一种人血清中维生素K1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法与流程

一种人血清中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种人血清中维生素k1，甲萘醌-4，甲萘醌-7的快速检测方法。


背景技术：

2.维生素k在促进凝血和骨骼代谢中起到十分重要的作用。维生素k2和维生素k1检测的意义都非常重要，尤其是随着国内外医学水平的发展，很多研究针对维生素k不同分型的研究越来越多，维生素k细致化检测变得越来越重要；甲萘醌-4(mk-4)和甲萘醌-7(mk-7)是维生素k2含量比重占得最大的两种物质，mk-4和mk-7的精准检测是营养状况和疾病诊断治疗监测的重要参考指标，准确测定人血中mk-4和mk-7的含量具有十分重要的意义。
3.现有中国专利cn113933410a一种同时检测维生素k1、mk4和mk7的方法，采用液相色谱串联质谱法检测，液相处理时间6min；该方法不能有效去除血液基质中的杂质，采用该方法进行血液样本检测，图谱中会有非常严重的干扰峰，基线噪音高，信噪比低，难以保证检测准确度。
4.cn115639299a一种同时检测血液样品中vk1、mk-4和mk-7的方法，其方法中对样本采用含有机酸的蛋白沉淀剂处理，有机酸为三氯乙酸，酸性基质会使保留时间不稳定，并且三氯乙酸会使质谱负离子信号不稳定，甚至降低。
5.另外，国外存在这三种物质的检测方法的文献，存在很大缺陷。其中包含以下三点：第一前处理特别复杂，需要过spe板，费时费力，并且成本较高；第二方法时间过长，有的甚至需要11.5分钟，大批量样本过于浪费时间；第三样本量过大，需要达到500μl，同一样本如果需要复测，或者再拿去检测其他物质，样本量就成为了一个巨大挑战。
6.由于监测筛选人体血液中维生素k不同分型的意义重大，通过维生素缺乏或增高与患者临床症状结合，为推断疾病病理生理以及疾病判断起到重要的辅助作用，同时对服药患者，药物水平监，寻找最佳治疗浓度，避免过度剂量的不良反应风险。因此临床上对同时快速检测血液中维生素k1，甲萘醌-4，甲萘醌-7具有迫切需求。


技术实现要素：

7.针对目前所存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，该方法前处理简单，液相只需4min，节约了时间，并且成本更低。
8.为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：
9.本发明提供一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，包括以下步骤：
10.s1，配制目标待测物vk1、mk-4、mk-7的标准储备溶液、标准曲线工作液、质控品以及内标溶液；
11.s2，血液样本经前处理后得到检测样本；
12.s3，利用hplc-ms/ms对添加内标溶液的标准曲线工作液进行检测，以目标待测物与其对应的同位素内标的色谱峰峰面积比为纵坐标，以标准曲线工作液中目标待测物的浓度为横坐标，分别拟合得到目标待测物对应的标准曲线方程，利用hplc-ms/ms对添加内标溶液的检测样本进行检测，根据对应的标准曲线方程计算得到检测样本中目标待测物的含量；其中，hplc-ms/ms检测的色谱条件如下：
13.色谱柱：phenomen uplc c18(2.1mm x 100mm，2.6μm)；
14.流动相：a：0.1％甲酸水溶液；b：0.1％甲酸+2mm乙酸铵甲醇溶液；
15.strong wash溶液：50％异丙醇；
16.流速：0.6ml/min，
17.柱温：40℃；
18.进样：20μl；
19.采用梯度洗脱方式，梯度洗脱方式如下：流动相a的体积分数+流动相b的体积分数＝100％；梯度洗脱时间4min停止，其中：
20.0.01-0.4min流动相a的体积分数为5％；
21.0.4-3.5min流动相a的体积分数由5％下降至0％；
22.3.5-3.51min流动相a的体积分数由0％上升至5％；
23.3.51-4min流动相a的体积分数由5％下降至0。
24.进一步地，hplc-ms/ms检测的质谱条件如下：
25.离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500v；离子源温度(tem)：450℃；离子源雾化气(gs1)：50psi；离子源加热辅助气(gs2)：50psi；气帘气(cur)：20psi；碰撞气(cad)：10psi；扫描模式：mrm，
26.mrm参数如下：
27.定性离子q1(m/z)q3(m/z)dp(v)ep(v)ce(v)cxp(v)vk1541.4187100103216mk-4445.2187.18011278vki-d7548.3194.1100103216mk-4-d7452.1194.18011278mk-7649.6186.990103510
28.进一步地，所述检测样本的前处理步骤如下：
29.s1、血液样本置于洁净样本管a中，加入酶解溶液，37℃震荡；
30.s2、冷却后加入正己烷，充分混匀，4℃离心；
31.s3、取上清液与洁净样本管b中，氮气吹干，加入90％甲醇，充分混匀，4℃离心；上清液即为检测样本。
32.进一步地，所述标准储备溶液包括将vk1标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的vk1标准储备液，浓度1mg/ml；将mk-4标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的mk-4标准储备液，浓度1mg/ml；将mk-7标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的mk-7标准储备液，浓度100μg/ml；将vk1内标标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的vk1内标标准储备液，浓度1mg/ml，将vk2内标标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的vk2内标标准储备液，浓度1mg/ml。
33.进一步地，所述标准曲线工作液由混标储备液m0和空白基质稀释得到，所述混标储备液m0采用100μl 10μg/ml vk1、100μl 10μg/ml mk-4、100μl 100μg/ml mk-7加入700μl空白基质中混合制备而成，所述10μg/ml vk1由vk1标准储备液用1g/l bht甲醇溶剂稀释而成，10μg/ml mk-4由mk-4标准储备液用1g/l bht甲醇溶剂稀释而来。
34.进一步地，所述标准曲线工作液包括w1-w9，其中，标准曲线工作液中vk1的浓度范围为0.05μg/ml-10μg/ml；mk-4的浓度范围为0.05μg/ml-10μg/ml，mk-7的浓度范围为0.5μg/ml-100μg/ml。
35.较佳地，所述空白基质为甲醇。
36.进一步地，所述内标溶液由64μl 10μg/ml vk1内标和64μl 10μg/ml mk-4内标加入8ml bht甲醇溶液中混合配制而成，所述10μg/ml vk1内标由vk1内标标准储备液采用1g/l bht甲醇溶剂稀释而来；10μg/ml mk-4内标由mk-4内标标准储备液采用1g/l bht甲醇溶剂稀释而来。
37.进一步地，还包括质控步骤，质控品包括高浓度质控品、中浓度质控品以及低浓度质控品，高浓度质控由400μl w1和100μl空白血清基质混合配制而成，中浓度质控由40μl w1和460μl空白血清基质混合配制而成，低浓度质控样品由100μl中浓度质控和700μl空白血清基质混合配制而成。
38.进一步地，所述高浓度质控品中包含：浓度8ng/ml vk1，浓度8ng/ml mk-4，浓度80ng/ml mk-7；中浓度质控品中包含：浓度0.8ng/ml vk1，浓度0.8ng/ml mk-4，浓度8ng/ml mk-7；低浓度质控品中包含：浓度0.1ng/ml vk1，浓度0.1ng/ml mk-4，浓度1ng/ml mk-7。
39.本发明的有益效果
40.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明的检测方法能同时检测vk1、mk-4、mk-7三种物质，并且液相用时短，仅需要4分钟即可完成，节约了时间，提高了应用时样本检测的效率。
41.本发明的方法在样本前处理过程中，用脂肪酶对样本进行处理，可酶解掉血液样本中对检测产生干扰的酶类，减小基线噪音以及杂质带来的干扰峰；同时，我们在配制相应的标准储备溶液中，添加了稳定剂bht，防止标准品降解。
42.本发明的方法中不将试剂酸碱度进行改变，操作简单，不会对仪器信号产生影响。
附图说明
43.图1示出了vk1的标准工作曲线；
44.图2示出了mk-4的标准工作曲线；
45.图3示出了mk-7的标准工作曲线；
46.图4示出了本发明实施例1的液相分离图谱。
47.图5示出了实施例2的液相分离图谱；
48.图6示出了实施例3的液相分离图谱。
具体实施方式
49.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用
的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。
50.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。
51.关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
52.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由
……
组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由
……
组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
53.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
54.实施例
55.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
56.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
57.主要实验仪器
58.sciex4500md三重四级杆质谱仪(美国，sciex公司)，包括岛津高效液相色谱系统(日本，shimadzu scientific公司)；
59.kq-500e超声波清洗器(中国，昆山市超声仪器有限公司)；
60.h1650r台式高速冷冻离心机(中国，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；
61.g560e涡旋混合器(美国，scientific industries公司)；
62.bt125d电子天平(德国，赛多利斯股份公司)；
63.移液器(eppendorf，德国)。
64.实施例1
65.一、溶液准备
66.(1)目标待测物单标标准储备液的配制
67.分别配制目标待测物：vk1、mk-4、mk-7的标准储备液以及vk1-d7和vk2-d7内标标准储备液，配制方法如下表1所示，单标标准储备液配制完成后，密封保存于-80℃冰箱。
68.表1单标标准储备液的配制
[0069][0070]
1g/l bht甲醇配置：称取1g的bht加入到1l甲醇中。
[0071]
(2)混标储备液(m0)的配制
[0072]
10μg/ml vk1的配置：量取990μl 1g/l bht甲醇，加入10μl 1mg/ml vk1混合均匀；
[0073]
10μg/ml mk-4的配置：量取990μl 1g/l bht甲醇，加入10μl 1mg/ml mk-4混合均匀；
[0074]
混标储备液m0的配置：分别量取100μl 1mg/ml vk1、100μl 1mg/ml mk-4、100μl 100μg/ml mk-7加入700μl甲醇中混合均匀，配制后密封保存于-80℃冰箱可以使用15天。
[0075]
(3)标准曲线工作液的配制
[0076]
采用混标储备液m0和空白基质逐级稀释得到w1-w9各个浓度的标准曲线工作液样品，各个浓度的标准曲线工作液样品配制方法见表2，密封保存于-80℃冰箱。
[0077]
表2标准曲线工作液的配置
[0078]
目标物w1w2w3w4w5w6w7w8w9加入量(μl)20m0400w1200w1100w140w130w1200w6150w650w6空白基质量(μl)1980100200400460720200450350
[0079]
其中，空白基质为甲醇。
[0080]
(4)质控样品的配制
[0081]
采用20μl m0和1980μl空白基质配制得到w1，再逐步稀释分别得到高浓度质控(hqc)、中浓度质控(mqc)和低浓度质控(lqc)样品，配制方法见表3，标准曲线工作液中质控样品浓度见表4。配制后按照每个样品200μl分装于1.5ml离心管中，现用现配。
[0082]
表3质控样品配制
[0083] hqcmqclqc
加入量(μl)400w140w1100mqc空白血清基质(μl)100460700
[0084]
表4标准曲线工作液以及质控样品的浓度
[0085]
项目w1w2ww4w5w6w7w8w9lqcmqchqcvk1(ng/ml)108520.80.40.20.10.050.10.88mk-4(ng/ml)108520.80.40.20.10.050.10.88mk-7(ng/ml)10080502084210.51880
[0086]
注：实际浓度以测得的靶值为准。
[0087]
(5)内标溶液的配制
[0088]
采用64μl 10μg/ml vk1内标、64μl10μg/ml mk-4内标加入8ml bht甲醇溶液中，混合配制完成后密封保存于-80℃冰箱避光备用。
[0089]
二、hplc-ms/ms检测条件
[0090]
(1)色谱条件如下：
[0091]
色谱柱：phenomen uplc c18(2.1mm x 100mm，2.6μm)；
[0092]
流动相：a：0.1％甲酸水溶液；b：0.1％甲酸+2mm乙酸铵甲醇溶液；
[0093]
strong wash溶液：50％异丙醇；
[0094]
流速：0.6ml/min，
[0095]
柱温：40℃；
[0096]
进样：20μl；
[0097]
采用梯度洗脱方式，梯度洗脱方式如下：流动相a的体积分数+流动相b的体积分数＝100％；梯度洗脱时间4min停止，其中：
[0098]
0.01-0.4min流动相a的体积分数为5％；
[0099]
0.4-3.5min流动相a的体积分数由5％下降至0％；
[0100]
3.5-3.51min流动相a的体积分数由0％上升至5％；
[0101]
3.51-4min流动相a的体积分数由5％下降至0。
[0102]
(2)质谱条件如下：
[0103]
离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500v；离子源温度(tem)：450℃；离子源雾化气(gs1)：50psi；离子源加热辅助气(gs2)：50psi；气帘气(cur)：20psi；碰撞气(cad)：10psi；扫描模式：mrm，mrm参数如表5。
[0104]
表5 mrm参数
[0105]
定性离子q1(m/z)q3(m/z)dp(v)ep(v)ce(v)cxp(v)vk1541.4187100103216mk-4445.2187.18011278vki-d7548.3194.1100103216mk-4-d7452.1194.18011278mk-7649.6186.990103510
[0106]
上述表格中，q1为母离子；q3为子离子；dp为去簇电压；ep为射入电压，ce为碰撞电压；cxp为碰撞室射出电压。
[0107]
三、样本制备
[0108]
(1)酶解溶液的配制
[0109]
采用80mg脂肪酶加入40ml pbs溶液，充分混匀后，于4℃冰箱保存。
[0110]
(2)血液样本采集
[0111]
若采集血浆或者血清标本，使用含edta抗凝(紫色)真空负压采血管采集血浆，用真空负压黄色帽采血管(分离胶)采集血清；
[0112]
若采集随机血，则必须在2h内采用离心沉淀法(3500rpm，8min)分离血浆或者血清，分装后保存；
[0113]
血浆/血清长期保存在-80℃，处理时，先从-80℃拿出放在-20℃约30min，然后再转移到4℃溶解需要约1h。
[0114]
(3)待测样本准备
[0115]
采用1.5ml的ep管来进行样品的制备。
[0116]
精密量取标准曲线样品，质控样品，人血清或者人血浆200μl置于洁净离心管中，加入100μl酶解溶液，37℃，震荡15分钟；冷却后加入40μl的内标溶液，充分混匀3min，再加入1000μl正己烷，充分混匀5min，4℃条件12000rpm离心5min；吸取上清液800μl置于96孔深孔板中，氮气吹干，加入100μl 90％甲醇复溶。充分混匀后，进行离心4℃条件12000rpm离心2min；吸取上清液即为检测样品，进样检测。
[0117]
四、结果
[0118]
(1)利用hplc-ms/ms对添加内标溶液的标准曲线工作液进行检测，以目标待测物与其对应的同位素内标的色谱峰峰面积比为纵坐标，以标准曲线工作液中目标待测物的浓度为横坐标，分别拟合得到目标待测物对应的标准曲线方程如下：
[0119]
vk1标准曲线为：y＝0.65519x+0.00138，r＝0.99936；线性曲线图见图1；
[0120]
mk-4标准曲线为：y＝0.42888x+0.00906，r＝0.99781；线性曲线图见图2；
[0121]
mk-7标准曲线为：y＝1.30658x+0.01018，r＝0.99966；线性曲线图见图3；
[0122]
(2)利用hplc-ms/ms对检测样本进行检测，检测结果如图4所示，根据对应的标准曲线方程计算得到检测样本中目标待测物的含量如下表6。
[0123]
表6目标待测物含量
[0124]
样本vk1(ng/ml)mk-4(ng/ml)mk-7(ng/ml)血清样本1.250.720.51
[0125]
(3)利用高浓度质控(hqc)、中浓度质控(mqc)和低浓度质控(lqc)样品对样本的检测结果进行质控，质控结果如下表7所示。
[0126]
表7质控结果
[0127]
[0128]
结果显示，实测值与理论值非常接近，说明本发明方法得到的结果准确度较高，与理论值的误差小。
[0129]
实施例2
[0130]
实施例2其他实验条件同实施例1，区别仅在于实施例2采用如下液相条件：流速0.6ml/min，柱温为40℃，梯度洗脱程序如下表8所示。
[0131]
表8梯度洗脱程序
[0132][0133]
实施例2检测结果见图5。
[0134]
结果显示：液相时间过短，液相图谱只得到两个峰vk1：1.95和mk-4：1.35。
[0135]
实施例3
[0136]
实施例3其他实验条件同实施例1，区别仅在于实施例3采用如下液相条件：流速0.6ml/min，柱温为40℃，梯度洗脱程序如下表9所示。
[0137]
表梯度洗脱程序
[0138][0139]
实施例3检测结果见图6。
[0140]
结果显示：液相时间5分钟，液相图谱得到三个峰vk1：2.2，mk-4：1.5，mk-7：2.7。
[0141]
由实施例1、实施例2和实施例3可见，洗脱梯度不同时，3min时间过短时，三种目标待测物无法完全分离，没办法检测；5min时间过长时，虽然三种目标待测物能够分离，但是杂质峰较多，有些杂质峰会明显地影响判断，实施例1的液相条件4min，三种目标待测物能够得到完全分离，并且杂质峰少，目标待测物峰型更好，便于判断。
[0142]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于：包括以下步骤：s1，配制目标待测物vk1、mk-4、mk-7的标准储备溶液、标准曲线工作液、质控品以及内标溶液；s2，血液样本经前处理后得到检测样本；s3，利用hplc-ms/ms对添加内标溶液的标准曲线工作液进行检测，以目标待测物与对应的同位素内标的色谱峰峰面积比为纵坐标，以标准曲线工作液中目标待测物的浓度为横坐标，分别拟合得到目标待测物对应的标准曲线方程，利用hplc-ms/ms对添加内标溶液的检测样本进行检测，根据对应的标准曲线方程计算得到检测样本中目标待测物的含量；其中，hplc-ms/ms检测的色谱条件如下：色谱柱：phenomen uplc c18(2.1mm x 100mm，2.6μm)；流动相：a：0.1％甲酸水溶液；b：0.1％甲酸+2mm乙酸铵甲醇溶液；strong wash溶液：50％异丙醇；流速：0.6ml/min，柱温：40℃；进样：20μl；采用梯度洗脱方式，梯度洗脱方式如下：流动相a的体积分数+流动相b的体积分数＝100％；梯度洗脱时间4min停止，其中：0.01-0.4min流动相a的体积分数为5％；0.4-3.5min流动相a的体积分数由5％下降至0％；3.5-3.51min流动相a的体积分数由0％上升至5％；3.51-4min流动相a的体积分数由5％下降至0。2.根据权利要求1所述的一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于，所述hplc-ms/ms检测的质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500v；离子源温度(tem)：450℃；离子源雾化气(gs1)：50psi；离子源加热辅助气(gs2)：50psi；气帘气(cur)：20psi；碰撞气(cad)：10psi；扫描模式：mrm，mrm参数如下：定性离子q1(m/z)q3(m/z)dp(v)ep(v)ce(v)cxp(v)vk1541.4187100103216mk-4445.2187.18011278vki-d7548.3194.1100103216mk-4-d7452.1194.18011278mk-7649.6186.9901035103.根据权利要求1所述的一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于，所述检测样本的前处理方法如下：血液样本置于洁净样本管a中，加入酶解溶液，37℃震荡；冷却后加入正己烷，充分混匀，4℃离心；取上清液与洁净样本管b中，氮气吹干，加入90％甲醇，充分混匀，4℃离心；上清液即为检测样本。4.根据权利要求1所述的一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方
法，其特征在于：所述标准储备溶液包括将vk1标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的vk1标准储备液，浓度1mg/ml；将mk-4标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的mk-4标准储备液，浓度1mg/ml；mk-7标准储备液浓度为100μg/ml；将vk1内标标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的vk1内标标准储备液，浓度1mg/ml，将vk2内标标准品溶于1g/l bht甲醇溶剂中配制得到的vk2内标标准储备液，浓度1mg/ml。5.根据权利要求1所述的一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于：所述标准曲线工作液由混标储备液m0和空白基质稀释得到，所述混标储备液m0采用100μl 10μg/ml vk1、100μl 10μg/ml mk-4、100μl 100μg/ml mk-7加入700μl空白基质中混合制备而成，所述10μg/ml vk1由vk1标准储备液用1g/l bht甲醇溶剂稀释而来，10μg/ml mk-4由mk-4标准储备液用1g/lbht甲醇溶剂稀释而来。6.根据权利要求5所述的一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于：所述标准曲线工作液包括w1-w9 9个曲标浓度，标准曲线工作液中vk1的浓度范围为0.05μg/ml-10μg/ml；mk-4的浓度范围为0.05μg/ml-10μg/ml，mk-7的浓度范围为0.5μg/ml-100μg/ml。7.根据权利要求5所述的一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于：所述空白基质为甲醇。8.根据权利要求1所述的一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于：所述内标溶液由64μl 10μg/ml vk1内标和64μl 10μg/ml mk-4内标加入8ml bht甲醇溶液中混合配制而成，所述10μg/ml vk1内标由vk1内标标准储备液用1g/l bht甲醇溶剂稀释而来；10μg/ml mk-4内标由mk-4内标标准储备液用1g/l bht甲醇溶剂稀释而来。9.根据权利要求1所述的一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于：还包括质控步骤，质控品包括高浓度质控品、中浓度质控品以及低浓度质控品，高浓度质控由400μl w1和100μl空白血清基质混合配制而成，中浓度质控由40μl w1和460μl空白血清基质混合配制而成，低浓度质控样品由100μl中浓度质控和700μl空白血清基质混合配制而成。10.根据权利要求9所述的而一种人血液中维生素k1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，其特征在于：所述高浓度质控品中包含：浓度8ng/ml vk1，浓度8ng/ml mk-4，浓度80ng/ml mk-7；中浓度质控品中包含：浓度0.8ng/ml vk1，浓度0.8ng/ml mk-4，浓度8ng/ml mk-7；低浓度质控品中包含：浓度0.1ng/ml vk1，浓度0.1ng/ml mk-4，浓度1ng/ml mk-7。

技术总结
本发明公开了一种人血液中维生素K1、甲萘醌-4、甲萘醌-7的快速检测方法，包括以下步骤：拟合目标待测物对应的标准曲线方程，利用检测样本的检测结果，根据对应的标准曲线方程计算得到检测样本中目标待测物的含量；HPLC-MS/MS检测的色谱条件中梯度洗脱时间4min，流动相A的体积分数+流动相B的体积分数＝100％，0.01-0.4min流动相A的体积分数5％；0.4-3.5min流动相A的体积分数由5％下降至0％；3.5-3.51min流动相A的体积分数由0％上升至5％；3.51-4min流动相A的体积分数由5％下降至0。本发明的检测方法所需时间短，仅需4min，对于大样本量的实验，极大的节约了时间。极大的节约了时间。极大的节约了时间。


技术研发人员：高飞 董乐乐 海云 张志栋
受保护的技术使用者：杭州度安医学检验实验室有限公司
技术研发日：2023.07.11
技术公布日：2023/10/15