固体培养基上进行筛选，培养基中能够正常长出绿色真叶且根系正常生长的植株说明转化成功。
[0064]
5、将转化成功的阳性植株进行基因组dna检测和组织化学gus染色。
[0065]
基因组dna检测的引物序列如下：
[0066]
gssrkpro-fp：5'-ggcttaautaccatcaccccgttcatagtgt-3'；
[0067]
gssrkpro-rp：5'-ggtttaauatgataatggtgtgcttgacttcag-3'。
[0068]
组织化学gus染色的具体步骤如下：将幼苗的叶片进行gus化学染色。gus化学染色样品放于培养箱中，37℃保温过夜，将染色样品浸于75％乙醇中进行脱色，在解刨显微镜下观察染色结果。gus化学染色液配方如下：磷酸钠缓冲液(200mm ph＝7.0，50ml)，na2edta(100mm，ph《8.0，10ml)，k3[fe(cn)6](5mm，10ml)，k4[fe(cn)6](5mm，10ml)，triton x(100μl)，x-gluc(60mg)，h2o定容至100ml。
[0069]
结果如图2所示，结果表明：gssrkpro启动子转基因拟南芥#4和#5有颜色反应，并将其用于后续启动子活性分析。
[0070]
二、渗透和aba胁迫下gssrkpro启动子活性分析
[0071]
为了验证渗透胁迫和aba胁迫对gssrkpro启动子的诱导作用，本发明分析了gssrkpro启动子驱动gus基因的表达活性。具体步骤如下：
[0072]
1、将野生型拟南芥、t2代gssrkpro启动子转基因拟南芥#4和#5种子在含有甘露醇(mannitol，350mm)或aba(0.5μm)的1/2ms培养基中进行渗透胁迫处理或aba胁迫处理，并分别于处理后第2d、4d、6d、8d取样进行组织化学gus染色。同时以在正常1/2ms培养基中培养作为对照处理(control)。
[0073]
结果如图4a所示，结果显示：与对照处理(control)相比，经甘露醇(350mm)和aba(0.5μm)胁迫处理后的种子和幼苗的gus染色颜色明显加深。
[0074]
2、将野生型拟南芥、t2代gssrkpro启动子转基因拟南芥#4和#5种子播种在1/2ms正常培养基中，待培养7d后将幼苗分别移至含有400mm甘露醇或5μm aba的1/2ms培养基中竖直培养，同时以在正常1/2ms培养基中培养作为对照处理(control)。待转基因拟南芥与野生型拟南芥出现明显差异时拍照并取样对幼苗进行组织化学gus染色。对幼苗期未染色的苗进行取样冷冻于液氮罐中，提取rna进行rt-pcr和qrt-pcr检测。
[0075]
结果如图3和图4b所示，结果显示：与对照处理(control)相比，gus基因转录水平在渗透胁迫处理或aba胁迫处理后显著增加，这一结果在组织化学gus染色分析时也得到了证实，具体表现为经渗透胁迫或aba胁迫处理后的幼苗颜色更深。
[0076]
综合上述结果，说明gssrkpro启动子受渗透和aba胁迫诱导。
[0077]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实
施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种dna分子，为如下a1)或a2)：a1)序列表序列1所示的dna分子；a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的dna分子。2.与权利要求1所述dna分子相关的生物材料，所述生物材料为下述b1)至b4)中的任一种：b1)含有权利要求1所述dna分子的表达盒；b2)含有权利要求1所述dna分子的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；b3)含有权利要求1所述dna分子的重组微生物、或含有b1)所述表达盒的重组微生物、或含有b2)所述重组载体的重组微生物；b4)含有权利要求1所述dna分子的转基因植物细胞系、或含有b1)所述表达盒的转基因植物细胞系。3.权利要求1所述dna分子在作为启动子或渗透胁迫响应启动子或aba胁迫响应启动子中的应用。4.权利要求1所述的dna分子或权利要求2所述的生物材料在启动目的基因表达中的应用。5.权利要求1所述的dna分子或权利要求2所述的生物材料在制备转基因植物中的应用。6.权利要求1所述的dna分子或权利要求2所述的生物材料在植物育种中的应用。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥。10.一种目的基因的表达方法，为如下c1)-c4)中任一种：c1)包括如下步骤：以权利要求1所述的dna分子作为启动子来启动目的基因表达；c2)包括如下步骤：将权利要求1所述的dna分子插入到目的基因或增强子的上游，以此来启动目的基因表达；c3)包括如下步骤：将目的基因插入权利要求2所述表达盒中的所述dna分子的下游，由所述dna分子启动所述目的基因表达；c4)包括如下步骤：将目的基因插入权利要求2所述重组载体中的所述dna分子的下游，由所述dna分子启动所述目的基因表达。

技术总结
本发明公开了渗透或ABA胁迫响应的GsSRKpro启动子及其应用。所述GsSRKpro启动子为如下A1)或A2)：A1)序列表序列1所示的DNA分子；A2)与A1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有启动子功能的DNA分子。通过实验证明：本发明公开的GsSRKpro启动子是一个渗透胁迫或ABA胁迫响应启动子，具有重要的应用价值。用价值。


技术研发人员：李建伟 孙晓丽 孙明哲 贾博为 陈茜
受保护的技术使用者：黑龙江八一农垦大学
技术研发日：2023.07.17
技术公布日：2023/10/15