羟基脲在制备用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及羟基脲在制备用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物中的应用，其能够通过特异性靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna，能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞中suz12的表达，降低h3k27三甲基化的修饰水平，并且能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞的增殖和成瘤能力。


背景技术：

2.视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，rb)是儿童最常见的眼内恶性肿瘤，可致盲、致残、致死。我国每年的新发病例占全世界20％，其发病人数位居世界首位。2019年，rb被国家卫健委等五部委列为十大需要重点救治的儿童肿瘤之一。rb好发于3岁以下的婴幼儿，约1/3患者可遗传，遗传型患者子代的发病风险近50％，并且几乎全部累及双眼。随着诊断技术的提高与治疗新方法的普及应用，20世纪90年代后，发达国家rb患儿的生存率接近95％。然而，在人口基数庞大、医疗资源不均的发展中国家，rb的早期诊断与治疗仍是悬而未决的问题。
3.目前，化疗是rb的主要治疗方法，化疗分为全身静脉化疗和眼动脉介入化疗。全身静脉化疗能够显著提高患儿的保眼率和生存率，减少放射治疗在rb中的应用，显著降低第二肿瘤的发生率。然而，由于化疗药物的生物利用度不足，全身静脉化疗存在保眼治疗有效率低、全身副作用大、部分患儿无法耐受等缺点。眼动脉介入化疗于十余年前被用于rb保眼治疗，眼动脉能够将化疗药物直接运载至眼内瘤体，在提高患儿保眼率的同时，降低了全身并发症。值得注意的是，多数患者仍需多次介入治疗，且眼部并发症多，对部分恶性程度较高和肿瘤耐药的患者，治疗效果仍不理想。综上所述，深入揭示rb发病机制，寻找rb有效治疗新靶点，降低rb死亡率是亟待解决的难题。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明的目的在于提供羟基脲(hydroxyurea，hu)在制备用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物中的应用。
5.为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：
6.第一个方面，本发明提供一种靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna的生物标记物，所述生物标记物为如下化学式(i)所示的羟基脲(hydroxyurea)或其药学上可接受的盐：
7.8.第二个方面，本发明还提供一种用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物组合物，所述药物组合物包括如上所述的靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna的生物标记物。
9.优选地，所述靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna的生物标记物为羟基脲或其药学上可接受的盐。
10.优选地，所述药物组合物还包括医学上可接受的辅料或载体。
11.优选地，所述药物组合物的剂型选自片剂、粉剂、注射剂、胶囊、混悬剂、糊剂、凝胶、涂布剂、药膜剂、缓释剂或微球。
12.第三个方面，本发明还提供羟基脲或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物中的应用，所述羟基脲或其药学上可接受的盐能够靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna。
13.优选地，所述视网膜母细胞瘤肿瘤细胞为人视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞。
14.优选地，所述羟基脲或其药学上可接受的盐能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞中suz12的表达，降低h3k27三甲基化的修饰水平。
15.优选地，所述羟基脲或其药学上可接受的盐能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞的增殖和成瘤能力。
16.优选地，所述羟基脲或其药学上可接受的盐的有效剂量为不少于150μm，优选地为150-300μm。
17.现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.(1)本发明提供的羟基脲能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞中suz12的表达，降低h3k27三甲基化的修饰水平，并且可显著抑制视网膜母细胞瘤细胞生长，且药物作用效果随着浓度升高而增加。本发明旨在为视网膜母细胞瘤提供新的临床治疗药物，提高治疗有效性，延长患者生命，提高生存质量，从而开拓了羟基脲用于视网膜母细胞瘤治疗的一个新领域。
19.(2)本发明提供的羟基脲能够通过特异性靶向rb细胞中的ecdna，达到有效治疗rb的作用，其有效性强、特异性高。
附图说明
20.图1为本发明实施例中羟基脲抑制视网膜母细胞瘤细胞中suz12的表达，降低h3k27me3的修饰水平结果图。
21.图2为本发明实施例中羟基脲显著抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖能力的cck8结果图。a为视网膜母细胞瘤y79细胞系在用150μm羟基脲处理后，肿瘤细胞的增殖能力显著降低；b为视网膜母细胞瘤weri-rb-1细胞系在用150μm羟基脲处理后，肿瘤细胞的增殖能力显著降低，*p《0.01。
22.图3为本发明实施例中羟基脲显著抑制视网膜母细胞瘤细胞成瘤能力的软琼脂克隆形成实验结果图。a视网膜母细胞瘤细胞系在用150μm羟基脲处理后，肿瘤细胞的成瘤能力显著降低；b为为形成克隆团相对数量的统计，***p《0.001。
具体实施方式
23.本发明提供了如下化学式(i)所示的羟基脲(hydroxyurea)在制备用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物中的应用，其能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞中suz12的表达，降低h3k27三甲基化的修饰水平，并且能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞的增殖和成瘤能力。
[0024][0025]
本发明还提供一种靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna的生物标记物，所述生物标记物为如上化学式(i)所示的羟基脲或其药学上可接受的盐。
[0026]
本发明提供的羟基脲或其药学上可接受的盐能够靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna。
[0027]
本发明还提供一种用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物组合物，所述药物组合物包括如上所述的靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna的生物标记物。
[0028]
优选地，所述药物组合物还包括医学上可接受的辅料或载体。
[0029]
优选地，所述药物组合物的剂型选自片剂、粉剂、注射剂、胶囊、混悬剂、糊剂、凝胶、涂布剂、药膜剂、缓释剂或微球。
[0030]
给药以及药物组合物
[0031]
一般来说，本发明的药物组合物可以在有效量下，通过任何可接受的用于其他类似用途的给药方式进行给药。举例来说，本发明的药物组合物可以口服、非肠道给药、透皮给药、局部给药、直肠给药或鼻内给药。在本发明中，本发明的药物组合物的有效剂量为不少于150μm，优选地为150-300μm。
[0032]
当用作药物时，本发明通常以药物组合物的形式给药。这些组合物可用制药学领域熟知的方法进行制备，这些组合物包含至少一种活性化合物，在本发明中，该活性化合物为如上化学式(i)所示的羟基脲或其药学上可接受的盐。在配制本发明提供的组合物时，有效成分通常与医学上可接受的辅料或载体混合，被医学上可接受的辅料或载体稀释或被以胶囊，小袋，纸或其他形式的容器包裹。当所述医学上可接受的辅料或载体作为稀释剂时，可以是固体，半固体，或液体物质，可作为有效成分的运载体、载体或媒介。由此，所述组合物可以是药片、药丸、粉末、锭剂、小袋、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液、糖浆、喷雾(作为固体或在液体介质里)，软膏，软和硬的明胶胶囊，栓剂，无菌注射溶液，和无菌包装粉末的形式。
[0033]
一些典型的医学上可接受的辅料或载体包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。另外还可以包括润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油)、浸润剂、乳化和悬浊剂、防腐剂(如对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯)、甜味剂和增味剂。本发明的药物组合物可以通过具体赋形方式在对病人进行给药之后达到药物活性成分的快速、持续或延时释放，这也是本领域中广泛应用的方法。
[0034]
活性成分，即本发明中的如上化学式(i)所示的羟基脲或其药学上可接受的盐，在药物构成和单位剂型中的数量可根据具体应用情况、特定化合物的活性和预期浓度进行改变或有较大调整。
[0035]“治疗”意味着对哺乳动物体内疾病的任何治疗，包括：(1)防止疾病，即造成临床疾病的症状不发展；(2)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；(3)减轻疾病，即造成临床症状的消退。
[0036]
以下结合具体实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0037]
实施例1：蛋白质免疫印迹实验(western blot)
[0038]
实验步骤：
[0039]
(1)t25培养瓶中的rb细胞长至约70％～80％密度时，将细胞悬液转移至15ml离心管中，转速1000rpm，离心5分钟后小心地弃去上清，随后加入预冷的pbs洗涤细胞沉淀。在彻底洗去残余培养基后，根据细胞的多少加入对应的60～100μl的含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液ripa对其进行细胞蛋白裂解，静置冰上裂解30分钟。随后，将细胞裂解液转移到新的1.5ml ep管中，置于4℃离心机，10000rpm离心40分钟，取上清。利用bradford蛋白测定试剂盒对蛋白浓度进行检测定量。参考测得的蛋白浓度，加入适量的5
×
sds loading buffer，调整蛋白样品的体积。充分混匀后，利用95℃金属浴加热5分钟。所得蛋白样品可直接用于接下来的蛋白质免疫印迹实验。
[0040]
(2)将配置好的凝胶固定于电泳装置上，加紧玻璃板与塑料夹，加入900ml的tris-甘氨酸电泳缓冲液。利用移液枪在孔道中加入5-20ul的蛋白maker和蛋白样品，先在80v的电压下电泳30分钟，待蛋白样品进入分离胶后，将电压调整为120v，继续进行电泳直到溴酚蓝到达分离胶底部后可结束电泳。
[0041]
(3)电泳结束后，关闭蛋白电泳仪，取出凝胶，切除掉凝胶中无样品的部分，根据剩余所需的凝胶大小裁切合适大小的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，pvdf)，并浸于100％甲醇中3-5分钟激活。利用tris-base、甘氨酸、甲醇、ddh2o配置转膜缓冲液，随后将转膜专用夹浸泡于转膜缓冲液中，自阳极至阴极依次放置海绵、滤纸、pvdf膜、电泳后的凝胶、滤纸、海绵，安装转膜夹子并放置进转膜装置中。加入1000ml的转膜缓冲液，将转膜装置放入冰中，在200ma的电流下进行转膜。
[0042]
(4)待转膜结束后，利用5％ bsa封闭液室温摇床封闭pvdf膜1小时，封闭结束后，使用tbst溶液洗膜3次，每次5分钟。根据抗体说明书配制用于western blot的一抗溶液，并将pvdf膜浸入其中，放置在4℃摇床上孵育过夜。取出pvdf膜，使用tbst溶液洗膜3次，每次5分钟。随后将pvdf膜浸没于抗体稀释液配制的二抗溶液(稀释浓度一般为1:5000-1:10000)中，在室温避光的环境中放置于摇床孵育2小时。使用tbst溶液洗膜3次，每次5分钟。最后，将pvdf膜平铺于odyssey扫描成像系统中进行扫描，后续通过image j软件分析条带的灰度值。
[0043]
实验结果：如图1所示，羟基脲能够抑制rb细胞中suz12的表达，降低h3k27me3的修饰水平。
[0044]
实施例2：cck8细胞增殖实验
[0045]
实验材料：人源视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1、y79。羟基脲购自selleck(中国)，cck8购自同仁化学(日本)。
[0046]
实验步骤：
[0047]
(1)将weri-rb-1、y79细胞在37℃，5％co2培养箱中常规培养，用20％fbs的1640培液培养。
[0048]
(2)利用细胞计数板对细胞进行计数，在96孔板汇总接种每孔3000个细胞，每孔中加入100μl的完全培养基。设置药物组和对照组，药物组每孔加入羟基脲，使药物浓度为150μm，对照组加入等量pbs。(3)接种细胞铺板后放置在培养箱中孵育培养约6小时，待细胞生长稳定后，向每个孔中加入10μl cck8溶液，在培养箱中孵育4小时后，使用酶标仪测定样品在450nm处的吸光度。每隔24h进行一次检测，根据0天，1天，2天，3天，4天检测结果来绘制细胞的生长曲线。
[0049]
实验结果：如图2所示，可见羟基脲能够显著抑制视网膜母细胞瘤的增殖能力。
[0050]
实施例3：软琼脂克隆形成实验(soft agar assay)
[0051]
实验材料：人源视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1、y79。低熔点琼脂糖购自beyotime(中国)，羟基脲购自selleck(中国)，cck8购自同仁化学(日本)。
[0052]
实验步骤：
[0053]
(1)首先使用粉末培养基配制20％ fbs的2
×
1640培养液，将2
×
1640培养液和1.2％的低熔点琼脂糖按照1：1的体积均匀混合，注意需待琼脂糖冷却到70℃以下，以免破坏其中的蛋白成分。
[0054]
(2)利用巴氏滴管取约1ml的混合液轻柔地铺于6孔板内，注意混合液内不要出现气泡，室温下等待其凝固。随后将6孔板放置在37℃培养箱中培养过夜，观察6孔板的孔内是否出现污染。若未见污染，将细胞计数，并重悬于2
×
1640培养液内，按照最终密度为20000个/ml重悬，设置药物组和对照组，药物组每孔加入羟基脲，使药物浓度为150μm，对照组加入等量pbs。随后再次预热低熔点琼脂糖，加入pbs溶液将其配置为0.5％的低熔点琼脂糖溶液，随后把细胞悬浊液和0.5％的低熔点琼脂糖溶液按照1：1的体积均匀混合，利用巴氏滴管吸取1ml的混合液，均匀地将其铺于6孔板的上层，室温下等待其凝固。待其凝固后，向其中加入少量的pbs溶液，保证pbs能恰好覆盖住琼脂为宜，以防琼脂胶干燥皲裂。
[0055]
(3)培养3-4周，直至出现肉眼可见明显的细胞克隆团块时，加入甲醇进行固定，固定后使用结晶紫染色2h，吸净结晶紫，加入ddh2o或者利用pbs清洗培养基中的背景颜色，并进行拍照观察。
[0056]
实验结果：如图3所示，羟基脲能够显著抑制视网膜母细胞瘤的成瘤能力。
[0057]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna的生物标记物，其特征在于，所述生物标记物为如下化学式(i)所示的羟基脲(hydroxyurea)或其药学上可接受的盐：2.一种用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1所述的靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna的生物标记物。3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna的生物标记物为羟基脲或其药学上可接受的盐。4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括医学上可接受的辅料或载体。5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型选自片剂、粉剂、注射剂、胶囊、混悬剂、糊剂、凝胶、涂布剂、药膜剂、缓释剂或微球。6.羟基脲或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物中的应用，所述羟基脲或其药学上可接受的盐能够靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecdna。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述视网膜母细胞瘤肿瘤细胞为人视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羟基脲或其药学上可接受的盐能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞中suz12的表达，降低h3k27三甲基化的修饰水平。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羟基脲或其药学上可接受的盐能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系weri-rb1或y79细胞的增殖和成瘤能力。10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羟基脲或其药学上可接受的盐的有效剂量为不少于150μm，优选地为150-300μm。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及羟基脲在制备用于预防或治疗视网膜母细胞瘤的药物中的应用，能够通过特异性靶向视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中的ecDNA，达到有效治疗RB的作用，其有效性强、特异性高。本发明提供的羟基脲能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系WERI-RB1或Y79细胞中SUZ12的表达，降低H3K27三甲基化的修饰水平，并且能够抑制视网膜母细胞瘤细胞系WERI-RB1或Y79细胞的增殖和成瘤能力。RB1或Y79细胞的增殖和成瘤能力。RB1或Y79细胞的增殖和成瘤能力。


技术研发人员：杨鹿笛 贾仁兵 范先群
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院附属第九人民医院
技术研发日：2023.07.07
技术公布日：2023/10/15