NPRC缺失通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡在减轻动脉粥样硬化中的应用的制作方法

nprc缺失通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡在减轻动脉粥样硬化中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及nprc缺失通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡在减轻动脉粥样硬化中的应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.动脉粥样硬化(as)引起的心血管疾病已成为全球人类死亡的主要原因，每年导致约1760万人死亡。虽然血脂异常和炎症等几个危险因素与as的发病机制有因果关系，但as发生和发展的确切机制尚不完全清楚。为了在中国汉族人群中发现易感基因并探索冠心病的遗传标记，我们最近对3363名冠心病患者和3148名对照进行了全基因组关联研究，发现利钠肽受体c(nprc)中有6个新的位点，即使在调整了传统的冠心病危险因素后，它们也与冠心病有显著的关联，这表明nprc-c基因snps在中国汉族人群中显著地促进了冠心病的易感性。然而，nprc基因多态性与cad之间关联的分子机制尚不清楚。nprc是利钠肽系统的成员，是公认的心房利钠肽(anp)、脑利钠肽(bnp)和c型利钠肽(cnp)的清除受体，通过内吞作用和溶酶体降解调节其生理功能，维持利钠肽系统平衡。anp和bnp分别主要由心室肌细胞和心房肌细胞分泌，而cnp主要由血管内皮细胞分泌。在正常动脉壁中，nprc主要在血管内皮细胞中表达，在血管平滑肌细胞(vsmcs)中表达较少。与钠肽受体a(npra)和钠肽受体b(nprb)这两种胍基环化酶受体不同，nprc缺乏胍基环化酶活性，但nprc的胞质结构域构成抑制腺苷基环化酶活性的鸟嘌呤核苷酸调节蛋白(gi)激活子序。
4.近年来的研究发现，利钠肽对受体的亲和力存在显著差异，对npra的亲和力排序为anp》bnp》cnp，对nprb的亲和力排序为cnp》anp》bnp，对nprc12的亲和力排序为bnp》cnp》anp。因此，anp和bnp更倾向于与npra结合，而nprb是cnp最青睐的合作伙伴。相比之下，nprc与anp、bnp和cnp13具有相似的亲和力。据报道，cnp通过cnp/nprb信号通路刺激骨生长。同样，nprc-/-小鼠也表现出相同的骨过度生长表型，这可能是由于nprc-/-小鼠血清中cnp水平升高所致。然而，nprc在动脉粥样硬化中的作用仍存在争议。尽管早期的研究表明，nprc表达的增加与动脉粥样硬化斑块的不稳定性有关，但最近的一项研究发现，cnp在动脉粥样硬化中维持血管稳态方面起着重要作用。最近，研究发现cnp与nprc结合可通过激活gi、erk1/2和磷酸肌苷3-激酶γ/akt信号通路促进缺血血管生成和血管重塑。因此，nprc对as病变是否有有益或有害的影响，以及这些影响的机制仍然是难以捉摸的。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供nprc缺失通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡在减轻动脉粥样硬化中的应用。本发明通过研究发现，nprc可通过增强氧化
应激、单核细胞/巨噬细胞迁移和吞噬、内皮细胞凋亡以及通过蛋白激酶a(pka)信号通路释放炎症介质来促进动脉粥样硬化病变的形成和不稳定性。基于上述研究成果，从而完成本发明。
6.本发明的第一个方面，提供检测nprc基因及其表达产物的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测动脉粥样硬化的进展的产品中的应用。
7.本发明的第二个方面，提供抑制nprc基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质在如下a1)-a9)至少一种中的应用：
8.a1)抑制内皮细胞促炎细胞因子的表达，从而抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬或制备抑制内皮细胞促炎细胞因子的表达，从而抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬的产品；
9.a2)增强akt1的磷酸化减轻oxldl诱导的内皮细胞凋亡或制备增强akt1的磷酸化减轻oxldl诱导的内皮细胞凋亡的产品；
10.a3)下调nf-κb通路抑制体内/外炎症反应或制备下调nf-κb通路抑制体内/外炎症反应的产品；
11.a4)减轻动脉粥样硬化病变或制备减轻动脉粥样硬化病变的产品；
12.a5)增强动脉粥样硬化病变稳定性或制备增强动脉粥样硬化病变稳定性的产品；
13.a6)减少血浆和动脉粥样硬化病变中的促炎细胞因子或制备减少血浆和动脉粥样硬化病变中的促炎细胞因子的产品；
14.a7)挽救enos表达以减轻主动脉组织和内皮细胞中的氧化应激或制备挽救enos表达以减轻主动脉组织和内皮细胞中的氧化应激的产品；
15.a8)激活camp/pka和cgmp/pkg通路或制备激活camp/pka和cgmp/pkg通路的产品；
16.a9)制备治疗动脉粥样硬化的产品。
17.本发明的第三个方面，提供促进nprc基因及其表达产物和/或使其活性提高的物质在如下b1)-b6)至少一种中的应用：
18.b1)促进内皮细胞促炎细胞因子表达，从而促进巨噬细胞迁移和体外吞噬或制备促进内皮细胞促炎细胞因子表达，从而促进巨噬细胞迁移和体外吞噬的产品；
19.b2)下调akt1的磷酸化促进oxldl诱导的内皮细胞凋亡或制备下调akt1的磷酸化促进oxldl诱导的内皮细胞凋亡的产品；
20.b3)上调nf-κb通路促进体内/外炎症反应或制备上调nf-κb通路促进体内/外炎症反应的产品；
21.b4)下调enos表达加重体内/外氧化应激或制备下调enos表达加重体内/外氧化应激的产品；
22.b5)降低动脉粥样硬化病变稳定性或制备降低动脉粥样硬化病变稳定性的产品；
23.b6)构建动脉粥样硬化病变细胞或动物模型。
24.本发明的第四个方面，提供一种动脉粥样硬化治疗的方法，所述方法包括：对受试者施用抑制nprc基因及其表达产物和/或活性降低的物质。
25.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
26.上述技术方案首次报道nprc在动脉粥样硬化病变中的表达增加，nprc的缺失减少了这些病变的大小并增加了这些病变的稳定性。nprc缺失可通过上调camp/pka-akt1通路
和下调nf-κb通路减弱氧化应激、炎症和内皮细胞凋亡，并增加enos表达。因此，靶向nprc可能为预防和治疗动脉粥样硬化提供了一种有希望的方法。
27.总之，上述技术方案为动脉粥样硬化病变发生发展提供了新的机制研究，并为动脉粥样硬化患者提供了有前景的治疗策略，因此具有良好的潜在实际应用价值。
附图说明
28.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
29.图1为本发明实施例中apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠表型的比较；(a)apoe-/-小鼠分别进行普食和高脂饮食喂养后nprc表达的代表性western blot图像。(b)分别普食和高脂饮食喂养的apoe-/-小鼠中nprc的表达量测定(每组n＝5)。(c)分别普食和高脂饮食喂养的apoe-/-小鼠主动脉根部nprc的代表性免疫荧光图像(比例尺＝100um)。(d)分别普食和高脂饮食喂养的apoe-/-小鼠主动脉根部nprc免疫荧光强度定量(每组n＝5)。(e)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠nprc表达的代表性western blot图像。(f)测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠中nprc的表达(每组n＝5)。(g)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠nprc的代表性免疫荧光图像(每组n＝5)。(h)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉根部nprc免疫荧光强度定量(每组n＝5)。(i)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠的代表性图像。(j)测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠的体重、体长、心率、收缩压、平均血压和舒张压(每组20只)。(k)血清tg、tc、hdl-c、ldl-c和vldl-c的定量测定(每组n＝10)。
30.图2为本发明实施例中apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠动脉粥样硬化病变和炎症细胞因子表达的比较；(a)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠正面主动脉油红o染色代表性图像(上图)和油红o阳性染色区域定量(下图)(每组n＝10)(标尺＝5mm)。(b)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉组织中h&e染色(标尺＝200um)、oil red o染色(标尺＝50um)、sirius红染色(标尺＝100um)及moma2(标尺＝50um)和α-sma(标尺＝50um)免疫组化染色的代表性图像。(c)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠横断面和面主动脉斑块面积以及moma2、α-sma和胶原i阳性染色面积的定量(每组n＝5)。(d)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠动脉粥样硬化病变中tnf-α、mcp1和il-6免疫组化染色的代表性图像(尺度＝50um)。(e)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠动脉粥样硬化病变中tnfα、mcp1和il-6阳性染色面积的定量(每组n＝5)。(f)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠动脉粥样硬化病变中icam1和vcam1免疫组化染色的代表性图像(scale＝100um)。(g)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠动脉粥样硬化病变中icam1和vcam1阳性染色面积定量(每组n＝5)。(h)msd法测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠血清il-6、mcp1、tnfα、icam1和vcam1水平(每组10只)。
31.图3为本发明实施例中nprcecwt和nprcecko小鼠动脉粥样硬化病变、炎症细胞因子表达和氧化应激的比较；(a)nprcecwt和nprcecko小鼠(每组n＝5)正面主动脉oil red o染色代表性图像(上图)和oil red o阳性染色区域定量(下图)(比例尺＝5mm)。(b)nprcecwt和nprcecko小鼠主动脉组织中moma2(scale bar＝50um)和α-sma(scale bar＝50um)的he染色(scale bar＝200um)、oil red o染色(scale bar＝50um)、sirius red染色(scale bar＝100um)及免疫组化染色的代表性图像。(c)定量nprcecwt和nprcecko小鼠横切面和正面主动脉斑块面积，以及moma2、α-sma和i型胶原阳性染色面积(每组n＝5)。(d)
nprcecwt和nprcecko小鼠动脉粥样硬化病变中tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1免疫组化染色的代表性图像(尺度＝50um)。(e)定量nprcecwt和nprcecko小鼠动脉粥样硬化病变中tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1阳性染色面积(每组n＝5)。(f)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中enos表达的代表性western blot图像(每组n＝5)。(g)测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中enos的表达(每组n＝5)。(h)测定apoe-/-小鼠和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉enos mrna水平(每组n＝5)。(1)elisa法定量测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠血清和主动脉中的oxldl水平(每组n＝5)。(j)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉根部ros的代表性dhe染色(尺度＝50um)。(k)测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉根部ros的平均荧光强度。(l)elisa法测定nprcecwt和nprcecko小鼠血清和主动脉中oxldl水平(每组5只)。(m)nprcecwt和nprcecko小鼠主动脉根部ros的代表性dhe染色(尺度＝50um)。(n)定量分析nprcecwt和nprcecko小鼠主动脉根部ros的平均荧光强度。
32.图4为本发明实施例中nprc的缺失增加了enos的表达，减轻了内皮氧化应激和炎症；(a)nprc在si-nc(阴性对照)和si-nprc(nprc敲低)haec中表达的代表性western blot图像。(b)si-nc和si-nprc haecs中nprc表达的定量(每组n＝5)。(c)oxldl刺激的si-nc和si-nprc haec中enos表达的代表性western blot图像。(d)oxldl刺激的si-nc和si-nprc haecs中enos表达的定量(每组n＝5)。(e)oxldl刺激的si-nc和si-nprc haec中ros的代表性dhe染色。(f)oxldl刺激si-nc和si-nprc haecs中ros平均荧光强度的定量(每组n＝5)。(g)oxldl刺激的si-nc和si-nprc haec中vcam1和icam1表达的代表性western blot图像。(h)oxldl刺激si-nc和si-nprc haecs中vcam1和icam1表达的定量(每组n＝5)。(i)氧化低密度脂蛋白激发si-nc和si-nprc haec的raw 264.7迁移的代表性图像(比例尺＝50um)。(j)si-nc和si-nprc haecs培养基刺激raw 264.7中结晶紫阳性细胞的定量(每组n＝5)。(k)在指定时间点oxldl刺激后si-nc和si-nprc haecs中mcp1、tnfα和il-6mrna表达水平的定量(每组n＝5)。(l)氧化ldl刺激后si-nc和si-nprc haecs培养基刺激raw 264.7吞噬的代表性图像(比例尺＝50um)。(m)油红o相对阳性染色面积定量(每组n＝5)。
33.图5为本发明实施例中nprc缺失增加akt1磷酸化，减轻氧化应激、炎症和细胞凋亡；(a)受oxldl刺激的si-nc和si-nprc haec的tunel检测代表性图像(标尺＝100um)。(b)oxldl刺激si-nc和si-nprc haec中tunel阳性细胞数量的定量(每组n＝5)。(c)oxldl刺激si-nc和si-nprc haec中p-akt1、akt1、cleaved-caspase 3、caspase 3、cleaved-caspase 7和caspase 7表达的代表性western blot图像。(d)测定氧化ldl刺激si-nc和si-nprc haecs中p-akt1、akt1、cleaved-caspase 3、caspase 3、cleaved-caspase 7和caspase 7的表达(每组n＝5)。(e)oxldl刺激的si-nc和si-nprc haec中il-6、tnfα和mcp1的代表性western blot图像。(f)il-6、tnfα和mcp1在氧化ldl刺激的si-nc和si-nprc haecs中的表达(每组n＝5)。(g)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中p-iκκα/β,iκκα,p-p65和p65表达的代表性western blot图像。(h)测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉p-iκκα/β,iκκα,iκκβ,p-p65和p65的表达(每组n＝5)。(i)oxldl刺激si-nc和si-nprc haec中p-iκκα/β,iκκα,iκκβ,p-p65和p65表达的代表性western blot图像。(j)测定氧化ldl刺激si-nc和si-nprc haecs中p-iκκα/β,iκκα,iκκβ,p-p65和p65的表达(每组n＝5)。(k)受oxldl刺激的si-nc和si-nprc haec中p-p65的代表性免疫荧光图像(比例尺＝50um)。(l)oxldl刺激si-nc和si-nprc haec细胞核p-p65免疫荧光强度定量(每组n＝5)。用shapiro-wilk法检验正
态分布。(b)、(g)和(l)采用未配对双尾student’s t检验。(d)、(f)和(j)采用双因素方差分析。
34.图6为本发明实施例中在体内和体外，nprc的缺失激活了camp/pka和cgmp/pkg通路；(a)测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉camp水平(每组n＝5)。(b)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中p-pka底物、p-creb和creb表达的代表性western blot图像。(c)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中p-pga底物和p-creb/creb表达的定量(每组n＝5)。(d)si-nc和si-nprc haec中p-pka底物表达的代表性western blot图像。(e)si-nc和si-nprc haecs中p-pka底物表达的定量(每组n＝5)。(f)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中p-vasp、vasp、pgc1α和ppar-γ表达的代表性western blot图像。(g)测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中p-vasp/vasp、pgc1α和ppar-γ的表达(每组n＝5)。(h)测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉pgc1α和ppar-γmrna水平(每组n＝5)。(i)apoe-/-小鼠和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉pgc1α、ppar-γ和p-creb免疫组化染色代表性图像(标尺＝50um)。(j)pgc1α、ppar-γ、p-creb相对阳性染色面积定量(每组n＝5)。(k)apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中npra、nprb、anp、bnp和cnp表达的代表性western blot图像。(l)定量测定apoe-/-和apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中npra、nprb、anp、bnp和cnp的表达(每组n＝5)。
35.图7为本发明实施例中apoe-/-和apoe-/-oe小鼠以及apoe-/-nprc-/-和andk oe小鼠动脉粥样硬化病变、炎症细胞因子表达和氧化应激的比较；(a)apoe-/-、apoe-/-oe、apoe-/-nprc-/-和andkoe小鼠(每组n＝5)正面主动脉oil red o染色代表性图像(上图)和oil red o阳性染色区域定量(下图)(标尺＝5mm)。(b)apoe-/-、apoe-/-oe、apoe-/-nprc-/-和andkoe小鼠主动脉组织中moma2(scale bar＝50um)，α-sma(scale bar＝50um)，he染色(scale bar＝200um)、oil red o染色(scale bar＝50um)、sirius red染色(scale bar＝100um)及免疫组化染色的代表性图像。(c)apoe-/-、apoe-/-oe、apoe-/-nprc-/-和andkoe小鼠横断面和面主动脉斑块面积以及moma2、α-sma和胶原i阳性染色面积的定量(每组n＝5)。(d)apoe-/-、apoe-/-oe、apoe-/-nprc-/-和andkoe小鼠动脉粥样硬化病变中tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1免疫组化染色的代表性图像(scale＝50um)。(e)apoe-/-、apoe-/-oe、apoe-/-nprc-/-和andkoe小鼠动脉粥样硬化病变中tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1阳性染色面积的定量(每组n＝5)。(f)oxldl刺激的e-nc和e-nprc haec中enos表达的代表性western blot图像。(g)oxldl刺激的e-nc和e-nprc haec中enos表达的定量(每组n＝5)。(h)elisa法测定apoe-/-小鼠和apoe-/
‑‑
小鼠血清和主动脉中oxldl水平(每组n＝5)。(i)apoe-/-、apoe-/-oe、apoe-/-nprc-/-和andkoe小鼠主动脉根部ros的dhe染色代表性图像(尺度＝50um)。(j)测定apoe-/-、apoe-/-oe、apoe-/-nprc-/-和andkoe小鼠主动脉根部ros的平均荧光强度。
36.图8为本发明实施例中nprc的过表达增加了巨噬细胞的炎症和凋亡，加剧了巨噬细胞的迁移和吞噬；(a)oxldl刺激的e-nc和e-nprc haec中icam1、vcam1、tnfα、mcp1和il-6表达的代表性western blot图像。(b)oxldl刺激的e-nc和e-nprc haecs中icam1、vcam1、tnfα、mcp1和il-6表达的定量(每组n＝5)。(c)氧化低密度脂蛋白刺激的oe-nc和oe-nprc haec中raw 264.7迁移的代表性图像(比例尺＝100um)。(d)si-nc和si-nprc haecs培养基刺激raw 264.7中结晶紫阳性细胞的定量(每组n＝5)。(e)si-nc和e-nprc haecs在oxldl刺
激后吞噬raw 264.7的代表性图像(比例尺＝100um)。(f)图8e中油红o的相对阳性染色面积定量(每组n＝5)。(g)oxldl刺激的1-nc和1-nprc haecs的tunel检测的代表性图像(比例尺＝100um)。(h)oxldl刺激的e-nc和si-nprc haecs中tunel阳性细胞的定量(每组n＝5)。(i)oxldl刺激的e-nc和e-nprc haec中p-akt1、akt1、cleaved-caspase3、caspase 3、cleaved-caspase 7和caspase 7表达的代表性western blot图像。(j)定量测定oxldl刺激的e-nc和e-nprc haecs中p-akt1/akt1、cleaved-caspase 3/caspase 3和cleaved-caspase 7/caspase 7的表达(每组n＝5)。
37.图9为本发明实施例中pka通路的激活上调enos和p-akt1，抑制p-p65的表达；(a)oxldl刺激的e-nc和e-nprc haec中p-iκκα/β,iκκα,iκκβ,p-p65和p65表达的代表性western blot图像。(b)定量测定氧化ldl刺激的e-nc和e-nprc haecs中p-iκκα/β,iκκα,iκκβ,p-p65和p65的表达(每组n＝5)。(c)受oxldl刺激的1-nc和1-nprc haec中p-p65的代表性免疫荧光图像(标尺＝50um)。(d)oxldl刺激的e-nc和e-nprc haec细胞核中p-p65免疫荧光强度的定量(每组n＝5)。(e)经forskolin和h89处理的haecs中p-pka底物表达的代表性western blot图像。(f)测定经forskolin和h89处理的haecs中p-pka底物的表达(每组n＝5)。(g)经forskolin和h89处理的haecs中enos表达的代表性western blot图像。(h)测定forskolin和h89处理的haecs中enos的表达(每组n＝5)。(i)经forskolin和h89处理的haecs中p-p65、p65、p-akt1和akt1表达的代表性western blot图像。(j)测定经forskolin和h89处理的haecs中p-p65/p65的表达(每组n＝5)。(k)经福斯克林和h89预处理，然后经oxldl刺激(标尺＝100um)的haec中tunel检测的代表性图像。(l)经forskolin和h89预处理，然后用oxldl刺激的haecs中tunel阳性细胞的定量(每组n＝5)。
38.图10为本发明实施例中nprc促进动脉粥样硬化的机制示意图。
具体实施方式
39.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
40.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
41.现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.本发明的一个典型具体实施方式中，提供检测nprc基因及其表达产物的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测动脉粥样硬化的进展的产品中的应用。
43.所述产品能够通过检测nprc基因和/或nprc基因表达产物(如利钠肽受体c)的表达水平来诊断、检测、监测或预测动脉粥样硬化的进展。本发明通过研究证明，nprc在体内动脉粥样硬化病变中表达升高，表明nprc在动脉粥样硬化发展的调节中具有潜在的作用。
44.其中，所述产品其包含基于高通量测序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探针杂交方法检测nprc的转录的物质；或基于免疫检测方法检测样品中nprc表达产物情况的物质。
45.本发明的又一具体实施方式中，提供抑制nprc基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质在如下a1)-a9)至少一种中的应用：
46.a1)抑制内皮细胞促炎细胞因子的表达，从而抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬或制备抑制内皮细胞促炎细胞因子的表达，从而抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬的产品；
47.a2)增强akt1的磷酸化减轻oxldl诱导的内皮细胞凋亡或制备增强akt1的磷酸化减轻oxldl诱导的内皮细胞凋亡的产品；
48.a3)下调nf-κb通路抑制体内/外炎症反应或制备下调nf-κb通路抑制体内/外炎症反应的产品；
49.a4)减轻动脉粥样硬化病变或制备减轻动脉粥样硬化病变的产品；
50.a5)增强动脉粥样硬化病变稳定性或制备增强动脉粥样硬化病变稳定性的产品；
51.a6)减少血浆和动脉粥样硬化病变中的促炎细胞因子或制备减少血浆和动脉粥样硬化病变中的促炎细胞因子的产品；
52.a7)挽救enos表达以减轻主动脉组织和内皮细胞中的氧化应激或制备挽救enos表达以减轻主动脉组织和内皮细胞中的氧化应激的产品；
53.a8)激活camp/pka和cgmp/pkg通路或制备激活camp/pka和cgmp/pkg通路的产品；
54.a9)制备治疗动脉粥样硬化的产品。
55.上述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。比如该产品可用于在体外调控巨噬细胞的迁移、细胞因子表达和吞噬；或者调控内皮细胞凋亡，从而构建相关细胞实验模型，具有良好实际应用价值。
56.其中，所述内皮细胞可以为人主动脉内皮细胞(haecs)或人脐静脉内皮细胞(huvecs)；
57.所述a1)中，促炎细胞因子包括但不限于促炎细胞因子及粘附分子，如tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1。
58.所述巨噬细胞表达的细胞因子包括但不限于tnfα、il-6和mcp-1。
59.本发明的又一具体实施方式中，所述应用a1)可以为：抑制内皮细胞nprc基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质在用于内皮细胞-巨噬细胞共培养体系中抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬或制备用于内皮细胞-巨噬细胞共培养体系中抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬的产品。
60.所述a3)中，抑制体内/外炎症反应具体表现为降低促炎细胞因子的表达，所述促炎细胞因子包括但不限于mcp1、tnfα和il-6。
61.其中，所述抑制nprc基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对nprc的rna干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、shrna(小发夹rna)、小干扰rna(sirna)，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对nprc本身或其上下游分子的特异性抗体，包括抗nprc抗体。
62.本发明的又一具体实施方式中，提供促进nprc基因及其表达产物和/或使其活性
提高的物质在如下b1)-b6)至少一种中的应用：
63.b1)促进内皮细胞促炎细胞因子表达，从而促进巨噬细胞迁移和体外吞噬或制备促进内皮细胞促炎细胞因子表达，从而促进巨噬细胞迁移和体外吞噬的产品；
64.b2)下调akt1的磷酸化促进oxldl诱导的内皮细胞凋亡或制备下调akt1的磷酸化促进oxldl诱导的内皮细胞凋亡的产品；
65.b3)上调nf-κb通路促进体内/外炎症反应或制备上调nf-κb通路促进体内/外炎症反应的产品；
66.b4)下调enos表达加重体内/外氧化应激或制备下调enos表达加重体内/外氧化应激的产品；
67.b5)降低动脉粥样硬化病变稳定性或制备降低动脉粥样硬化病变稳定性的产品；
68.b6)构建动脉粥样硬化病变细胞或动物模型。
69.其中，所述促进nprc基因及其表达产物和/或使其活性提高的物质包括但不限于人工合成的nprc的短发夹rna(short hairpin rna，shrna)或上调nprc表达的启动子、质粒或者慢病毒；同时也包括化合物类促进剂；所述化合物类促进剂可用于激活利钠肽受体c的表达。
70.所述内皮细胞可以为人主动脉内皮细胞(haecs)或人脐静脉内皮细胞(huvecs)；
71.上述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。比如该产品可用于在体外调控巨噬细胞的迁移、细胞因子表达和吞噬；或者调控内皮细胞凋亡，从而构建相关细胞实验模型，具有良好实际应用价值。
72.所述b1)中，促炎细胞因子包括但不限于促炎细胞因子及粘附分子，如tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1。
73.本发明的又一具体实施方式中，所述应用b1)可以为：促进内皮细胞nprc基因及其表达产物和/或使其活性提高的物质在用于内皮细胞-巨噬细胞共培养体系中促进巨噬细胞迁移和吞噬或制备用于内皮细胞-巨噬细胞共培养体系中促进巨噬细胞迁移和吞噬的产品。
74.根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
75.所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
76.所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
77.本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
78.本发明的又一具体实施方式中，提供一种动脉粥样硬化治疗的方法，所述方法包括：对受试者施用抑制nprc基因及其表达产物和/或活性降低的物质。
79.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
80.实施例
81.材料方法：
82.研究动物
83.8周龄apoe-/-雄性小鼠购自北京维通利华生物科技有限公司(北京，中国)。体内实验分为四部分。第一部分体内实验，将20只apoe-/-小鼠在22℃室温下进行12小时光照/12小时暗循环，随机分为两组(每组10只)，一组饲喂高脂高胆固醇的高脂饲料(tp28521，特罗菲，中国)，另一组饲喂普通饲料(lad0011，特罗菲，中国)，为期12周。在体内实验的第二部分，以c57bl/6背景小鼠为基础，采用crispr技术构建nprc-/-小鼠。我们利用crispr/cas9基因编辑技术获得nprc-/-小鼠，然后将apoe-/-小鼠与nprc-/-小鼠杂交，得到apoe-/-nprc-/-小鼠。第二部分体内实验，将50只小鼠随机分为apoe-/-组和同窝apoe-/-nprc-/-组(每组25只)，在22℃室温下光照/暗循环12小时。用高脂高胆固醇饲料(tp28521，特罗飞，中国)喂养12周。在体内实验的第三部分，将b6/jgpt-npr3em1cflox/flox小鼠与b6/jgpt-tekem1cin(icre)小鼠杂交，获得血管内皮细胞特异性nprc敲除(nprcecko)小鼠。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，确认nprcecko小鼠基因分型。20只小鼠随机分为两组：nprcecko组和同窝的nprcecwt组(每组10只)高脂喂养16周后经尾静脉注射2.5x1011vg pcsk9 aav诱导小鼠动脉粥样硬化模型。第四部分体内实验，将30只小鼠随机分为4组:10只apoe-/-小鼠和5只apoe-/-nprc
‑‑
小鼠(北京维固生物科技有限公司)，经尾静脉注射含有icam-2启动子-nprc-egfp-3flag-wpre-sv40_polya的2.5x1011vg aav9，诱导血管内皮细胞中nprc过表达(oe)，生成apoe-/-oe和andk(apoe和nprc双敲除)oe小鼠。另外，10只apoe-/-小鼠和5只apoe-/-nprc-/-小鼠经尾静脉注射含有icam-2启动子-egfp-3flag-wpre-sv40_polya的2.5x1011vg aav9诱导假nprc过表达。用高脂高胆固醇喂养12周。
84.实验动物以随机方式分组，研究者在进行实验方案时对小鼠组的分配不知情。所有动物实验方案均按照中国卫生部动物管理规定，经中国山东大学齐鲁医院伦理委员会和科学调查委员会批准。
85.体重、血压和血脂水平
86.所有小鼠在实验结束时用电子秤(岛津公司)测量体重。在上午9点至实验结束时，用无创尾袖系统(softron bp-98a，日本)测量所有接受训练适应该装置的小鼠的血压和心率，并以连续3次测量的平均值报告所得值。在使用过量戊巴比妥钠安乐死前，通过心脏穿刺从小鼠左心室采集血样。采用酶法测定了所有小鼠的血脂水平，包括总胆固醇(tc)(中国雷都，s03042)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)(中国雷都，s03029)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)(中国雷都，s03025)、极低密度脂蛋白胆固醇(vldl-c)(csb-e17089m，中国雷都)、甘油三酯(tg)(中国雷都，s03027)和氧化ldl(oxldl)(csb-e07933m，中国雷都)。
87.meso scale discovery特定蛋白分析(msd)，eia和camp测定
88.体内实验第二部分，血清样品在3000rpm下离心15分钟，收集50μl上清。基于电化学发光，将预包被的msd多因素检测板(k15069l-1)和msd检测器(quickplex sq120)(msd scale discovery,rockville,md,usa)联合检测血清tnf-α、il-6、mcp1、icam1和vcam1的水平。小鼠血清anp、bnp和cnp水平采用小鼠anp eia试剂盒(raybiotech,eiam-anp-1)、小鼠bnp eia试剂盒(raybiotech,eiam-bnp-1)和小鼠cnp eia试剂盒(raybiotech,eiam-cnp-1)，按照制造商的说明进行测定。信号在biotek平板阅读器上测量。按照制造商的说明，使用cyclicampxp化学发光测定试剂盒(cell signaling technologies,8019)测量主动脉组
织中的camp水平。信号在biotek平板阅读器上测量。
89.组织制备及组织病理学分析
90.在体内实验的第二、三、四部分，将升主动脉至髂分叉的主动脉段与周围组织分离，在4％多聚甲醛溶液中固定过夜，然后用oil red o染色，显示主动脉表面的动脉粥样硬化病变，同时对主动脉根部的冷冻切片进行染色，定量测量断面病变面积，分析病变成分。在he染色的5个连续切片(切片之间间隔60μm)上测量主动脉根部的横断病变面积。第一个切片被定义为捕获主动脉瓣的所有3个小叶，并选择第一个切片的近端和远端2个连续切片进行量化。为了测量脂质沉积斑块，我们用oil-red o对主动脉根病变进行染色。冷冻切片用免疫组化试剂对单核/巨噬细胞、血管平滑肌细胞和胶原进行染色，分别以moma2阳性、α-sma阳性和sirius red阳性面积与斑块面积之比进行定量。
91.免疫组织化学
92.在体内实验的第二、三、四部分，动脉粥样硬化小鼠主动脉根部冰冻切片在ddh2o中水化10min，用5％无免疫山羊血清在37℃下阻断30min，用一抗在4℃下孵育过夜。同时，我们用非免疫igg和溶剂pbs作为同一物种的阴性对照，以排除假阳性结果。次日用辣根过氧化物酶偶联二抗在25℃下孵育60min，使用dab试剂盒(zsgb-bio，北京)显色。免疫组化染色用苏木精对细胞核进行反染。用pbs洗涤后，用合适的荧光二抗(alexa fluor594,ab150077,abcam)在37℃下孵育30分钟，进行免疫荧光染色。细胞核用dapi(ab104139,abcam)在37℃下染色5min。在具有激发波长的荧光显微镜(ni-e,nikon,japan)下收集图像。
93.ros检测
94.在体内实验的第二、三、四部分，采用二氢乙二铵(dhe)荧光法测定细胞内和组织内ros水平。简单地说，用10μmol/l dhe孵育细胞30分钟，然后用无血清dmem洗涤3次。最后，用dapi反染细胞，并通过激光扫描共聚焦显微镜(lsm 710，蔡司)拍照。主动脉根部冷冻切片用10μmol/l dhe孵育1小时，然后用1xpbs洗涤3次。
95.基因表达rna-seq分析
96.在体内实验的第二部分，采用lc-bio technology公司(中国杭州)从apoe-/-小鼠(n＝5)和nprc-/-apoe-/-小鼠(n＝5)分离的整个主动脉进行rna-seq。每个样本从主动脉中提取1μg rna作为rna样品制备的输入材料。rna完整性采用bioanalyzer 2100(agilent,ca,usa)检测，rin值》7.0，变性琼脂糖凝胶电泳确认。poly(a)rna使用dynabeads oligo(dt)25-61005(thermo fisher,ca,usa)从1μg总rna中纯化。然后，使用镁rna碎片化模块(neb,cat)将聚(a)rna碎片化成小块。e6150,usa)在94℃下放置5-7min。随后，利用superscript
tm
ii逆转录酶(invitrogen,cat)对裂解的rna片段进行逆转录，生成cdna。1896649,usa)，接下来用大肠杆菌dna聚合酶i(neb,cat)合成u标记的第二链dna。m0209，美国)，rnase h(neb，美国)。m0297,usa)和dutp solution(thermo fisher,cat.)美国r0133)。然后将a碱基添加到每条链的钝端，以连接到索引适配器。每个接头都包含一个t基悬垂，用于将接头连接到a尾片段dna上。将单或双折射率适配器连接到碎片上，并使用ampurexp珠进行尺寸选择。热不稳定的udg酶(neb,cat。m0280,usa)处理u标记的第二链dna，用pcr扩增连接产物。最终cdna文库平均插入长度为300
±
50bp。最后，按照制造商的说明，在illumina novaseq
tm
6000(lc-bio technology co,ltd,hangzhou,china)上进行2
×
150bp配对端测序(pe150)。在去除低质量和未确定的碱基后，我们使用hisat2软件将reads定位到基因组。使用带默认参数的stringtie对每个样本的映射读取进行组装。估计所有转录本的表达水平并分析mrna的表达水平后，通过r包edger选择fold change》2或fold change《0.5且p值《0.05的差异表达mrna，分析kegg对差异激活通路的富集程度。
97.细胞培养
98.oxldl购自中国协盛公司，forskolin和h89购自美国mce公司。试剂和抗体的详细信息列于补充表1。从atcc中获得人主动脉内皮细胞(haecs)，并在内皮细胞生长培养基2(ecm,promocell c22010)中培养。小鼠巨噬细胞系(raw 264.7,atcc)在含有dmem(hyclone,usa)、添加10％牛血清(gibco,usa)和1％青霉素-链霉素(gibco,usa)的培养基中培养。如前文所述，在诱导性腹膜炎模型中收集腹腔巨噬细胞3。简单地说，将无菌的3％肉汤1ml腹腔注射到小鼠体内。用30ml非血清dmem灌洗腹腔3次，72h后收集细胞悬液。1000转/分离心5分钟后，用新鲜的完整培养基重新悬浮细胞，培养用于后续实验。人巨噬细胞由thp-1细胞系(cl-0233,procell，中国)经100nm pma(hy-18739,mce，美国)处理24h获得。用nprc sirna双链(si-nprc)或nprc过表达质粒(e-nprc)转染haec。用无义sirna双链(si-nc)或空载体(e-nc)转染的haec作为对照。oxldl刺激24h后，收集上清作为内皮条件培养基进行后续实验。
99.rna干扰
100.lipofectamine rnaimax试剂(invitrogen,usa)用于将sirna双链瞬时转染到haec中。沉默效率较高的sirna序列为:阴性对照(nc)序列:5
′‑
uucuccgaacgugucacfutt-3
′
，反义5
′‑
acgugacacguu cggagaat-3
′
。人nprc序列来源于广州瑞博。
101.质粒转染
102.采用lipofectamine 3000试剂(美国invitrogen公司)将icam-2启动子-nprc-egfp-3flag-wpre-sv40_polya或icam-2启动子-egfp-3flag-wpre-sv40_polya转染到haec中。
103.迁移分析
104.采用transwell趋化法测定巨噬细胞迁移。将等量的raw 264.7细胞置于transwell(corning 3422)的上层，在细胞透膜下加入含有oxldl(100μg/ml)的ec条件培养基12小时。用结晶紫染色液对迁移过膜的细胞进行染色，并在显微镜下按5个随机场计数。
105.巨噬细胞oxldl吞噬测定
106.巨噬细胞oxldl吞噬实验如前所述4。raw264.7细胞(2
×
105)在12孔板15mm玻璃罩上镀，用含oxldl(100μg/ml)的ec条件培养基处理36小时。4％ pfa固定细胞10分钟，油红o染色10分钟，60％异丙醇冲洗5秒。用徕卡显微镜捕获细胞图像，计算oil-red o阳性染色面积与整个细胞面积的比值，定量oxldl的吞噬程度。
107.细胞凋亡检测
108.采用原位细胞死亡检测试剂盒(roche)tunel染色检测细胞凋亡。用4％多聚甲醛在室温下固定1小时，pbs洗涤3次。然后，用0.1％ triton x-100在pbs中渗透细胞，用tunel反应混合物在37℃下染色1h。最后，用dapi反染细胞，并通过激光扫描共聚焦显微镜(lsm 710，蔡司)拍照。
109.统计分析
110.所有数据均以均数
±
sem表示。所有分析均使用graphpad prism 8(graphpad,san diego,ca)进行。每个实验至少独立重复5次。采用shapiro-wilk检验评估数据分布的正态性假设。对于正态分布，采用非配对双尾student's t检验来确定两组之间的统计差异。为了确定单变量多组间的统计学差异，采用单因素方差分析，然后进行dunnett或tukey事后检验。采用双因素方差分析，然后采用tukey或sidak事后检验来比较具有多个变量的多组。对非正态分布的数据进行非参数统计分析，采用kruskal-wallis检验和dunn post-hot检验进行单变量多重比较。在所有的统计学比较中，p值《0.05认为有统计学意义。
111.结果：
112.1.nprc在体内动脉粥样硬化病变中表达升高
113.在体内实验的第一部分中，western blot分析显示，与普通喂养相比，高脂喂养apoe-/-小鼠主动脉组织中nprc的表达增加(图1a和1b)。通过nprc免疫荧光染色，两组小鼠主动脉根部观察到相似的结果(图1c和1d)。nprc在动脉粥样硬化病变中表达的增加表明nprc在动脉粥样硬化发展的调节中具有潜在的作用。
114.2.nprc缺失可减轻体内动脉粥样硬化病变
115.为了探索nprc在动脉粥样硬化病变形成中的作用，我们在体内实验的第二部分中产生了apoe-/-nprc-/-小鼠。western blot和免疫荧光法证实apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中nprc表达不足(图1e-1h)。apoe-/-nprc-/-小鼠表现出骨过度生长表型，与同窝的apoe-/-小鼠相比，体长(图1i和1j)和主动脉长度(图2a)明显增加。apoe-/-nprc-/-与apoe-/-小鼠的体重、心率、舒张压和平均血压(图1j)以及血清tc、ldl-c、hdl-c和vldl-c水平均无显著差异(图1k)。然而，apoe-/-nprc-/-小鼠的收缩压和血清tg水平低于其同伴apoe-/-小鼠，后者可能与apoe-/-nprc-/-小鼠的表型较薄有关(图1j和1k)。与apoe-/-小鼠相比，nprc的系统性缺失导致动脉粥样硬化病变面积减少63％(p《0.001)。同样，h&e染色显示，apoe-/-nprc-/-小鼠与apoe-/-小鼠相比，主动脉根部动脉粥样硬化病变的横截面积减少了60％(p《0.001)(图2b和2c)。这些结果表明，相对于apoe-/-小鼠，nprc缺失减轻了apoe-/-nprc-/-小鼠的动脉粥样硬化病变。
116.3.nprc缺失增强了体内动脉粥样硬化病变的稳定性
117.接下来，在第二部分体内实验中，我们通过对主动脉根部的免疫染色来分析动脉粥样硬化病变的细胞组成。apoe-/-nprc-/-小鼠与apoe-/-小鼠相比，这些病变中moma2
+-巨噬细胞/单核细胞的相对含量和油红o阳性染色面积分别减少了59％(p《0.001)和43％(p《0.01)，表明nprc的缺失大大减少了动脉粥样硬化病变的炎症程度和脂质沉积。另一方面，与apoe-/-nprc-/-小鼠相比，apoe-/-nprc-/-小鼠动脉粥样硬化病变区α-平滑肌肌动蛋白阳性染色面积测量的平滑肌细胞相对含量和sirius-red阳性染色面积测量的胶原相对含量分别增加了84％(p《0.001)和64％(p《0.001)(图2b和2c)。因此，与apoe-/-小鼠相比，apoe-/-nprc-/-小鼠的动脉粥样硬化病变易损性指数降低了53％(p《0.001)(图2c)。这些结果表明，与apoe-/-小鼠相比，系统性nprc缺失增强了apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉粥样硬化病变的稳定性。
118.4.在体内，nprc的缺失减少了血浆和动脉粥样硬化病变中的促炎细胞因子
119.为了揭示nprc缺失介导的抗动脉粥样硬化作用的潜在分子机制，我们使用apoe-/-nprc-/-和apoe-/-小鼠的整个主动脉进行了rna高通量测序。结果显示，在kegg或
go通路富集分析中，apoe-/-nprc-/-和apoe-/-小鼠之间表现出最显著差异的前10条通路是炎症相关通路。此外，qpcr、western blot和免疫组化染色(图2d至2g)显示，apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉组织中促炎细胞因子tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1的表达水平低于apoe-/-小鼠。此外，apoe-/-nprc-/-小鼠血清中tnfα、il-6、mcp1、icam1和vcam1水平显著低于apoe-/-小鼠(图2h)。这些数据表明，nprc缺失导致apoe-/-小鼠局部和全身性炎症的显著减少。
120.5.内皮细胞特异性nprc敲除可减轻体内动脉粥样硬化病变的大小和不稳定性
121.首先，我们通过qpcr比较了nprc在体外haecs、vsmcs和巨噬细胞中的表达水平，发现nprc在vsmcs中的表达低于haecs，在巨噬细胞中的表达极低，提示内皮细胞中nprc的缺失可能足以达到有益的效果。此外，我们通过免疫荧光法比较了动脉粥样硬化病变和无病变主动脉根壁之间nprc的表达水平，发现nprc的表达主要在内皮细胞中上调，而在平滑肌细胞中的表达则少得多。因此，在体内实验的第三部分，我们将tek-cre小鼠与nprcflox/flox小鼠杂交，得到nprcecko小鼠。nprcecko小鼠和同窝nprcecwt小鼠经尾静脉注射pcsk9 aav后，以高脂喂养16周。实验结束时，nprcecko与同窝nprcecwt小鼠血清tg、tc、ldl-c、hdl-c、vldl-c水平无显著差异。免疫荧光法证实nprcecko小鼠主动脉中nprc表达不足。与nprcecwt小鼠相比，nprcecko小鼠的动脉粥样硬化病变面积减少27％(p《0.01)，经主动脉油红o染色证实(图3a)。同样，与nprcecko小鼠相比，nprcecko小鼠主动脉根部动脉粥样硬化病变的横截面积减少了35％(p《0.001)(图3b和3c)。这些结果表明，内皮细胞特异性的nprc缺失减轻了动脉粥样硬化病变，尽管程度低于系统性的nprc缺失，可能是因为nprc也在vsmcs中表达(补充图3e-3g)。此外，与同窝的nprcecwt小鼠相比，nprcecko小鼠这些病变中moma
2+-巨噬细胞/单核细胞的相对含量和油红o阳性染色面积分别减少了19％(p《0.01)和13％(p《0.05)(图3b和3c)，这表明内皮细胞特异性nprc的缺失大大减轻了动脉粥样硬化病变的炎症程度和脂质沉积。相比之下，nprcecko小鼠与同窝的nprcecwt小鼠相比，α-平滑肌肌动蛋白阳性染色区测量的平滑肌细胞相对含量和天狼星红阳性染色区测量的胶原蛋白相对含量分别增加了50％(p《0.001)和53％(p《0.001)(图3b和3c)。因此，与同窝的nprcecko小鼠相比，nprcecko小鼠的动脉粥样硬化病变易损指数降低了60％(p《0.001)(图3c)。免疫组化染色结果显示，nprcecko小鼠主动脉组织中促炎因子tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1的表达水平明显低于nprcecwt小鼠(图3d和3e)。这些数据表明，内皮细胞特异性nprc缺失减轻了局部和全身炎症，增强了动脉粥样硬化病变的稳定性。
122.6.nprc缺陷通过挽救enos表达来减轻主动脉组织和haec中的氧化应激
123.血管内皮细胞合成并释放一氧化氮(no)，激活vsmcs中的pkg信号通路，维持血管扩张，内皮no合成酶(enos)是内皮细胞中催化no形成的主要酶，enos在维持内皮功能和血管稳态中起关键作用。在第二部分体内实验中，我们通过western blot和qpcr发现，在apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉中，与apoe-/-小鼠相比，enos的表达增强(图3f-3h)。此外，通过免疫荧光检测，apoe-/-nprc-/-小鼠与apoe-/-小鼠相比，nprcecko小鼠与nprcecwt小鼠相比，主动脉根部p-enos表达上调。由于内皮源性no还可以作为抗氧化剂抑制ldl氧化和过氧化物酶，我们测量了小鼠血清和主动脉组织中氧化ldl水平以及主动脉根部的ros水平。我们发现，与apoe-/-nprc-/-小鼠相比，apoe-/-小鼠血清和主动脉组织中氧化ldl水平以及dhe染色检测的主动脉根部ros水平均降低(图3i-3k)。在第三部分体内实验中，nprcecko
小鼠与同窝的nprcecwt小鼠相比，主动脉组织氧化ldl水平和主动脉根部ros水平也有所降低(图3l-3n)，进一步验证了上述结果。同样，在体外，oxldl刺激时间依赖性地下调了haec中enos的表达，而在oxldl处理的haec中，nprc的敲低实质上恢复了enos的表达(图4a至4d)。此外，敲低nprc可减轻氧化低密度脂蛋白在haec中诱导的ros生成(图4e和4f)。这些结果表明，nprc缺失通过挽救enos表达来保护内皮细胞免受氧化应激。
124.7.nprc敲除通过对体外haec的影响抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬
125.先前的研究报道，内皮细胞在动脉粥样硬化的早期阶段被激活，从而分泌粘附分子和趋化因子，招募巨噬细胞进入血管壁。因此，我们研究了内皮细胞nprc的敲低是否会影响haec中粘附分子和趋化因子的表达，结果显示，促炎粘附分子如icam1和vcam1的表达在oxldl刺激后呈时间依赖性上调，而这种趋势在haec中被nprc敲低显著减弱(图4g和4h)。我们发现，与对照haecs培养基相比，nprc敲除haecs培养基对raw 267.4细胞的迁移刺激更少(图4i和4j)。此外，qpcr结果显示，oxldl处理后，对照haec培养基刺激的巨噬细胞中tnfα、il-6和mcp-1的表达增加。相比之下，在氧化低密度脂蛋白处理后，这些细胞因子的表达在由nprc敲低的haec培养基刺激的腹膜巨噬细胞中下调(图4k)。最后，与对照组haecs培养液刺激的巨噬细胞相比，nprc敲低haecs培养液刺激的巨噬细胞对脂质的吞噬更少(图4l和4m)。综上所述，这些结果表明，nprc敲低抑制haecs中促炎细胞因子的表达，从而抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬。
126.8.nprc敲除通过增强体外akt1磷酸化来减轻haec的凋亡
127.在动脉粥样硬化过程中，血管内皮细胞凋亡的增加可能破坏内皮的完整性，使促炎细胞迁移到动脉壁。在本研究中，我们首先通过tunel检测了oxldl刺激后体外haecs的凋亡状态，发现oxldl增加了凋亡的haecs数量，而在haecs中敲低nprc有效地减弱了oxldl诱导的凋亡(图5a和5b)。此外，我们测量了几种凋亡相关蛋白的表达水平，如切割-caspase3和切割-caspase7，它们在nprc敲除的haecs中与对照haecs相比下降(图5c和5d)。由于p-akt1在保护内皮细胞免于凋亡中起着重要作用，我们进一步检查了akt1的磷酸化水平，发现在对照haec中，在oxldl刺激后，akt1的磷酸化水平呈时间依赖性下降，而在接受相同oxldl处理的nprc敲低的haec中，这种趋势部分得到恢复(图5c和5d)。这些结果表明，nprc敲低通过增强akt1的磷酸化来阻止oxldl诱导的内皮细胞凋亡。
128.9.nprc敲除通过下调nf-κb通路抑制体内外炎症反应
129.既往研究表明，活化的nf-κb信号通路可诱导内皮细胞中icam1、vcam1、e-选择素、p-选择素等细胞粘附分子以及mcp1、il-6、tnfα等促炎趋化因子和细胞因子的转录。在本研究中，通过western blot(图5e和5f)和qpcr显示，nprc敲低的haecs显示mcp1、tnfα和il-6的表达显著降低。此外，对照haec上清液中mcp1、tnfα和il-6的水平在oxldl刺激后显著升高，而nprc敲除的haec上清液中这些细胞因子的水平在oxldl刺激后明显降低。更重要的是，在第二部分体内实验中，我们发现apoe-/-nprc-/-小鼠主动脉组织中p65和ikkα/β的磷酸化水平远低于apoe-/-小鼠(图5g和5h)。此外，我们发现在对照haecs中，oxldl刺激后p65和ikkα/β的磷酸化水平显著且随时间增加，而在nprc敲除的haecs中，oxldl刺激后p65和ikkα/β的磷酸化水平显著减弱(图5i和5j)。我们还发现，在nprc敲除的haec中，p-p65蛋白进入细胞核的易位少于对照的haec(图5k和5l)。这些结果表明，在haec中，nprc的下调通过抑制促炎的nf-κb信号通路来减轻炎症。
nprc-/-小鼠相比分别增加了28％(p《0.05)和15％(p《0.05)。提示nprc过表达大大加重了动脉粥样硬化病变的炎症程度和脂质沉积(图7b和7c)。相比之下,平滑肌细胞的相对含量以alpha-smooth肌肉肌动蛋白阳性染色区域,以及胶原蛋白以sirius-red在动脉粥样硬化病变阳性染色面积下降了42％(p《0.05)和19％(p《0.05),分别在apoe-/oe小鼠与同窝出生仔畜apoe-/-小鼠相比,下降了52％(p《0.001)和14％(p《0.05),分别在andkoe老鼠相对于同窝出生仔畜apoe-/-nprc-/-小鼠7(图7b和c)。因此，apoe-/-oe小鼠与apoe-/-小鼠相比，动脉粥样硬化病变易损指数增加了39％(p《0.01)，andkoe小鼠与apoe-/-nprc-/-小鼠相比，易损指数增加了43％(p《0.01)(图7b和7c)。这些结果表明，在apoe-/-或apoe-/-nprc-/-的背景下，内皮细胞nprc过表达削弱了主动脉粥样硬化病变的稳定性。
135.12.nprc过表达增加了体内动脉粥样硬化病变中促炎细胞因子的表达
136.第四部分体内实验中，免疫组化染色结果显示，与apoe-/-oe小鼠相比，apoe-/-oe小鼠主动脉组织中促炎细胞因子及粘附分子tnfα、mcp1、il-6、icam1、vcam1表达水平上调。同样，与apoe-/-nprc-/-小鼠相比，andkoe小鼠主动脉组织中tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1的表达增加(图7d和7e)。这些数据表明，内皮细胞nprc过表达导致apoe-/-小鼠炎症显著加重。
137.13.nprc过表达通过下调enos表达加重体内外氧化应激
138.为了进一步阐明nprc调控内皮细胞功能的机制，我们通过western blot证实了nprc在haecs中过表达。根据上述结果，在体内和体外，nprc缺失挽救了enos的下调表达，oxldl处理后，enos在haec中表达降低，在nprc过表达的haec中进一步下降(图7f和7g)。enos表达降低导致nprc-过表达小鼠主动脉组织中oxldl和ros水平相对于对照组升高(图7h至7j)。提示nprc过表达加重了促动脉粥样硬化刺激诱导的体内外氧化应激。
139.14.nprc过表达促进促炎细胞因子表达、巨噬细胞迁移和体外吞噬
140.oxldl刺激后，促炎细胞因子和粘附分子tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1的表达水平在haecs中呈时间依赖性上调，而nprc在haecs中的过表达则显著增强了这一趋势(图8a和8b)。此外，与对照haecs培养基相比，nprc过表达的haecs培养基刺激raw 267.4细胞表现出更广泛的迁移(图8c和8d)。单核细胞过表达的haecs培养基刺激的巨噬细胞比对照haecs培养基刺激的巨噬细胞对脂质有更多的吞噬作用(图8e和8f)。这些结果表明，nprc过表达促进了haec中促炎细胞因子的表达，从而增加巨噬细胞的迁移和吞噬。
141.15.nprc过表达通过体外抑制akt1磷酸化聚集haecs凋亡
142.与空载体组相比，nprc在haecs中过表达增加了oxldl诱导的细胞凋亡(图8g和8h)。此外，与空载体转染的haecs相比，nprc过表达的haecs中几种凋亡相关蛋白的表达水平显著增加，如切割-caspase3和切割-caspase7(图8i和8j)。akt1的磷酸化水平在对照haec中受到oxldl刺激后下降，在接受相同oxldl处理的nprc过表达的haec中进一步下降(图8i和8j)。综上所述，这些结果表明nprc过表达通过下调akt1磷酸化促进oxldl诱导的内皮细胞凋亡。
143.16.nprc过表达通过上调nf-κb通路增加炎症反应
144.在本研究中，内皮细胞的nprc敲除和haecs的nprc敲除分别显著降低了体内和体外p65和ikkα/β的磷酸化水平。此外，与对照haecs相比，oxldl刺激后nprc过表达的haecs中p65和ikkα/β的磷酸化水平显著升高(图9a和9b)。此外，在nprc过表达的haecs中，p-p65蛋
白比对照haecs更明显地易位到细胞核中(图9c和9d)。这些结果表明，在haecs中，nprc的过表达通过上调促炎nf-κb信号通路加重炎症。
145.17.激活pka信号通路可抑制促炎细胞因子的表达和内皮细胞凋亡
146.为了理解为什么nprc的缺失会增加主动脉组织和haecs中enos的表达，我们使用pka的激动剂forskolin和pka的拮抗剂h89来治疗haecs，发现经forskolin处理的haecs中p-pka底物的表达显著增加，而经h89处理的haecs中p-pka底物的表达被逆转(图9e和9f)。此外，经forskolin刺激24h的haecs中enos的表达显著增强，但在haecs中被h89处理抵消(图9g和9h)。我们利用forskolin和h89探讨haecs中pka通路激活与nf-κb信号的关系，发现在haecs中，forskolin刺激后p65的磷酸化水平显著降低，而h89处理后p65的磷酸化水平显著升高(图9i和9j)。最后，由于pka/p-akt1通路在调节内皮细胞凋亡中起主要作用，我们利用forskolin和h89进一步探讨了pka/p-akt1通路与haecs凋亡的关系。我们发现，在haecs中，forskolin处理增加了akt1的磷酸化水平，而h89处理显著降低了akt1的磷酸化水平(图9i和9j)。为了验证这一结果，我们在oxldl刺激后将forskolin和h89作用于haecs 24h，结果显示，用forskolin预处理haecs时，tunel检测到的凋亡细胞数量减少，而用h89预处理haecs时，凋亡细胞数量明显增加(图9k和9l)。综上所述，这些数据表明pka信号通路的激活抑制nf-κb信号通路和内皮细胞凋亡。
147.综上，nprc在动脉粥样硬化病变中的表达增加，nprc的缺失减少了这些病变的大小并增加了这些病变的稳定性。nprc缺失可通过上调camp/pka-akt1通路和下调nf-κb通路减弱氧化应激、炎症和内皮细胞凋亡，并增加enos表达(图10)。因此，靶向nprc可能为预防和治疗动脉粥样硬化提供了一种有希望的方法。
148.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.检测nprc基因及其表达产物的物质在制备用于诊断、检测、监测或预测动脉粥样硬化的进展的产品中的应用。2.抑制nprc基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质在如下a1)-a9)至少一种中的应用：a1)抑制内皮细胞促炎细胞因子的表达，从而抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬或制备抑制内皮细胞促炎细胞因子的表达，从而抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬的产品；a2)增强akt1的磷酸化减轻oxldl诱导的内皮细胞凋亡或制备增强akt1的磷酸化减轻oxldl诱导的内皮细胞凋亡的产品；a3)下调nf-κb通路抑制体内/外炎症反应或制备下调nf-κb通路抑制体内/外炎症反应的产品；a4)减轻动脉粥样硬化病变或制备减轻动脉粥样硬化病变的产品；a5)增强动脉粥样硬化病变稳定性或制备增强动脉粥样硬化病变稳定性的产品；a6)减少血浆和动脉粥样硬化病变中的促炎细胞因子或制备减少血浆和动脉粥样硬化病变中的促炎细胞因子的产品；a7)挽救enos表达以减轻主动脉组织和内皮细胞中的氧化应激或制备挽救enos表达以减轻主动脉组织和内皮细胞中的氧化应激的产品；a8)激活camp/pka和cgmp/pkg通路或制备激活camp/pka和cgmp/pkg通路的产品；a9)制备治疗动脉粥样硬化的产品。3.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述产品为药物或者实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。4.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述内皮细胞为人主动脉内皮细胞或人脐静脉内皮细胞。5.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述a1)中，促炎细胞因子包括促炎细胞因子及粘附分子，进一步包括tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1；所述巨噬细胞表达的细胞因子包括tnfα、il-6和mcp-1。6.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述应用a1)为：抑制内皮细胞nprc基因及其表达产物和/或使其活性降低的物质在用于内皮细胞-巨噬细胞共培养体系中抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬或制备用于内皮细胞-巨噬细胞共培养体系中抑制巨噬细胞迁移、细胞因子表达和吞噬的产品。7.如权利要求2所述应用，其特征在于，所述a3)中，抑制体内/外炎症反应具体表现为降低促炎细胞因子的表达，所述促炎细胞因子包括mcp1、tnfα和il-6。8.促进nprc基因及其表达产物和/或使其活性提高的物质在如下b1)-b6)至少一种中的应用：b1)促进内皮细胞促炎细胞因子表达，从而促进巨噬细胞迁移和体外吞噬或制备促进内皮细胞促炎细胞因子表达，从而促进巨噬细胞迁移和体外吞噬的产品；b2)下调akt1的磷酸化促进oxldl诱导的内皮细胞凋亡或制备下调akt1的磷酸化促进oxldl诱导的内皮细胞凋亡的产品；b3)上调nf-κb通路促进体内/外炎症反应或制备上调nf-κb通路促进体内/外炎症反应
的产品；b4)下调enos表达加重体内/外氧化应激或制备下调enos表达加重体内/外氧化应激的产品；b5)降低动脉粥样硬化病变稳定性或制备降低动脉粥样硬化病变稳定性的产品；b6)构建动脉粥样硬化病变细胞或动物模型。9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述内皮细胞为人主动脉内皮细胞或人脐静脉内皮细胞；上述产品为药物或者实验试剂，所述实验试剂供基础研究使用。10.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述b1)中，促炎细胞因子包括促炎细胞因子及粘附分子，进一步包括tnfα、mcp1、il-6、icam1和vcam1；所述应用b1)为：促进内皮细胞nprc基因及其表达产物和/或使其活性提高的物质在用于内皮细胞-巨噬细胞共培养体系中促进巨噬细胞迁移和吞噬或制备用于内皮细胞-巨噬细胞共培养体系中促进巨噬细胞迁移和吞噬的产品。

技术总结
本发明属于生物医药和分子生物学技术领域，具体涉及NPRC缺失通过抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡在减轻动脉粥样硬化中的应用。本发明首次报道NPRC在动脉粥样硬化病变中的表达增加，NPRC的缺失减少了这些病变的大小并增加了这些病变的稳定性。NPRC缺失可通过上调cAMP/PKA-AKT1通路和下调NF-κB通路减弱氧化应激、炎症和内皮细胞凋亡，并增加eNOS表达。因此，靶向NPRC可能为预防和治疗动脉粥样硬化提供了一种有希望的方法。总之，本发明为动脉粥样硬化病变发生发展提供了新的机制研究，并为动脉粥样硬化患者提供了有前景的治疗策略，因此具有良好的潜在实际应用价值。此具有良好的潜在实际应用价值。此具有良好的潜在实际应用价值。


技术研发人员：张杰 成程 张澄 张运 杨建民 孙超南 考春雨
受保护的技术使用者：辽宁省肿瘤医院
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/15