一种即用型无血清快速细胞冻存液及制备方法与流程

1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种即用型无血清快速细胞冻存液及制备方法。


背景技术：

2.冻存细胞经典方案往往是使用胎牛血清（fbs）与二甲基亚砜（dmso）混合培养基后，进行手工程序降温冻存或者放于程序降温盒内进行冻存，其操作步骤繁琐，而手工程序降温时间需要严格把控，否则会导致细胞冻存失败，即使通过程序控制降温盒，在逐渐降温的过程中也无法精确控制降温速率，这样会导致冻存过程中形成较多的冰晶，从而使细胞受到较大的损伤，此外冻存液中使用的血清不仅来源受限，而且其中的蛋白可能潜在病原体污染，因此用该方法冻存的细胞只能用于科研，冻存的细胞无法进行临床细胞治疗应用。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种即用型无血清快速细胞冻存液及制备方法，以解决上述问题。
4.为了实现上述目的，本发明提供了一种即用型无血清快速细胞冻存液，包括以下成分：质量分数为1%-3%的丙三醇、质量分数为1.2%-2.5%的葡萄糖、质量分数为0.1%~0.3%的氯化钠、质量分数为0.05%-0.08%的磷酸二氢钠、质量分数为0.1%-0.3%的羟乙基淀粉、质量分数为0.4%-0.8%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐，质量分数0.02%-0.05%的乙二胺四乙酸；以及体积分数为5%-8%的二甲基亚砜；其余为双蒸水。
5.进一步地，所述细胞冻存液中丙三醇质量分数为2%，葡萄糖质量分数为2%，氯化钠质量分数为0.2%，磷酸二氢钠质量分数为0.06%，羟乙基淀粉质量分数为0.2%，羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐质量分数为0.6%，乙二胺四乙酸质量分数为0.035%，二甲基亚砜体积分数为6%，双蒸水质量分数为 89%。
6.此外，本发明还提供了一种即用型无血清快速细胞冻存液制备方法，包括如上述的细胞冻存液，s1、溶解二甲基亚砜加入到对应体积双蒸水中；s2、加入羟乙基淀粉，并搅拌；s3、加入葡萄糖和乙二胺四乙酸，并搅拌；s4、依次加入丙三醇，氯化钠，磷酸二氢钠，羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐，并依次搅拌均匀。
7.进一步地，s1中，二甲基亚砜与双蒸水混合后，冷却至室温。
8.进一步地，s2中，搅拌至羟乙基淀粉完全融化。
9.进一步地，s3中，搅拌至葡萄糖和乙二胺四乙酸完全融化。
10.进一步地，s4中，搅拌子的转速小于500转/分钟。
11.进一步地，配置完成后冷却至室温，用0.1um过滤杯进行过滤除菌2次。
12.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明提供的细胞冻存液具有高效、低毒、无外源蛋白和易于使用等优点，冻存后复苏的细胞具有活性高，产品质量稳 定可靠、使用方便，可快速实现细胞冻存并长期在-80℃冰箱保存，保护细胞免受冰晶和溶质损伤，并能够在复苏后保持其细胞特性，可使科研工作者摆脱程序繁琐、操作复杂、容易污染的传统冻存方法。
具体实施方式
13.现在对本发明做进一步详细的说明。
14.实施例一，本实施例提供了一种即用型无血清快速细胞冻存液，包括以下成分：质量分数为1%-3%的丙三醇、质量分数为1.2%-2.5%的葡萄糖、质量分数为0.1%~0.3%的氯化钠、质量分数为0.05%-0.08%的磷酸二氢钠、质量分数为0.1%-0.3%的羟乙基淀粉、质量分数为0.4%-0.8%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐，质量分数0.02%-0.05%的乙二胺四乙酸；以及体积分数为5%-8%的二甲基亚砜；其余为双蒸水。
15.本实施例中，作为优选，所述细胞冻存液中丙三醇质量分数为2%，葡萄糖质量分数为2%，氯化钠质量分数为0.2%，磷酸二氢钠质量分数为0.06%，羟乙基淀粉质量分数为0.2%，羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐质量分数为0.6%，乙二胺四乙酸质量分数为0.035%，二甲基亚砜体积分数为6%，双蒸水质量分数为 89%。
16.实施例二，本实施例是在实施例一的基础上实施的，本实施例提供了一种即用型无血清快速细胞冻存液制备方法，包括如实施例一中所示的细胞冻存液，s1、溶解二甲基亚砜加入到对应体积双蒸水中；s2、加入羟乙基淀粉，并搅拌；s3、加入葡萄糖和乙二胺四乙酸，并搅拌；s4、依次加入丙三醇，氯化钠，磷酸二氢钠，羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐，并依次搅拌均匀。
17.本实施例中作为优选，在s1中，二甲基亚砜与双蒸水混合后，会发热，在进行下一步操作前需等待溶液冷却至室温。
18.本实施例中作为优选，在s2中，搅拌至羟乙基淀粉完全融化。
19.本实施例中作为优选，s3中，搅拌至葡萄糖和乙二胺四乙酸完全融化。
20.本实施例中作为优选，s4中，每加入一种成分后均需要先进行充分的搅拌，再加入另一种成分，即共计需要搅拌四次，同时，每次搅拌的速度都不宜过快，具体来说，以搅拌子的转速小于500转/分钟为宜。
21.本实施例中作为优选，配置完成后冷却至室温，用0.1um过滤杯进行过滤除菌2次。
22.实施例三，本实施例是在实施例二的基础上实施的，本实施例提供了一种即用型无血清快速细胞冻存液使用方法，具体如下：收集培养细胞先进行离心，接着对离心后的溶液弃上清，得到细胞，向细胞内加入预冷的细胞冻存液，最后，混匀细胞后分装，直接冻存于-80℃的冰箱内。
23.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技
术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


技术特征：
1.一种即用型无血清快速细胞冻存液，其特征在于，包括以下成分：质量分数为1%-3%的丙三醇、质量分数为1.2%-2.5%的葡萄糖、质量分数为0.1%~0.3%的氯化钠、质量分数为0.05%-0.08%的磷酸二氢钠、质量分数为0.1%-0.3%的羟乙基淀粉、质量分数为0.4%-0.8%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐，质量分数0.02%-0.05%的乙二胺四乙酸；以及体积分数为5%-8%的二甲基亚砜；其余为双蒸水。2.如权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液中丙三醇质量分数为2%，葡萄糖质量分数为2%，氯化钠质量分数为0.2%，磷酸二氢钠质量分数为0.06%，羟乙基淀粉质量分数为0.2%，羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐质量分数为0.6%，乙二胺四乙酸质量分数为0.035%，二甲基亚砜体积分数为6%，双蒸水质量分数为 89%。3.一种即用型无血清快速细胞冻存液制备方法，包括如权利要求2所述的细胞冻存液，其特征在于，s1、溶解二甲基亚砜加入到对应体积双蒸水中；s2、加入羟乙基淀粉，并搅拌；s3、加入葡萄糖和乙二胺四乙酸，并搅拌；s4、依次加入丙三醇，氯化钠，磷酸二氢钠，羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐，并依次搅拌均匀。4.如权利要求3所述的细胞冻存液制备方法，其特征在于，s1中，二甲基亚砜与双蒸水混合后，冷却至室温。5.如权利要求3所述的细胞冻存液制备方法，其特征在于，s2中，搅拌至羟乙基淀粉完全融化。6.如权利要求3所述的细胞冻存液制备方法，其特征在于，s3中，搅拌至葡萄糖和乙二胺四乙酸完全融化。7.如权利要求3所述的细胞冻存液制备方法，其特征在于，s4中，搅拌子的转速小于500转/分钟。8.如权利要求3所述的细胞冻存液制备方法，其特征在于，配置完成后冷却至室温，用0.1um过滤杯进行过滤除菌2次。

技术总结
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种即用型无血清快速细胞冻存液及制备方法。本发明提供了一种即用型无血清快速细胞冻存液，包括以下成分：质量分数为1%-3%的丙三醇、质量分数为1.2%-2.5%的葡萄糖、质量分数为0.1%~0.3%的氯化钠、质量分数为0.05%-0.08%的磷酸二氢钠、质量分数为0.1%-0.3%的羟乙基淀粉、质量分数为0.4%-0.8%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸钠盐，质量分数0.02%-0.05%的乙二胺四乙酸；以及体积分数为5%-8%的二甲基亚砜；其余为双蒸水。本发明提供的细胞冻存液具有高效、低毒、无外源蛋白和易于使用等优点，冻存后复苏的细胞具有活性高，产品质量稳定可靠、使用方便，可使科研工作者摆脱程序繁琐、操作复杂、容易污染的传统冻存方法。存方法。


技术研发人员：陈勇 周楠楠
受保护的技术使用者：苏州奕杉生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.14
技术公布日：2023/10/15