一种与犊牛生长发育相关的分子标记及其应用

1.本发明属于分子标记制备技术领域，具体涉及一种与犊牛生长发育相关的分子标记及其应用。


背景技术：

2.犊牛瘤胃的发育会直接影响饲料的摄入量、营养消化率和整体生长，即使是早期喂养制度和营养的微小变化也会极大地影响瘤胃的发育，从而对牛的生长、健康、体重和产奶量等产生长期影响。新生犊牛瘤胃的发育是犊牛养殖中最重要和最有趣的领域之一。
3.在全基因组水平上解析性状相关基因表达模式的整体特征，以揭示犊牛早期发育的分子基础是今后犊牛育种工作的重要研究方向之一。mirnas是长度为21-23nt的单链rna分子，其通过调控靶基因的表达在哺乳动物生长发育，细胞增殖分化过程中发挥关键作用。到目前为止，已经确定mirnas在肌肉和脂肪发育中起关键作用，且在肉牛的脂肪和肌肉组织之间仅报告了有限的mirnas。但在其它组织中观察到的变化的潜在机制在很大程度上仍然未知，需要进一步研究。目前为止，还未开发出与牛生长发育相关的mirnas的研究报道，因此能开发出一种与犊牛生长发育相关性的mirna，通过检测某个指标的表达情况即可预测该犊牛的生长发育情况，这在犊牛的遗传辅助育种中具有显著的应用潜力，还可能有助于设计新的选择策略来改善中国荷斯坦犊牛育种。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种与犊牛生长发育相关的分子标记及其应用，该分子标记为一种mirna，可以作为与犊牛生长发育相关的分子标记，用于犊牛的优势育种，在犊牛的遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。
5.为了达到上述目的，本发明提供了一种与犊牛生长发育相关的分子标记，该分子标记为bta-mir-655，其核苷酸序列如seq id no.1所示，该bta-mir-655的表达量与犊牛生长发育负相关，即当bta-mir-655的表达量高时表明犊牛的生长发育较差，当bta-mir-655的表达量低时表明犊牛的生长发育较好。
6.本发明提供的分子标记bta-mir-655可应用于牛养殖业中，包含犊牛的生长发育筛查或/和牛的辅助育种。
7.本发明还提供了一组鉴定上述分子标记bta-mir-655的引物，该引物的核苷酸序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示。
8.本发明提供的上述引物可用于犊牛生长发育筛查或/牛的辅助育种。
9.本发明还提供了一种用于犊牛生长发育的监测和筛查试剂盒，该试剂盒包含上述的引物，该试剂盒可用于犊牛的生长发育筛查或/和牛的辅助育种。
10.本发明的分子标记bta-mir-655，提供了一种与犊牛生长发育相关的分子标记，具有以下优点：
11.(1)本发明提供了一种分子标记bta-mir-655，该分子标记的表达量可以反应犊牛
体重或生长发育情况，通过对该分子的检测可以监测犊牛的生长发育情况，用于犊牛生长发育相关方面的辅助遗传选育，提升育种效率。
12.(2)本发明还提供了一组用于鉴定分子标记bta-mir-655的引物，可通过pcr对犊牛的体重或生长发育情况进行监测，在牛养殖业中如牛的辅助育种中具有广泛的应用前景。
13.(3)利用本发明中的分子标记以及该分子标记的开发方法，有助于设计新的选择策略来改善中国荷斯坦犊牛育种。
附图说明
14.图1为本发明中bta-mir-655在体重差异个体的表达量对比结果。
具体实施方式
15.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.说明：本发明未具体说明的方法均为本领域的常规方法，未具体说明的试剂均为本领域常规试剂。
17.瘤胃的生长发育会直接影响动物饲料的摄入量、营养消化率和整体生长，也可以说瘤胃的生长发育直接影响着体重，瘤胃生长发育越好、体重越高，生长发育越差、体重越低，因此本发明选择以与犊牛生长发育最直接相关的犊牛瘤胃为目标进行探究，欲开发出与生长发育相关的分子标记。
18.本发明通过取相同饲养条件下的80日龄的具有体重差异的中国荷斯坦犊牛的瘤胃组织样本，对样本进行全转录组学分析，得到一个表达差异显著的bta-mir-655，发现bta-mir-655的表达量高低与犊牛体重差异有着高度相关性，该mirna在高体重个体瘤胃中的表达量显著低于低体重个体瘤胃中的表达量，结合测序技术和常规分析手段，再通过rt-qpcr验证该结果的准确性。而牛体重情况也属于生长发育情况的主要表征之一，体重越高表明生长发育越好，体重低则说明生长发育差。经探究发现该bta-mir-655的表达量与犊牛生长发育负相关，即当bta-mir-655的表达量高时表明犊牛的生长发育较差，当bta-mir-655的表达量低时表明犊牛的生长发育较好，因此，该mirna可以作为一种分子标记用于犊牛生长发育情况的监测，包括用于犊牛的辅助育种和优势育种，应用前景巨大。
19.实施例1与犊牛生长发育相关的分子标记的开发
20.1)分别采集80日龄的相同饲喂条件下具有体重差异的中国荷斯坦犊牛的瘤胃组织样本(共6例，高体重组和低体重组分别取3个样本)于-80℃冰箱保存，分别提取各样本的总rna，用于全基因转录组学测序。
21.2)rna定性和定量分析：
22.用1％琼脂糖凝胶监测提取的总rna的降解和污染情况，使用安捷伦的rnanano6000检测试剂盒评估rna的完整性，随后进行建库。
23.3)用于小核糖核酸测序的文库制备：
24.根据制造商的说明，使用nebnext“用于illumina的多重小rna文库制备套装”从每个样品中分离出的总共2μg总rna中制备小rna文库。简而言之，将纯化的rna与neb3’sr接头混合，然后将srrt引物杂交到过量的3’sr接头(在3’连接反应后保持游离)，并将单链dna适配器转化为双链dna分子。此步骤对于防止接头二聚体形成很重要。将5’末端接头连接到mirna，sirna和pirna的5’末端，然后使用m-mulv逆转录酶(rnaseh)合成第一链cdna。使用longamptaq2x预混液，用于illumina的sr引物和索引(x)引物进行pcr扩增。pcr产物在8％聚丙烯酰胺凝胶(100v，80分钟)上纯化。回收对应于140-160bp(小rna长度加上3’和5’接头)的dna片段并溶解在8μl洗脱缓冲液中。最后，使用dna高灵敏度芯片在安捷伦生物分析仪2100系统上评估文库质量。
25.4)聚类和测序：
26.按照制造商的说明，使用truseqpe聚类分析试剂盒v4-cbot-hs(illumia)在cbot聚类分析生成系统上对索引编码样本进行聚类分析。聚类生成后，在illuminahiseq2500平台上对文库制备进行测序，然后生成双端读数。
27.5)数据处理
28.测序获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads，去除带接头(adapter)的reads；去除n(n表示无法确定碱基信息)的比例大于0.002的reads；当单端read中含有的低质量碱基数超过该条read长度比例的50％时，需要去除此对pairedreads。
29.6)比较分析
30.使用bowtie软件分别用silvadatabase、gtrnadb数据库、rfam数据库和repbase数据库序列绘制干净的读数，然后过滤核糖体rna(rrna)、转移rna(trna)、小核rna(snrna)、小核仁rna(snorna)和其他ncrna和重复序列。其余读数用于检测已知的mirna和新的mirna，这些是通过将数据与来自mirbase的已知mirna进行比较来预测的。采用randfold工具软件进行新的mirna二级结构预测。
31.7)差异表达分析
32.为了比较每份样本中的mirna表达水平以确定demirna(差异表达的mirna)，使用edger软件分析了从每份样本中获得的mirna的表达水平，并在使用百万分之转录本(tpm)算法对读取数进行标准化后，筛选了de mirna。使用de-seqr包对两种条件/组进行了差异表达分析。de-seq提供了统计学例程，用于使用基于负二项分布的模型确定数字mirna表达中的差异表达。使用benjamini和hochberg方法对得到的p值进行了调整，以控制假发现率，即使用经调整的p值的mirna。如果deseq发现调整后的p值为《0.05，则认为mirnas存在差异表达。
33.8)go和kegg富集分析
34.采用基因本体论(go)富集分析对差异表达mirnas的候选靶基因。基于goseq的瓦勒尼乌斯非中心超几何分布，可调整基因长度偏倚，并进行go富集分析。kegg是一个数据库资源，用于了解生物系统的高级功能和效用，如细胞、生物体和生态系统，从分子水平的信息，特别是由基因组测序和其他高通量实验系统生成的大规模分子数据集，使用kobas软件来检测kegg通路中候选靶基因的统计富集情况。
35.9)mirnas筛选
36.为了验证来自rna测序的mirna表达数据的重复性和准确性，对相同样本进行了demirnas的定量逆转录酶pcr(rt-qpcr)分析，根据其潜在的功能重要性，通过相关文献检索和预实验结果，选择了bta-mir-655作为靶标，对提取的存在体重差异的两组瘤胃组织rna进行定量逆转录酶pcr(qrt-pcr)分析和验证。根据上标iii逆转录(invitrogen，carlsbad，ca，usa)的说明，从转录组测序后剩余的总rna制备cdna。使用sybrpremix extaq(中国大连takara)在cfxconnect实时pcr检测系统(德国慕尼黑bio-rad)中进行sybrgreen分析，以β-actin作为内部对照，qpcr扩增体系为10μl，包括水3μl，前、反向引物各0.5μl，mix(sybrgreen)5μl，cdna1μl，采用以下循环条件：95℃1min20s；49℃20s；95℃5s、60℃5s、95℃5s，共45个循环。数据采用2-δδct
方法进行统计，并采用simplot11.2软件中的studentt检验进行统计分析，比较样本在p《0.05时的差异。发现mirna(bta-mir-655)在具有体重差异的犊牛瘤胃组织中存在差异表达，该bta-mir-655的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体序列如下，其表达量与犊牛的体重存在显著相关性，体重越高的bta-mir-655表达量越低，体重越低的bta-mir-655表达量越高。而牛体重情况也属于生长发育情况的主要表征之一，体重越高表明生长发育越好，体重低则说明生长发育差，因此，该bta-mir-655可以作为一种分子标记用于犊牛生长发育情况的监测。
37.bta-mir-655(seq id no.1)：
38.auaauacaugguuaaccucucu。
39.实验例1bta-mir-655的验证
40.针对转录组中的bta-mir-655开发了一组rt-qpcr引物(rt-qpcr-f、rt-qpcr-r)，具体序列如下所示(5
’→3’
)。
41.rt-qpcr-f(seq id no.2)：
42.ccataatacatggttaacctctctg；
43.rt-qpcr-r(seq id no.3)：
44.ccagtgcagggtccgag。
45.另取80日龄的相同饲喂条件下具有体重差异的中国荷斯坦犊牛(分为高体重组的和低体重组的犊牛各30头，共计60头)外周血样本，分别提取各样本的基因组rna并反转成cdna作为模板，通过上述设计的rt-qpcr引物进行qpcr验证，得到该bta-mir-655在体重差异犊牛中的表达量对比结果如图1所示，其中，
‘
*’代表差异显著；可知bta-mir-655在低体重组犊牛中的表达量明显高于高体重组犊牛中的表达量，这与实施例1中所得的结论相符，说明该bta-mir-655可以作为一种与犊牛生长发育相关的分子标记，用于犊牛生长情况的监测和辅助育种，在牛养殖业中用于犊牛的辅助育种，通过对早期的犊牛进行筛选鉴定，包括犊牛生长发育情况的预测和体重的筛查，在犊牛的遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。这对引物(rt-qpcr-f、rt-qpcr-r)还可用于开发一种常规检测试剂盒，用于犊牛生长发育的监测和筛查，在犊牛养殖领域中尤其在优势育种中具有显著的应用价值和经济效益。
46.综上可知，本发明开发出的bta-mir-655在具有体重差异的犊牛中存在差异表达，其表达量与犊牛体重有着高度相关性，在低体重的犊牛中表达量明显高于高体重犊牛，该mirna可以作为一种分子标记用于犊牛生长发育情况的监测和辅助育种，鉴定该bta-mir-655的引物同样可以用于犊牛的优势育种中，在犊牛的选育和生长情况监测中具有显著的
应用价值。本发明提供的设计思路和结果还可能有助于设计新的选择策略来改善中国荷斯坦犊牛育种，推动了牛养殖业更好的发展，应用潜力巨大。
47.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.一种与犊牛生长发育相关的分子标记，其特征在于，该分子标记为bta-mir-655，其核苷酸序列如seq id no.1所示，该bta-mir-655的表达量与犊牛生长发育负相关。2.如权利要求1所述的分子标记在牛养殖业中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包含犊牛的生长发育筛查或/和牛的辅助育种。4.鉴定如权利要求1所述分子标记的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示。5.如权利要求4所述的引物在牛养殖业中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该应用包含犊牛的生长发育筛查或/和牛的辅助育种。7.一种用于犊牛生长发育的监测和筛查试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含如权利要求4所述的引物。8.如权利要求7所述的试剂盒在牛养殖业中的应用，其特征在于，该应用包含犊牛的生长发育筛查或/和牛的辅助育种。

技术总结
本发明公开了一种与犊牛生长发育相关的分子标记bta-miR-655及其应用，属于分子标记制备技术领域。该分子标记bta-miR-655为一种miRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该bta-miR-655的表达量与犊牛的体重和生长发育有着高度相关性，体重越高的bta-miR-655表达量越低，体重越低的bta-miR-655表达量越高，该bta-miR-655可以作为一种与犊牛生长发育相关的分子标记，用于犊牛的优势育种，在犊牛的遗传辅助育种中具有重要的实际应用价值。传辅助育种中具有重要的实际应用价值。传辅助育种中具有重要的实际应用价值。


技术研发人员：王杰 倪家乐 赵开森 夏思琪 赖松家 贾先波 孙文强
受保护的技术使用者：四川农业大学
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/10/15