一种流感病毒疫苗佐剂、疫苗颗粒及其用途

1.本发明涉及医药工程的药物制剂领域，尤其涉及一种聚乳酸类可降解聚合物-阳离子脂质材料复合纳米颗粒疫苗佐剂及其制备方法，及使用所述佐剂制备的纳米疫苗及其在抗流感病毒感染中的用途。本发明尤其涉及由流感病毒蛋白制成的抗原与纳米疫苗佐剂组合成的纳米疫苗及其在制备治疗或预防流感病毒的药物中的应用。


背景技术：

2.流感是一种急性呼吸道传染病，由流感病毒感染而引起的，它具有一定的周期性和反复性，其在全球引起的发病率和死亡率是非常高的。流感病毒根据病原的不同可分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型。流感的传染性极强、传播速度极快，其中以甲型最为多见。因为甲型流感病毒亚型较多，容易发生变异，抗原变异，传染性也比较大，传播速度又较快，极易发生大范围流行而且易感人群比较广泛，因此对人类的健康构成了不可忽视的危害，是最常见的流行病之一。
3.目前，应用较为广泛的新型疫苗有基因重组疫苗、亚单位疫苗、多肽疫苗等。新型疫苗具有的纯度较高，相对分子量较小，且拥有良好的抗原特异性，毒性低，但是其能引起免疫应答的性能较弱，因此需要添加佐剂增强抗原特异性免疫反应，提高疫苗的保护效力。
4.佐剂是一种加入到疫苗制剂中能够促使疫苗制剂增强机体产生的特异性免疫反应的物质。自从法国兽医免疫学家ranmon发现了疫苗中某些物质的佐剂作用以来，佐剂被用来增强疫苗制剂的免疫反应已有近90年的历史了，目前，已研制了众多新型的疫苗佐剂，如铝佐剂、油乳佐剂、纳米颗粒等。但是，铝佐剂虽然具有便宜、合成简单等理想佐剂的优点，但也存在不足之处：(1)注射后局部炎症的反应强烈，会出现红斑、肿胀和硬结等副作用；(2)较难对铝佐剂的质量和免疫效果进行准确的评价；(3)不能激发更高效的细胞免疫反应；(4)铝佐剂易在体内蓄积，若蓄积在脑部时，长期蓄积会对身体造成伤害。油乳佐剂作为免疫佐剂的一种，能够增强疫苗的活性，促使抗原表达高水平的抗体，从而减少抗原接种的剂量和次数，它的主要佐剂成分是油。油乳佐剂的作用机理尚不完全明确。纳米颗粒作为佐剂可携载或吸附大量抗原并保护其免受机体所产生的酶降解，可调控抗原持续释放，在较长时间内持续为机体提供抗原刺激。纳米颗粒佐剂，包括可降解聚合物聚乳酸-聚羟基乙酸(plga)、聚乳酸(pla)、聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(pela)等是目前生物医药研究中的重要材料，具有良好的生物安全性和生物相容性，并且已被fda批准用于药物递送和药物制剂组分；和铝盐佐剂疫苗相比，基于聚乳酸类材料的纳米制剂在疫苗递送研究中尤为瞩目，采用聚乳酸制备的纳米颗粒佐剂在促进抗原交叉提呈、增强th1细胞免疫应答方面具有独特的优势，同时颗粒佐剂也能够显著提升疫苗的体液免疫应答。
5.疫苗所引起的免疫应答首先需要免疫细胞的活化，即b细胞和t细胞的活化。这两类细胞的活化从根本上来说都需要抗原提呈细胞(apc)发挥功能。而dc是主要的抗原提呈细胞之一，因此，针对dc设计载抗原阳离子聚乳酸纳米疫苗，以期能够大大增强dc的活化水平，进而增强体内免疫应答。本发明所述的纳米佐剂作用于递送抗原至树突细胞(dc)，进而
激活t细胞和b细胞等体内细胞免疫和体液免疫。与此同时，进行了载抗原阳离子聚乳酸纳米疫苗体内治疗及预防同型和异型流感病毒的疗效研究，考察其对同型和异型流感病毒小鼠的体重恢复和生存期的延长效果。本发明的纳米疫苗对同型和异型流感病毒有非常好的治疗和预防效果，有望成为一种优良的抗流感病毒的通用疫苗。


技术实现要素：

6.本发明针对流感病毒抗原的理化特性设计了一种阳离子聚乳酸纳米佐剂，采用纳米沉淀法制备了均一可控、粒径小、分散性好的可吸附流感病毒抗原的阳离子聚乳酸纳米佐剂，制备方法简单、温和，提高其临床可用性，实现了载抗原阳离子聚乳酸纳米疫苗对抗原提呈细胞的活化作用和对同型和异型流感病毒的有效治疗与预防。
7.本发明采用以下技术方案：
8.第一方面，本发明提供了一种聚合物类纳米颗粒佐剂，其特征在于所述佐剂由聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料组成，所述佐剂带正电，zeta电位范围是+25mv到+50mv，粒径为70-200nm，分散性pdi值为0.1-0.3，能够吸附呈负电位的抗原蛋白。
9.在一些实施方案中，所述聚乳酸类可降解聚合物选自聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物。
10.在一些实施方案中，所述阳离子脂质材料选自双十八烷基溴化铵(ddab)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(dotap)、dc-胆固醇(dc-chol)。
11.本发明中所述聚合物类纳米颗粒佐剂优选电位为+25mv到+50mv，例如可以是+25mv，+30mv，+35mv，+40mv，+45mv或+50mv。
12.本发明中所述聚合物类纳米颗粒佐剂优选粒径大小为70-200nm，例如可以是70nm、80nm、90nm、100nm、110nm，120nm，130nm，140nm，150nm，160nm，170nm，180nm，190nm或200nm。
13.尺寸小于200nm的颗粒能够模拟病原体的尺寸，易于被抗原呈递细胞如dc等摄取转运至次级淋巴器官，也可以通过引流淋巴结主动转运至次级淋巴器官，可以诱导快速、持久的免疫反应；另外，尺寸小于200nm的颗粒也易于发生溶酶体逃逸，促进交叉提呈。
14.本发明中所述聚合物类纳米颗粒佐剂粒径分散系数范围为0.1-0.3，例如可以是0.1、0.15、0.2、0.25、0.3，优选为小于0.1。
15.第二方面，本发明提供聚合物类纳米颗粒佐剂的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
16.(1)将所述聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料溶解于有机溶剂作为油相，取超纯水作为水相，优选地所述阳离子脂质材料选自双十八烷基溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、dc-胆固醇；
17.(2)将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，挥发有机溶剂，离心，收集纳米颗粒；
18.(3)加入超纯水超声分散步骤(2)获得的纳米颗粒，反复洗涤；
19.(4)用超纯水悬浮步骤(3)获得的纳米颗粒，分级离心去除粒径过大的纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的纳米颗粒混悬液，即获得了所述佐剂。
20.第三方面，本发明提供了一种疫苗组合颗粒，包括如上所述的佐剂和特异性抗原，其特征在于所述佐剂与所述特异性抗原通过静电吸附结合，所述抗原为流感相关抗原核蛋
白(np)、基质蛋白(m)或融合蛋白(nm2e)。
21.在一些实施方案中，所述疫苗组合颗粒粒径为150-300nm，分散性pdi值为0.1-0.2，其zeta电位范围是+30mv到+40mv。
22.疫苗组合颗粒粒径为150-300nm可以更好地模拟病原体，使其更易于被免疫细胞识别、吞噬，并诱导后续免疫活化，同时粒径小也有利于被吞噬后的颗粒也易于发生溶酶体逃逸，促进交叉呈递；pdi值为0.1-0.2时，颗粒的单分散性比较好，有利于后续细胞摄取与促进免疫；zeta电位为+30mv到+40mv时，一方面颗粒表面电势大于30mv时，颗粒间存在足够斥力，使其颗粒疫苗具有良好的分散性；另一方面，颗粒表面电势大于30mv时，能够通过静电相互作用与细胞膜结合，易于被细胞内化，内化后的颗粒则因为足够的正电荷，能够从溶酶体逃逸，促进交叉提呈；如果颗粒表面zeta电位高于40mv时，将会对细胞产生一定的毒性。
23.本发明所述疫苗组合颗粒优选抗原为带负电荷的流感抗原，包括核蛋白(np)、基质蛋白(m)或融合蛋白(nm2e)，抗原用量为100-400μg/ml，抗原吸附率为85％以上。
24.本发明中所述疫苗组合颗粒优选粒径大小为150-300nm，例如可以是150nm、160nm、170nm、180nm、190nm，200nm，210nm，220nm，230nm，240nm，250nm，260nm，270nm，280nm，290nm或300nm。
25.本发明中所述疫苗组合颗粒粒径分散系数范围为0.1-0.2，例如可以是0.1、0.12、0.14、0.16、0.18，0.2，优选为小于0.1。
26.本发明中所述疫苗组合颗粒优选电位为+30mv到+40mv，例如可以是+30mv，+32mv，+34mv，+36mv，+38mv或+40mv。
27.第四方面，本发明还提供了一种如本发明第三方面所述的疫苗组合颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
28.(1)将不同比例的聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料溶解于有机溶剂作为油相，取超纯水作为水相；
29.(2)将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，挥发有机溶剂，离心，收集纳米颗粒；
30.(3)收集到的纳米颗粒重悬于超纯水或pbs缓冲液中，加入抗原后，室温下垂直混合，获得吸附抗原的疫苗组合颗粒。
31.在一些实施方案中，所述聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料的重量比为10:1至10:5。
32.在本发明中，所述有机溶剂为能够对聚合物和阳离子脂质材料具有很好的溶解能力且能够与水相具有良好的互溶性的有机溶剂。
33.在一些实施方案中，所述有机溶剂选自乙醇、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。
34.在一些实施方案中，所述pbs缓冲液的ph为8.2-9.3。
35.第五方面，本发明提供了如第一方面所述的佐剂在疫苗的制备中的用途。
36.第六发明，本发明提供了治疗流感病毒感染的方法，其包括向受试者施用如第三方面所述的疫苗组合颗粒。
37.本发明所述的粒径均一、分散性好的疫苗组合颗粒的制备方法。具体步骤如下：
38.准确称取100mg的聚乳酸类材料与30mg的阳离子脂质材料于50ml离心管中，先加入7.5ml的丙酮进行溶解，再加入7.5ml的乙醇(或加入15ml的dmf中)，超声使其完全溶解，
作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的阳离子脂质材料/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径为较小且粒径均一的阳离子脂质材料/聚乳酸纳米颗粒混悬液。测定制备所得的纳米颗粒悬液的浓度，加入离心管，超声使所制备的纳米颗粒充分分散后，向其中加入一定体积的抗原原液，使缓冲液中抗原终浓度达到所需免疫剂量浓度，抗原浓度为200μg/ml，纳米球终浓度为5mg/ml，室温下垂直混合过夜获得疫苗组合颗粒。
39.本发明的步骤(1)中，所述聚乳酸类材料包括但不限于聚乳酸(pla)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(plga)、聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(pela)等，优选为聚乳酸(pla)；优选地，所述聚乳酸类材料的浓度为10％-20％。
40.所述聚乳酸类材料的分子量优选为10000-100000。
41.本发明步骤(1)中所述阳离子脂质材料选自双十八烷基溴化铵(ddab)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(dotap)、dc-胆固醇(dc-chol)。
42.本发明的步骤(1)中，所述有机溶剂为乙醇、丙酮的组合物或其他有机溶剂或其组合物。
43.本发明的步骤(2)中，所述油相和水相的体积比为1:5-1:30，例如可以是1:5、1:6、1:8、1:10、1:20、1：30等；
44.本发明的步骤(2)中，所述搅拌时间为8-14h，例如可以是8h、10h、12h、14h；
45.本发明的步骤(2)中，所述固化方式为溶剂挥发法或溶剂扩散法。
46.本发明的步骤(3)中，所述抗原为模式抗原ova、流感抗原核蛋白(np)、基质蛋白(m)或融合蛋白(nm2e)。
47.本发明的步骤(3)中，所述抗原吸附方式为静电吸附。
48.本发明通过调整聚乳酸类材料与阳离子脂质材料的比例，采用纳米沉淀法，构建带正电的聚乳酸类纳米脂质体颗粒，与流感抗原共混悬后，获得疫苗组合颗粒；与抗原提呈细胞dc共孵育后，与对照组相比显著提高其表面分子cd40、cd86、mhc类分子的表达，同时促进了流感抗原的交叉提呈。同时，该疫苗组合颗粒体内诱导了dc成熟与活化，激活了细胞和体液免疫反应，保护小鼠免受同型和异型流感病毒的侵害；并有效延长同型和异型流感小鼠的生存期，快速恢复流感小鼠的体重。该疫苗交叉保护效力超过90％，这种纳米疫苗可用于开发通用流感疫苗。
49.定义
50.抗原交叉提呈能力：mhc分子对抗原的提呈存在交叉提呈现象，即mhc i类分子也能提呈外源性抗原，而内源性抗原也能通过mhc ii类途径加以提呈。
51.抗原nm2e：基于高度保守的内部抗原核蛋白(np)与m2蛋白胞外功能区m2e的融合蛋白，可作为广谱流感抗原。
52.同型流感病毒pr8：h1n1流感病毒pr8株。选择该病毒株用于证明所构建纳米颗粒疫苗免疫保护的特异性。
53.异型流感病毒x31：h3n2流感病毒x31株。选择该病毒株用于证明所构建纳米颗粒疫苗的交叉免疫保护性能。
54.树突细胞：树突细胞dc是机体适应性t细胞免疫应答的始动者，是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，是唯一能够显著刺激初始t细胞增殖的抗原提呈细胞。
55.pdi：多分散系数，代表粒子均匀分散的程度，即粒度分布系数。该数值越小，溶液中的粒子分布越均匀。相反，该数值越大，溶液中的粒子分布越宽泛。一般认为pdi小于0.2的乳液具有单分散性。
56.纳米球的电位：是指剪切面的电位，又叫电动电位或电动电势，即zeta电位是连续相与附着在分散粒子上的流体稳定层之间的电势差，是表征胶体分散体系稳定性的重要指标。zeta电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力的强度的度量。分子或分散粒子越小，zeta电位的绝对值(正或负)越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，zeta电位(正或负)越低，越倾向于凝结或凝聚，即吸引力超过了排斥力，分散被破坏而发生凝结或凝聚。本发明的zeta电位范围是30-50mv，纳米颗粒在这个zeta电位范围内稳定性好。
57.疫苗组合颗粒：本发明组合颗粒尺寸在200nm以下，颗粒表面荷正电，能够通过静电相互作用携载抗原，颗粒疫苗能够被dc细胞大量摄取，并发生溶酶体逃逸，诱导特异性免疫和交叉呈递。携载流感抗原后，不仅对同型病毒株产生特异性保护，而且对异型株产生交叉保护能力。
58.纳米沉淀法：其原理是聚合物油相与水相具有良好的互溶性，在油相溶液滴加进入水相后，油相溶剂扩散进入水相中，使聚合物和阳离子脂质材料沉淀出来，得到纳米颗粒。
附图说明
59.图1是本发明所制备的疫苗佐剂颗粒和疫苗组合颗粒的形貌扫描电镜图、粒径分布图和电位统计图，a为粒径分布图，b为电位统计图，c为扫描电镜图。
60.图2是纯抗原组、疫苗佐剂组和疫苗组合颗粒体外诱导dc成熟与活化的效果比较图，dc细胞共刺激分子cd40、cd86和表面标志分子mhc i的表达水平的统计图。
61.图3是抗原的交叉提呈水平统计图。
62.图4是纯抗原组、疫苗佐剂组和疫苗组合颗粒体内诱导dc成熟与活化的效果比较图，dc细胞共刺激分子cd40、cd86和表面标志分子mhci、mhcii的表达水平的统计图。
63.图5是纯抗原组、疫苗佐剂组和疫苗组合颗粒体内诱导cd4、cd8 t和b细胞活化水平统计图。
64.图6是纯抗原组、疫苗佐剂组和疫苗组合颗粒体内诱导抗原特异性抗体水平统计图。
65.图7是纯抗原组、疫苗佐剂组和疫苗组合颗粒体内保护同型和异型流感小鼠效力结果比较(体重和生存率)结果。
具体实施方式
66.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
67.实施例1聚乳酸类疫苗佐剂的制备
68.准确称取100mg的聚乳酸(pla)与10mg的ddab(双十八烷基二甲基溴化铵)于50ml
离心管中，先加入7.5ml的丙酮进行溶解，再加入7.5ml的乙醇，超声使其完全溶解，作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的ddab/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的ddab/聚乳酸纳米颗粒混悬液。当ddab的用量为10mg时，纳米颗粒粒径约为150nm，纳米球的电位为40
±
1.20mv。
69.实施例2聚乳酸类疫苗佐剂的制备
70.准确称取100mg的聚乳酸(pla)与20mg的ddab于50ml离心管中，先加入7.5ml的丙酮进行溶解，再加入7.5ml的乙醇，超声使其完全溶解，作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的ddab/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径为较小且粒径均一的ddab/聚乳酸纳米颗粒混悬液。当ddab的用量为20mg时，纳米颗粒粒径约为150nm，纳米球的电位为42
±
0.40mv。
71.实施例3聚乳酸类疫苗佐剂的制备
72.准确称取100mg的聚乳酸(pla)与30mg的ddab于50ml离心管中，先加入7.5ml的丙酮进行溶解，再加入7.5ml的乙醇，超声使其完全溶解，作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的ddab/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的ddab/聚乳酸纳米颗粒混悬液。当ddab的用量为30mg时，纳米颗粒粒径约为150nm，电位约为+50mv(图1)。
73.实施例4聚乳酸类疫苗佐剂的制备
74.准确称取100mg的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(plga)与10mg的ddab于50ml离心管中，先加入7.5ml的丙酮进行溶解，再加入7.5ml的乙醇，超声使其完全溶解，作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的ddab/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的ddab/聚乳酸-聚羟基乙酸纳米颗粒混悬液。当ddab的用量为10mg时，纳米颗粒的电位为39
±
1.10mv。
75.实施例5聚乳酸类疫苗佐剂的制备
76.准确称取100mg的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(pela)与10mg的ddab于50ml离心管中，先加入7.5ml的丙酮进行溶解，再加入7.5ml的乙醇，超声使其完全溶解，作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的ddab/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的ddab/聚乙二醇共聚物纳米颗粒混悬液。当ddab的用量为10mg时，纳米颗粒的电位为41
±
0.90mv。
77.实施例6聚乳酸类疫苗佐剂的制备
78.准确称取100mg的聚乳酸聚合物(pla)与10mg的dotap于50ml离心管中，先加入7.5ml的丙酮进行溶解，再加入7.5ml的乙醇，超声使其完全溶解，作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的dotap/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的dotap/聚乳酸纳米颗粒混悬液。当dotap的用量为10mg时，纳米颗粒的电位为40
±
1.50mv。
79.实施例7聚乳酸类疫苗佐剂的制备
80.准确称取100mg的聚乳酸聚合物(pla)与10mg的dc-chol于50ml离心管中，先加入7.5ml的丙酮进行溶解，再加入7.5ml的乙醇，超声使其完全溶解，作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的dc-chol/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的dc-chol/聚乳酸纳米颗粒混悬液。当dc-chol的用量为10mg时，纳米颗粒的电位为42
±
1.30mv。
81.实施例8聚乳酸类疫苗佐剂的制备
82.准确称取100mg的聚乳酸(pla)与10mg的ddab(双十八烷基二甲基溴化铵)于50ml离心管中，加入15ml的dmf进行溶解，超声使其完全溶解，作为油相，量取90ml去离子水置于250ml烧杯中，作为水相；在550r/min的磁力搅拌下，将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，充分挥发有机溶剂；在20000g离心力下离心15min，收集纳米颗粒，加入超纯水超声分散，反复洗涤3-5次；用少量超纯水悬浮纳米颗粒，分级离心(5000
×
g，10min)去除粒径过大的ddab/聚乳酸纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的ddab/聚乳酸纳米颗粒混悬液。当ddab的用量为10mg时，纳米颗粒粒径约为145nm，纳米球的电位为41
±
1.20mv。
83.实施例9吸附抗原后的疫苗组合颗粒制备
84.测定制备所得的聚乳酸类纳米疫苗佐剂颗粒悬液(实施例3制备)的浓度，加入离心管，超声使所制备的纳米颗粒充分分散后，将纳米颗粒浓度调整成10mg/ml，向其中加入等体积的抗原原液(400μg/ml的nm2e抗原的pbs缓冲溶液)(由中国疾病预防控制中心病毒研究所提供，baoying,h.,xiuping,w.,wenjie,tan.,wenling,w.2015.efficient expression and purification of nucleoprotein and m2e fusion protein of influenza a virus in escherichia coli.chinese journal of experimental and clinical virology.29(3),270-272)，混合吸附后疫苗体系的抗原终浓度为200μg/ml，纳米颗粒佐剂终浓度为5mg/ml，室温下置于垂直混合仪上垂直混合过夜，获得疫苗组合颗粒。所得疫苗组合颗粒形貌呈球形，粒径小且均一，电位约+30mv；反应溶液ph值为7.4时，抗原吸附率采用减量法测定，即采用microbca法测超滤后滤液中的抗原浓度，进而计算纳米颗粒对抗原的吸附率为65％。
85.实施例10吸附抗原后的疫苗组合颗粒制备
86.测定制备所得的聚乳酸类纳米疫苗佐剂颗粒悬液(实施例3制备)的浓度，加入离心管，超声使所制备的纳米颗粒充分分散后，将纳米颗粒浓度调整成10mg/ml，向其中加入
等体积的抗原原液(400μg/ml的nm2e抗原的pbs缓冲溶液)，抗原终浓度为200μg/ml，纳米颗粒佐剂终浓度为5mg/ml室温下置于垂直混合仪上垂直混合过夜，获得疫苗组合颗粒。所得疫苗组合颗粒形貌呈球形，粒径小且均一，电位约+30mv(图1)；吸附携载抗原的反应缓冲体系ph值为8.2-9.3时，抗原吸附率大于85％。
87.实施例11疫苗组合颗粒体外诱导dc活化实验
88.将实施例9制备的疫苗组合颗粒用于体外诱导dc成熟与活化的研究。称取2mg/ml疫苗组合颗粒悬浮于rpmi 1640完全培养基中，与提取的小鼠厡代抗原提呈细胞(bmdc)共孵育，以纯抗原nm2e和pla疫苗佐剂颗粒(实施例3制备的)为对照，37℃培养箱中培养16h，采用流式细胞术测定dc表面相关分子的表达。如图2所示，结果显示，与纯抗原nm2e和pla疫苗佐剂颗粒相比，疫苗组合颗粒能够诱导dc细胞更高水平的cd40、cd86、mhc类分子的表达(图2)。纯抗原组、pla疫苗佐剂组和疫苗组合颗粒组的cd40的表达水平分别为72.8％，68.7％，88.1％，疫苗组合颗粒组比纯抗原高21.01％，比pla疫苗佐剂组高28.24％；mhc-ii的表达水平分别为19.5％，15.8％，31.2％，疫苗组合颗粒组比纯抗原高60.00％，比pla疫苗佐剂组高97.47％；cd86的表达水平分别为68.8％，59.8％，85.1％，疫苗组合颗粒组比纯抗原高23.69％，比pla疫苗佐剂组高42.31％。
89.实施例12疫苗组合颗粒促进抗原的交叉提呈水平的实验
90.将实施例9制备的疫苗组合颗粒，抗原换成ova(sigma)，用于抗原交叉提呈水平的研究。向96孔培养板中加入100μl的浓度为2
×
105细胞/孔的髓源dc细胞。将抗原ova和携载ova的颗粒用rpmi 1640完全培养基溶解或悬浮后，向上述bmdcs细胞(髓源dc细胞)中加入计算量的刺激物(每个组的刺激物分别为纯抗原、纳米颗粒、携载抗原的纳米疫苗；计算量是每个孔加入刺激物的量，一般按照抗原量计算，纳米颗粒组按纳米颗粒计算，要与纳米疫苗组的纳米颗粒用量一致)，以不含抗原的颗粒作为阴性对照。b3z细胞(可表达β-半乳糖苷酶的cd8
+
t细胞杂交瘤细胞系，该细胞是由中国科学院微生物研究所高斌研究员和马娟慷慨赠予，karttunen,j.,sanderson,s.,and shastri,n.1992.detection of rare antigen presenting cells by the lacz t-cell activation assay suggests an expression cloning strategy for t-cell antigens.proc.natl acad.sd.usa 89:6020)用rpmi-1640培养基(完全培养基)复苏培养后，传代2至3代，细胞状态良好，向上述含bmdcs和刺激物的96孔板中加入1.0
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105细胞/孔的b3z细胞，每孔加入100μl。将含有bmdcs、b3z细胞和含抗原刺激物的孔板置于细胞培养箱培养20h。将培养板离心弃去上清，加入100μl/孔的lacz缓冲液(sigma-aldrich)(0.01mol/l的pbs缓冲液，其中含有0.125％nonidet p-40、9mm的mgcl2和0.15mm的氯酚红-β-d-半乳糖苷，简称cprg)，在无菌培养箱中共孵育4h使其显色，用酶标仪检测570nm吸收波长下的吸光度值和620nm吸收波长下的吸光度值，抗原的交叉提呈能力计算：将各组570nm下的吸光度值减去620nm下的吸光度值，即为抗原的交叉提呈能力。如图3所示，结果显示了与纯抗原和pla疫苗佐剂颗粒相比，疫苗组合颗粒能够诱导更高水平的抗原交叉提呈能力(图3)。
91.实施例13疫苗组合颗粒体内免疫后dc活化的实验
92.将实施例9制备的疫苗组合颗粒用于体内诱导dc成熟与活化的研究。小鼠(4-6周)(balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物中心)于第0天和第28天肌肉注射100μl(每只后腿50μl)的纯抗原nm2e、聚乳酸纳米疫苗佐剂(实施例3制备的)和疫苗组合颗粒(实施例8的
疫苗制剂)(每只小鼠10μg抗原)，在第一次注射后的6、12、24、48h和7、14、28天，分别分离腘窝淋巴结和腹股沟淋巴结。分离的淋巴结处理成单细胞悬液。用抗cd11c、cd86、cd40、mhc i、mhc ii小鼠抗体(thermofisher，货号分别为ma5-16877、47-0862-82、12-0401-82、a14902、116513)对细胞进行染色标记，流式细胞术检测cd11c、cd86、cd40、mhc i、mhc ii表达水平。如图4所示，结果显示了与纯抗原nm2e和pla疫苗佐剂颗粒相比，疫苗组合颗粒能够诱导体内dc细胞更高水平的cd40、cd86、mhc类分子的表达(图4)。
93.实施例14疫苗组合颗粒体内免疫后体内细胞免疫的激活
94.小鼠(balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物中心)(4-6周，n＝6/组)于第0天和第28天肌肉注射100μl(每只后腿50μl)的纯抗原nm2e、聚乳酸纳米疫苗佐剂(实施例3制备的)和疫苗组合颗粒(实施例9制备的)(每只小鼠10μg抗原)。第一次接种后第5周，对小鼠实施安乐死，收集脾细胞，用nm2e(10μg/孔)体外刺激。取脾脏单细胞(1
×
106个/孔)置于细胞培养箱中培养72h。pbs洗涤后，用抗cd4、cd8、cd19和cd69小鼠抗体(biolegend，货号分别为100401、104511、152407)染色。流式细胞术检测小鼠的活化淋巴细胞cd4
+
t(cd4
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cd69
+
)、抗原特异性cd8
+
t细胞(cd8
+
cd69
+
)和b细胞(cd19
+
cd69
+
)。如图5所示，结果显示了与纯抗原nm2e和pla疫苗佐剂颗粒相比，疫苗组合颗粒能够诱导体内cd4
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t(cd4
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cd69
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)、抗原特异性cd8
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t细胞(cd8
+
cd69
+
)和b细胞(cd19
+
cd69
+
)的活化水平(图5)。纯抗原组、pla疫苗佐剂组和疫苗组合颗粒组的cd4的活化分别为14.6％，8.2％，18.6％，疫苗组合颗粒组比纯抗原高27.40％，比pla疫苗佐剂组高126.83％；cd8的活化分别为11.2％，5.8％，19.8％，疫苗组合颗粒组比纯抗原高76.79％，比pla疫苗佐剂组高241.38％；cd19的活化分别为14.3％，6.3％，38.8％，疫苗组合颗粒组比纯抗原高171.33％，比pla疫苗佐剂组高515.87％。
95.实施例15疫苗组合颗粒体内免疫后体内体液免疫的激活(流感抗原特异性抗体水平的检测)
96.小鼠(balb/c小鼠，购自北京维通利华实验动物中心)(4-6周，n＝6/组)于第0天和第28天肌肉注射100μl(每只后腿50μl)的纯抗原nm2e、聚乳酸纳米疫苗佐剂(实施例3制备的)和疫苗组合颗粒(实施例9制备的)(每只小鼠10μg抗原)。第一次接种后第28天，从小鼠后静脉丛采血。将收集的小鼠眼眶血离心后从血液中收集血清，采用间接elisa法测定抗原的特异性抗体m2e-、np特异性igg、igg1、igg2c的效价。在测定过程中采用滴度的大小表征血清特异性抗体的浓度，滴度越大表示血清特异性抗体的浓度越高。结果如图6所示，与纯抗原组相比，疫苗组合颗粒诱导血清中m2e-或np特异性igg滴度呈时间依赖性，疫苗组合颗粒也上调了m2e-或np特异性igg1和igg2c，以及更高的igg2c/igg1比值(图6)，这与th1型细胞免疫的激活有关。综上所述，疫苗组合颗粒实现了对b细胞的有效激活，并大量产生m2e-或np特异性igg，建立了持久的抗体保护，这是抗流感病毒感染不可缺少的。
97.实施例16疫苗组合颗粒体内免疫后对流感病毒的攻毒效果
98.实施例9的疫苗组合颗粒第2针免疫后的14d，按照戊巴比妥钠60mg/kg体重，腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠出现深度麻醉状态后，通过滴鼻每只小鼠感染50μl 20ld50流感病毒pr8(由中国疾病预防控制中心病毒研究所提供)，20ld50流感病毒x31(由中国疾病预防控制中心病毒研究所提供)，随后每天观察小鼠体重变化和死亡情况连续观察2周，并记录小鼠体重变化和死亡情况。结果如图7所示，在同型流感病毒pr8和异型流感病毒x31攻毒实验中显示，疫苗组合颗粒有效的恢复了小鼠的体重，并延长了其生存期，保护效率达到90％以
上。
99.以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种聚合物类纳米颗粒佐剂，其特征在于所述佐剂由聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料组成，所述佐剂带正电荷，zeta电位范围是+25mv到+50mv，粒径为70-200nm，分散性pdi值为0.1-0.3，能够吸附呈负电位的抗原蛋白，优选地所述阳离子脂质材料选自双十八烷基溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、dc-胆固醇，所述佐剂通过以下步骤获得：(1)将所述聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料溶解于有机溶剂作为油相，取超纯水作为水相；(2)将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，挥发有机溶剂，离心，收集纳米颗粒；(3)加入超纯水超声分散步骤(2)获得的纳米颗粒，反复洗涤；(4)用超纯水悬浮步骤(3)获得的纳米颗粒，分级离心去除粒径过大的纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的纳米颗粒混悬液，即获得了所述佐剂。2.聚合物类纳米颗粒佐剂的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)将所述聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料溶解于有机溶剂作为油相，取超纯水作为水相，优选地所述阳离子脂质材料选自双十八烷基溴化铵、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐、dc-胆固醇；(2)将油相缓慢滴加到水相中，搅拌过夜，挥发有机溶剂，离心，收集纳米颗粒；(3)加入超纯水超声分散步骤(2)获得的纳米颗粒，反复洗涤；(4)用超纯水悬浮步骤(3)获得的纳米颗粒，分级离心去除粒径过大的纳米颗粒，得到粒径较小且粒径均一的纳米颗粒混悬液，即获得了所述佐剂。3.根据权利要求1所述的佐剂或权利要求2所述的方法，其特征在于所述聚乳酸类可降解聚合物选自聚乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物。4.根据权利要求1所述的佐剂或权利要求2所述的方法，其特征在于所述聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料的重量比为10:1至10:5，例如10:1、10:2、10:3、10:4或10:5，优选地，所述聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料的重量比为10:3。5.根据权利要求1所述的佐剂或权利要求2所述的方法，其特征在于所述有机溶剂选自与水有互溶性的溶剂，例如乙醇、丙酮、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。6.一种疫苗组合颗粒，其特征在于，所述疫苗组合颗粒包括根据权利要求1-5中任一项所述的佐剂和特异性抗原，所述佐剂与所述特异性抗原通过静电吸附结合，所述抗原为流感相关抗原核蛋白(np)、基质蛋白(m)或融合蛋白(nm2e)。7.根据权利要求6所述的疫苗组合颗粒，其特征在于，所述疫苗组合颗粒粒径为150-300nm，分散性pdi值为0.1-0.2，其zeta电位范围是+30mv到+40mv。8.疫苗组合颗粒的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：向权利要求1-5中任一项所述的佐剂中加入在pbs缓冲液中的抗原，室温下垂直混合，获得吸附抗原的疫苗组合颗粒，优选地所述抗原为流感相关抗原核蛋白(np)、基质蛋白(m)或融合蛋白(nm2e)。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pbs缓冲液的ph为8.2-9.3。10.根据权利要求1-5中任一项所述的佐剂在疫苗的制备中的用途。

技术总结
本发明提供了一种聚合物类纳米颗粒佐剂，所述佐剂由聚乳酸类可降解聚合物和阳离子脂质材料组成，所述佐剂带正电，zeta电位范围是+25mV到+50mV，粒径为70-200nm，分散性PDI值为0.1-0.3，能够吸附呈负电位的抗原蛋白。本发明还提供了由所述佐剂制备的疫苗组合颗粒。所述疫苗组合颗粒交叉保护效力超过90％，可用于开发通用流感疫苗。发通用流感疫苗。发通用流感疫苗。


技术研发人员：王连艳 高媛
受保护的技术使用者：中国科学院过程工程研究所
技术研发日：2023.07.05
技术公布日：2023/10/15