基于CRISPR/Cas9的胃癌相关LncRNAHOXA10的检测试纸条方法及其应用

基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体为基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法及其应用。


背景技术：

2.胃癌是世界范围内最恶性的肿瘤之一，是癌症相关死亡的第三大原因。在以往的研究中发现，许多长链非编码rnas(lncrnas)参与了癌症的发展。lncrna被认为是维持体内平衡所必需的，也是许多人类疾病的关键因素。lncrna的失调可能导致许多肿瘤的恶性进展，包括胃癌(gc)。lncrna是一类长度超过200个核苷酸的转录物，不编码蛋白质，在染色质组织、转录和转录后水平上通过调节基因表达发挥作用。有证据表明lncrna在许多肿瘤中经常被解除调控。如lncrna ac0938181.1通过上调pdk1的表达诱导胃癌转移。lnchoxa10是一个通过调控肿瘤抑制因子(rar-b)表达参与胃癌增殖和运动性的致癌基因。科研人员观察到lnchoxa10在胃癌组织和细胞系中的表达水平明显高于非肿瘤组织和细胞系。roc分析结果显示，lnchoxa10联合rar-b对胃癌的诊断具有重大价值。体外实验结果表明，lnchoxa10缺失可抑制胃癌细胞的生长和运动，诱导胃癌细胞凋亡。lnchoxa10过度表达则会显著促进细胞生长和运动，抑制细胞凋亡。这些结果表明lnchoxa10可能是胃肿瘤发生的致瘤因子。综合以上考虑，开发一套快捷、准确且方便检测临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10的方法对于胃癌的预防和早期治疗具有重要的意义。
3.由于rna极其不稳定易降解，因此直接检测rna难度较高，目前应用广泛的方法为rt-pcr即逆转录聚合酶链式反应，此方法将rna的逆转录和dna聚合酶链式扩增反应相结合，技术成熟，具有较高的灵敏度和特异性，但是作为传统检测方法，此法操作步骤多而且复杂，检测时间较长，对于仪器、场地、实验人员的要求较高，且存在一定假阳性和假阴性。难以应用到资源匮乏的地区。此外，等温扩增技术中如tma技术(转录介导的扩增技术)在等温条件下，即42℃左右将目标序列在逆转录酶作用下和引物引导下逆转录为rna-dna杂合链，然后水解杂合链上rna并合成双链dna，然后在rna多聚酶作用下dna转录为目标rna序列作为下一循环模板。这一技术检测方便，无需特殊仪器，灵敏度和特异性较高，并且检测时间短。但是对靶基因的纯度要求较高，因此易引起假阳和假阴性。其他等温扩增技术也都一定程度上存在较大缺点而难以应用到实际检测中。因此开发一套快速、灵敏、准确的rna检测方法来检测临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法及其应用，以解决背景技术中提出的问题。
5.为实现目的，本发明提供如下技术方案，基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，该方法包括有以下步骤：
6.s1：使用transzol试剂从临床样品中提取总rna；
7.s2：以提取的rna为模板，使用针对lnchoxa10特异性的引物对，采用一步法逆转录重组酶聚合酶扩增技术进行扩增，获得生物素功能化的双链产物；
8.s3：将适量金纳米探针、cas9蛋白、sgrna和双链产物在上样缓冲溶液中混合，并孵育一段时间，将复合物加入侧向流试纸条的检测区进行检测，根据检测线的显色结果实现待测临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10的定性或定量检测。
9.优选的，步骤s1中的transzol试剂包含4mol/l的异硫氰酸胍，ph 7.0，和4mol/l的柠檬酸钠，0.5％的十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/l的β-巯基乙醇。
10.优选的，步骤s2中的引物对包括有第一引物、第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如seq id no.1、seq id no.2所示，所述第一引物的5’端用生物素标记；其中步骤s2中rt-rpa扩增的逆转录酶浓度为8000u/l；rt-rpa扩增的引物对浓度为100-1000nmol/l；rt-rpa扩增的恒定温度为30-45℃；rt-rpa扩增的时间为20-40min。
11.优选的，步骤s3中金纳米探针体积为1-10μl；且其金纳米粒子为15-40nm，序列如seq id no.4所示。
12.优选的，所述金纳米探针的制备方法包括以下步骤：
13.a1：将10μl的金探针(10μm)，2μl的tcep溶液(1mm)和1μl的乙酸缓冲液(500mm且ph 5.2)混合，在室温下避光孵化1h；同时在1.5ml离心管中加入1ml金纳米粒子，在8500rpm离心10min后去上清备用；；
14.a2：将活化的金探针加入100μl 10倍浓缩的金纳米粒子中，孵育1h；
15.a3：加入2μl 10％ bsa溶液室温孵育1h；
16.a4：在8500rpm离心10min去除过量的金探针，获得的金纳米探针用100μl重悬液，重悬液为1mm tris-hcl，5％ bsa，0.25％吐温-20，10％蔗糖，ph 8.0，分散后以同样条件离心后用50μl重悬液再次分散。
17.优选的，步骤s3中cas9蛋白的浓度为10-1000nmol/l；其中sgrna的序列如seq id no.3所示，sgrna浓度为10-1000nmol/l；双链产物体积为1-20μl；
18.其中上样缓冲溶液包含pbs缓冲液、氯化镁、蔗糖、牛血清蛋白和聚乙二醇，所述pbs缓冲液的ph值为7.0-8.6，浓度为10-100nmol/l，所述氯化钠的浓度为50-500mmol/l，所述缓冲液的体积为5-15μl，所述蔗糖与缓冲溶液的质量体积比为0.5-2.0g/100ml，所述牛血清蛋白与缓冲溶液的质量体积比为1.0-4.0g/100ml，所述聚乙二醇的分子量为100-10000，所述聚乙二醇与缓冲溶液的质量体积比为0.5-2.0g/100ml；并且孵育时间为1-10min。
19.优选的，步骤s3中的侧向流试纸条包括支撑板，所述支撑板的上端面包括沿设定方向依次设置的上样区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有检测线t和质控线c，且检测线和质控线分别结合有链霉亲和素和捕获探针，所述链霉亲和素浓度为1.0-4.0mg/ml，所述捕获探针浓度为5-50μmol/l，并且捕获探针序列如seq id no.5。
20.优选的，所述支撑板包括不吸水或疏水的纸板、塑料板或聚苯乙烯板；所述上样区的材质包括玻璃纤维棉或聚酯膜；所述划线区的材质包括硝酸纤维素膜或纯纤维素膜；所述吸水区的材质包括滤纸。
21.优选的，该侧向流试纸条的制备方法包括以下步骤：
22.b1：将链霉亲和素固定为划线区的检测线t，将捕获探针固定为划线区的质控线c；
23.b2：将上样区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述侧向流试纸条。
24.侧向流试纸条的应用，该侧向流试纸条用于检测临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
26.1.本发明采用了先逆转录再进行核酸扩增的方法有效解决了rna自身不稳定易降解的问题。
27.2.本发明利用针对胃癌相关lncrna hoxa10的特异性功能化引物对，当存在lncrna hoxa10时，通过rt-rpa扩增获得对应的生物素功能化的双链产物，借助crispr/cas9系统的特异性识别作用，使双链产物的特定位点解旋，然后通过cas9/sgrna与双链产物结合产生的复合物分别与金纳米探针和链霉亲和素杂交将金纳米粒子固定至t线上产生有色条带，从而判断待测临床样品中是否存在胃癌相关lncrna hoxa10。
28.3.本发明的检测方法特异性强，灵敏度高，操作简单，出结果快，结果可视化。
29.4.相对于传统的核酸扩增技术，本发明采用的重组酶聚合酶扩增技术具有显著的优势，比如操作简单并且耗时短，可对临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10进行快速检测；采用crispr/cas9系统特异性识别双链产物，避免了引物二聚体以及非特异性扩增的干扰。
30.5.本发明的检测方法对硬件设备要求相对较低，不需要特殊贵重仪器，通过携带简易包装的冻干试剂、水浴锅和对应的侧向流试纸条，即可实现对临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10的快速、准确、灵敏和可视化检测。
具体实施方式
31.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明提供技术方案：下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
33.本发明提出基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其步骤包括：
34.s1：使用transzol试剂从临床样品中提取总rna；
35.s2：以提取的rna为模板，使用针对lnchoxa10特异性的引物对，采用一步法逆转录重组酶聚合酶扩增技术进行扩增，获得生物素功能化的双链产物；
36.s3：将适量金纳米探针、cas9蛋白、sgrna和双链产物在上样缓冲溶液中混合，并孵育一段时间，将复合物加入侧向流试纸条的检测区进行检测，根据检测线的显色结果实现待测临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10的定性或定量检测。
37.引物对包括第一引物、第二引物，针对cdna特异性的引物，能够实现对目标cdna的特异性的有效扩增，第一引物、第二引物的序列分别如seq id no.1、seq id no.2所示，所述第一引物的5’端用生物素标记。第一引物为生物素功能化的上游引物，第一引物和第二
引物的具体序列表示详见序列表；本发明基于上游引物和下游引物的组合，实现对cdna有效扩增的同时，实现了扩增产物的生物素标记，是基于扩增产物的侧向流试纸条检测临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10的关键设计。
38.金纳米粒子为15-40nm；金探针的序列如seq id no.3所示。
39.金纳米探针的制备方法，包括以下步骤：
40.a1：将10μl的金探针(10μm)，2μl的tcep溶液(1mm)和1μl的乙酸缓冲液(500mm且ph 5.2)混合，避光孵育1h。同时在1.5ml离心管中加入1ml金纳米粒子，在8500rpm离心10min后去上清备用。
41.a2：将活化的金探针加入100μl 10倍浓缩的金纳米粒子溶液中；孵育1h。
42.a3：加入2μl 10％ bsa溶液孵育1h。
43.a4：在8500rpm离心10min去除过量的金探针。获得的金纳米探针用100μl重悬液，该重悬液为1mm tris-hcl，5％ bsa，0.25％吐温-20，10％蔗糖，ph 8.0，分散后以同样条件离心后用50μl重悬液再次分散。
44.sgrna的序列如seq id no.4所示；
45.侧向流试纸条；
46.侧向流试纸条用于检测胃癌相关lncrna hoxa10，其包括支撑板，支撑板的上端面包括沿设定方向依次设置的上样区、划线区及吸水区，划线区内设置有检测线t和质控线c，且检测线和质控线分别结合有链霉亲和素和捕获探针，捕获探针序列如seq id no.5所示。
47.所述链霉亲和素浓度为1.0-4.0mg/ml，所述捕获探针浓度为5-50μmol/l。
48.支撑板包括不吸水或疏水的纸板、塑料板或聚苯乙烯板；上样区的材质包括玻璃纤维棉或聚酯膜；划线区的材质包括硝酸纤维素膜或纯纤维素膜；吸水区的材质包括滤纸。
49.基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法中的侧向流试纸条的制备方法，包括以下步骤：
50.a1：将链霉亲和素固定为划线区的检测线t，将捕获探针固定为划线区的质控线c；
51.a2：将上样区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述侧向流试纸条。
52.在一些更为具体的实施案例之中，所述检测胃癌相关lncrna hoxa10的核酸试纸条的制备方法包括以下步骤：
53.1)划线区的制备：用喷膜仪分别将链霉亲和素喷涂到划线区的检测线t，将捕获探针喷涂到划线区的质控线c，30-36℃烘箱中烘干并保存备用；
54.2)试纸条的组装：将上样区、划线区和吸水区依次组装在支撑板上，组成用于检测lncrna hoxa10的侧向流试纸条。
55.在一些实施例中，检测方法具体包括：利用transzol试剂提取待测临床样品的总rna。以提取的rna为模板，使用针对lnchoxa10特异性的引物对，采用一步法逆转录重组酶聚合酶扩增技术进行扩增，获得生物素功能化的双链产物；将双链产物与金纳米探针、cas9/sgrna混合，得到被cas9/sgrna识别和解旋后结合金纳米探针的双链复合产物；把复合产物直接滴加到试纸条的上样区，流经划线区，利用复合产物将金探针偶联的金纳米粒子连接到检测线t上，通过肉眼直接观察检测线上的颜色深浅，实现对胃癌相关lncrna hoxa10的快速和精准检测。
56.进一步地，transzol试剂包含4mol/l的异硫氰酸胍，ph 7.0和4mol/l的柠檬酸钠，0.5％的十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/l的β-巯基乙醇；
57.进一步地，rt-rpa扩增的逆转录酶浓度为8000u/l；
58.进一步地，rt-rpa扩增的引物对浓度为100-1000nmol/l；
59.进一步地，rt-rpa扩增的恒定温度为30-45℃；
60.进一步地，rt-rpa扩增的时间为20-40min；
61.进一步地，双链产物体积为1-20μl；
62.进一步地，金纳米探针体积为1-10μl；
63.进一步地，cas9的浓度为10-1000nmol/l；
64.进一步地，sgrna浓度为10-1000nmol/l；
65.进一步地，上样缓冲溶液包含pbs缓冲液、氯化镁、蔗糖、牛血清蛋白和聚乙二醇，其中，所述pbs缓冲液的ph值为7.0-8.6，浓度为10-100nmol/l，所述氯化钠的浓度为50-500mmol/l，所述缓冲液的体积为5-15μl，所述蔗糖与缓冲溶液的质量体积比为0.5-2.0g/100ml，所述牛血清蛋白与缓冲溶液的质量体积比为1.0-4.0g/100ml，所述聚乙二醇的分子量为100-10000，所述聚乙二醇与缓冲溶液的质量体积比为0.5-2.0g/100ml；
66.进一步地，孵育时间为1-10min。
67.综上，本发明检测方法的实施步骤为：
①
金纳米探针的制备；
②
划线区的包埋；
③
试纸条的制作；
④
待测临床样品总rna的提取、rt-rpa扩增；
⑤
可视化检测。本发明使用了针对lncrna hoxa10特异的功能化引物对，利用crispr/cas9系统特异性识别和解旋双链产物，根据待测临床样品中lncrna hoxa10含量的不同，扩增得到的产物含量不同，试纸条上检测线的颜色深浅也不相同，从而建立起检测线颜色的深浅与对应lncrna hoxa10含量之间的关系，进而实现对临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10灵敏检测的目的。
68.以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步的解释说明，但其中的实验条件和设定参数不应视为对本发明基本技术方案的局限。并且本发明的保护范围不限于下述的实施例。
69.实施例1
70.本实施例提供的检测临床组织样品中胃癌相关lncrna hoxa10的侧向流试纸条检测方法包括以下步骤：
71.①
金纳米探针的制备：
72.将10μl的金探针(10μm)，2μl的tcep溶液(1mm)和1μl的乙酸缓冲液(500mm且ph 5.2)混合，避光孵育1h。同时在1.5ml离心管中加入1ml金纳米粒子，在8500rpm离心10min后去上清备用。将活化的金探针加入100μl 10倍浓缩的金纳米粒子中。孵育1h。加入2μl 10％ bsa溶液室温孵育1h。在8500rpm离心10min去除过量的金探针。获得的金纳米探针用100μl重悬液，当前的重悬液为1mm tris-hcl，5％ bsa，0.25％吐温-20，10％蔗糖，ph 8.0，分散后以同样条件离心后用50μl重悬液再次分散，4℃保存备用。
②
划线区的包埋：使用喷膜仪把链霉亲和素、捕获探针分别印制到检测线t和质控线c，30℃烘箱中烘干并保存备用。
73.③
试纸条的制作：分别将上样区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上。
74.④
待测组织样品rna的提取、rt-rpa扩增：
75.rna采用transzol试剂从临床组织样品中提取；transzol试剂具体成分包含4mol/
l的异硫氰酸胍，ph 7.0，4mol/l的柠檬酸钠，0.5％的十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/l的β-巯基乙醇。
76.rt-rpa反应具体步骤为：rt-rpa干粉试剂用20μl溶解剂溶解，加入10μm的cdna上下游引物各2μl，逆转录酶1μl，补水至46μl，加入dna模板1μl和激活剂1μl后立即39℃反应25min。
77.⑤
可视化检测：
78.本实施例步骤
④
中的rt-rpa产物通过与金纳米探针、cas9蛋白和sgrna孵育后形成的复合物经上样缓冲液稀释后直接滴加到试纸条的上样区，室温下反应5min，使用单反相机拍摄图片，并利用imagej软件对检测线t的强度进行分析。
79.实施例2
80.本实施例提供的检测临床血液样品与中胃癌相关lncrna hoxa10的侧向流层析检测方法包括以下步骤：
81.①
金纳米探针的制备：
82.将10μl的金探针(10μm)，2μl的tcep溶液(1mm)和1μl的乙酸缓冲液(500mm且ph 5.2)混合，避光孵育1h。同时在1.5ml离心管中加入1ml金纳米粒子，在8500rpm离心10min后去上清备用。将活化的金探针加入100μl 10倍浓缩的金纳米粒子中。孵育1h。加入2μl 10％ bsa溶液室温孵育1h。在8500rpm离心10min去除过量的金探针。获得的金纳米探针用100μl重悬液，当前的重悬液为1mm tris-hcl，5％ bsa，0.25％吐温-20，10％蔗糖，ph 8.0，分散后以同样条件离心后用50μl重悬液再次分散，4℃保存备用。
②
划线区的包埋：使用喷膜仪把链霉亲和素、捕获探针分别印制到检测线t和质控线c，30℃烘箱中烘干并保存备用。
83.②
划线区的包埋：使用喷膜仪把链霉亲和素、捕获探针分别印制到检测线t和质控线c，30℃烘箱中烘干并保存备用。
84.③
试纸条的制作：分别将上样区、划线区和吸水区按顺序组装到支撑板上。
85.④
待测血液样品rna的提取、rt-rpa扩增：
86.rna采用transzol试剂从临床组织样品中提取；transzol试剂具体成分包含4mol/l的异硫氰酸胍，ph 7.0，4mol/l的柠檬酸钠，0.5％的十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/l的β-巯基乙醇。
87.rt-rpa反应具体步骤为：rt-rpa干粉试剂用20μl溶解剂溶解，加入10μm的cdna上下游引物各2μl，逆转录酶1μl，补水至46μl，加入dna模板1μl和激活剂1μl后立即39℃反应25min。
88.⑤
可视化检测：
89.本实施例步骤
④
中的rt-rpa产物通过与金纳米探针、cas9蛋白和sgrna孵育后形成的复合物经上样缓冲液稀释后直接滴加到试纸条的上样区，室温下反应5min，使用单反相机拍摄图片，并利用imagej软件对检测线t的强度进行分析。
90.综上，借由上述技术方案，本发明根据胃癌相关lncrna hoxa10存在时，通过rt-rpa扩增获得对应的生物素功能化的双链扩增产物，利用crispr/cas9系统识别和解旋双链扩增产物并得到其复合物，然后利用复合物将金纳米探针连接到检测线上，从而产生有色条带。根据胃癌相关lncrna hoxa10的含量不同，导致结合到检测线上的金纳米粒子的量不同，使不同检测线颜色的深浅不同，建立起不同检测线颜色的深浅胃癌相关lncrna hoxa10
含量之间的关系，实现对胃癌相关lncrna hoxa10灵敏筛查和检测的目的。此方法特异性好、灵敏度高、重复性好、操作简单，结果可视化，并且检测时间较短。此方法不需要特殊贵重仪器，仅需要简易包装的冻干试剂、水浴锅和对应的侧向层析试纸条，即可实现对临床待测样品中胃癌相关lncrna hoxa10的快速、准确地检测，适用于检测硬件资源匮乏地区开展相关的工作。
91.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

技术特征：
1.基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：该方法包括有以下步骤：s1：使用transzol试剂从临床样品中提取总rna；s2：以提取的rna为模板，使用针对lnchoxa10特异性的引物对，采用一步法逆转录重组酶聚合酶扩增技术进行扩增，获得生物素功能化的双链产物；s3：将适量金纳米探针、cas9蛋白、sgrna和双链产物在上样缓冲溶液中混合，并孵育一段时间，将复合物加入侧向流试纸条的检测区进行检测，根据检测线的显色结果实现待测临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10的定性或定量检测。2.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：步骤s1中的transzol试剂包含异4mol/l的硫氰酸胍，ph 7.0，4mol/l的柠檬酸钠，0.5％的十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/l的β-巯基乙醇。3.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：步骤s2中的引物对包括有第一引物、第二引物，所述第一引物、第二引物的序列分别如seq id no.1、seq id no.2所示，所述第一引物的5’端用生物素标记；其中步骤s2中rt-rpa扩增的逆转录酶浓度为8000u/l；rt-rpa扩增的引物对浓度为100-1000nmol/l；rt-rpa扩增的恒定温度为30-45℃；rt-rpa扩增的时间为20-40min。4.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：步骤s3中金纳米探针体积为1-10μl；且其金纳米粒子为15-40nm，序列如seq id no.4所示。5.根据权利要求4所述的基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：所述金纳米探针的制备方法包括以下步骤：a1：将10μl的金探针(10μm)，2μl的tcep溶液(1mm)和1μl的乙酸缓冲液(500mm且ph 5.2)混合，在室温下避光孵化1h；同时在1.5ml离心管中加入1ml金纳米粒子，在8500rpm离心10min后去上清备用；a2：将活化的金探针加入100μl 10倍浓缩的金纳米粒子中，孵育1h；a3：加入2μl 10％bsa溶液室温孵育1h；a4：在8500rpm离心10min去除过量的金探针，获得的金纳米探针用100μl重悬液，重悬液为mm tris-hcl，5％bsa，0.25％吐温-20，10％蔗糖，ph 8.0，分散后以同样条件离心后用50μl重悬液再次分散。6.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：步骤s3中cas9蛋白的浓度为10-1000nmol/l；其中sgrna的序列如seq id no.3所示，sgrna浓度为10-1000nmol/l；双链产物体积为1-20μl；其中上样缓冲溶液包含pbs缓冲液、氯化镁、蔗糖、牛血清蛋白和聚乙二醇，所述pbs缓冲液的ph值为7.0-8.6，浓度为10-100nmol/l，所述氯化钠的浓度为50-500mmol/l，所述缓冲液的体积为5-15μl，所述蔗糖与缓冲溶液的质量体积比为0.5-2.0g/100ml，所述牛血清蛋白与缓冲溶液的质量体积比为1.0-4.0g/100ml，所述聚乙二醇的分子量为100-10000，所述聚乙二醇与缓冲溶液的质量体积比为0.5-2.0g/100ml；并且孵育时间为1-10min。7.根据权利要求1所述的基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：步骤s3中的侧向流试纸条包括支撑板，所述支撑板的上端面包括沿设定方
向依次设置的上样区、划线区及吸水区，所述划线区内设置有检测线t和质控线c，且检测线和质控线分别结合有链霉亲和素和捕获探针，所述链霉亲和素浓度为1.0-4.0mg/ml，所述捕获探针浓度为5-50μmol/l，并且捕获探针序列如seq id no.5。8.根据权利要求7所述的基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：所述支撑板包括不吸水或疏水的纸板、塑料板或聚苯乙烯板；所述上样区的材质包括玻璃纤维棉或聚酯膜；所述划线区的材质包括硝酸纤维素膜或纯纤维素膜；所述吸水区的材质包括滤纸。9.根据权利要求7所述的基于crispr/cas9的胃癌相关lncrna hoxa10的检测试纸条方法，其特征在于：该侧向流试纸条的制备方法包括以下步骤：b1：将链霉亲和素固定为划线区的检测线t，将捕获探针固定为划线区的质控线c；b2：将上样区、划线区和吸水区沿设定方向依次设置在支撑板上，获得所述侧向流试纸条。10.如权利要求1-9任意一项所述的侧向流试纸条，其特征在于：该侧向流试纸条用于检测临床样品中胃癌相关lncrna hoxa10。

技术总结
本发明涉及生物医学技术领域，提供了临床样品中胃癌相关LncRNA HOXA10的快速检测方法，所述针对胃癌相关LncRNA HOXA10特异性的引物对分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述CRISPR/Cas9包括Cas9蛋白和sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.3所示，所述金探针序列如SEQ ID NO.4所示，所述侧向流层析技术包括支撑板，所述支撑板的上端面包括依次设置的上样区、划线区及吸水区，所述划线区内设置结合链霉亲和素的检测线T和捕获探针的质控线C，所述捕获探针序列如SEQ ID NO.5所示；本发明的检测方法灵敏度高，特异性强，操作简单，结果可肉眼观测到。肉眼观测到。


技术研发人员：赵奇红 秦盼柱 王华 江翰 胡安拉
受保护的技术使用者：安徽医科大学
技术研发日：2023.06.08
技术公布日：2023/10/15