化学发光底物及其制备方法与流程

1.本发明涉及体外诊断技术领域，特别是涉及一种化学发光底物及其制备方法。


背景技术：

2.化学发光是由于物质在进行化学氧化反应过程中吸收了反应释放的能量，由基态跃迁至激发态，然后再从激发态返回基态时将能量以光辐射的形式释放出来，产生化学发光。目前，化学发光在免疫检测领域得到了广泛应用，相比生化分析、酶免分析、荧光免疫分析，其具有灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽等特点。按照化学反应类型不同，化学发光可分为酶促化学发光和非酶促化学发光；其中碱性磷酸酶(alp)系统是化学发光免疫检测的重要发展方向，其信号检测无须原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域(光坪区)固定点测量单位时间的发光强度。
3.aps5是一种商业碱性磷酸酶底物制剂，相比amppd类底物，其具有更短的周转时间(tat),一般在一分钟内达到光坪区，并维持长时间的最大发光强度。这特别适用用于poct化学发光检测，更进一步地可应用于poct化学发光多指标联检。但是，aps5底物仍有其局限性，相较于amppd类底物其开瓶效期短，一般保存有效期为2～8度保存仅一年，这限制了aps5底物在免疫诊断领域的应用。因此，期望开发一种碱性磷酸酶底物配方和工艺，能够具备aps5底物快速达到光坪区来满足poct化学发光多指标检测需求；同时也具备极好的稳定性，如常温保存一年，以突破传统化学发光免疫试剂在保存和运输上需要低温条件的要求，进一步地推进化学发光检测实现真正意义上的poct应用。
4.但是，目前制备的化学发光底物，存在常温稳定性差，整体信号值偏差较大的技术问题。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供一种化学发光底物，以解决传统技术中化学发光底物存在稳定性差的技术问题。
6.本技术一方面提供一种冻干辅料组合物，所述冻干辅料组合物包括质量比例为(5～15)：(1～10)：(1～5)的甘露醇、糖类和氨基酸，或者包括质量比为(3～10)：(1～10)：(1～5)：(1～10)的peg、糖类、氨基酸和pvp，或者包括质量比为(5～10：(1～10)：(1～5)的pvp、糖类和氨基酸。
7.在其中一个实施例中，所述peg分子量为20k～200k；所述pvp分子量为8k～70k；所述糖类选自海藻糖、乳糖、菊糖和蔗糖中的一种或多种；所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸和丙氨酸中的一种或多种
8.在其中一个实施例中，所述冻干辅料组合物包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(2～4)的甘露醇、海藻糖和甘氨酸，或者包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(1～3)的peg20k、海藻糖和pvpk40，或者包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(2～4)的pvpk40、菊糖和缬氨酸。
9.本技术另一方面提供一种aps5发光底物产品，所述aps5发光底物产品包括aps5、
光泽精以及权利要求1所述的冻干辅料组合物。
10.在其中一个实施例中，所述aps5发光底物产品包括：
11.(1)稀释液；
12.(2)aps5底物冻干组合物；以及，
13.(3)光泽精冻干组合物；所述aps5底物组合物包括权利要求1所述的冻干辅料组合物，或/和，所述光泽精组合物包括权利要求1所述的冻干辅料组合物。
14.在其中一个实施例中，所述aps5底物冻干组合物包括aps5、亚硫酸钠和tris缓冲体系。
15.在其中一个实施例中，所述aps5底物冻干组合物包括6g/l～7g/l aps5、4g/l～6g/l亚硫酸钠和ph为8.5～9.7，0.04mol/l～0.06mol/l的tris缓冲体系。
16.在其中一个实施例中，所述光泽精冻干组合物包括光泽精和tris缓冲体系。
17.在其中一个实施例中，所述光泽精冻干组合物包括0.6g/l～0.7g/l光泽精和ph为6～8，0.01mol/l～0.3mol/l的tris缓冲体系。
18.在其中一个实施例中，所述稀释液包括0.6g/l～1.0g/l十二烷基硫酸钠、0.1g/l～0.3g/l triton-100和ph为8.8～9.2，0.04mol/l～0.06mol/l tris缓冲体系。
19.在其中一个实施例中，所述aps5底物冻干组合物的微球平均粒径为0.5mm～5mm；或/和，所述光泽精冻干组合物的微球平均粒径为0.5mm～5mm。
20.本技术还提供一种aps5发光底物产品的制备方法，所述制备方法包括将所述的aps5、光泽精以及冻干辅料组合物制备成aps5发光底物产品的步骤。
21.在其中一个实施例中，所述制备方法还包括制备稀释液的步骤。
22.本技术还提供一种alp酶的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用权利要求4至11任一项所述的aps5发光底物产品对待测样品中alp酶检测的步骤。
23.在其中一个实施例中，检测的步骤包括：
24.混合所述的稀释液、aps5底物冻干组合物和光泽精冻干组合物，制备发光底物液，用所述发光底物液对所述待测样品中的alp酶进行检测。相对于传统技术，本技术的有益效果包括：
25.本技术提供的化学发光底物，从稳定性上看，在使用过程中信号值变化稳定，整体信号值偏差不超过10％。从灵敏度上看，可以对20fg alp酶进行检出，灵敏度达到fg级。从保存周期上看，可以常温保存18个月。该化学发光底物具有稳定性强、灵敏度高，保存周期长的特点。
附图说明
26.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案、更完整地理解本技术及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为aps5组合底物配方温育时间与信号值关系图；
28.图2为aps5组分冻干微球和光泽精冻干微球外观图。
具体实施方式
29.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
30.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本文中的“可选地”表示举例。
31.aps5底物是基于吖啶酯基本结构合成的新兴发光底物，具有更短的温育期，一般在一分钟内达到光坪区，并长时间维持最大发光强度；因此，aps5底物兼具辉光型发光体系的发光信号稳定且持续发光时间长，以及闪光型发光体系的发光反应检测时间短的优点。
32.但是，aps5底物本身不稳定，有效期时间相对较短，容易产生背景发光、校准曲线漂移，这限制其在自动化免疫检测领域的应用。因此，采用冻干微球技术，将aps5底物制备成冻干微球，最大程度保留了aps5底物温育期短、发光强度高且长时间保持稳定的优势，同时极大提升了aps5底物的稳定性，甚至实现了底物常温保存。
33.更进一步地，发挥了冻干微球优点，实现单人份包装和可冻干后再分配，并解决了大批量产能问题。综合常温保存、发光反应时间短、信号强度高且长时间稳定、单人份包装和大批量生产等优势。
34.而本技术通过研究发现全组分aps5底物冻干试剂表现出较差的稳定性，整体信号值偏差均超过50％，aps5底物全组分冻干实现常温稳定性难度较大，需要进一步优化。
35.申请人通过doe设计分析aps5液体底物配方之间的交互作用发现：表面活性剂、aps5和光泽精之间存在较强的交互作用，表面活性剂试剂在常温条件下可以稳定保存，因此将表面活性剂添加到底物稀释液中。剩下aps5和光泽精液体状态下本身不够稳定，且光泽精会对aps5中间产物进行作用，故将aps5和光泽精分别制备成冻干微球。将两种冻干微球存放在一起，待使用时，添加底物稀释液复溶后与酶进行反应。
36.aps5:9-(4-氯苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基二氢吖啶二钠盐。
37.本技术一方面提供一种冻干辅料组合物，所述冻干辅料组合物包括质量比例为(5～15)：(1～10)：(1～5)的甘露醇、糖类和氨基酸，或者包括质量比为(3～10)：(1～10)：(1～5)：(1～10)的peg、糖类、氨基酸和pvp，或者包括质量比为(5～10：(1～10)：(1～5)的pvp、糖类和氨基酸。
38.在一个具体的示例中，所述peg分子量为20k～200k；所述pvp分子量为8k～70k；所述糖类选自海藻糖、乳糖、菊糖和蔗糖中的一种或多种；所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸和丙氨酸中的一种或多种。
39.在一个具体的示例中，所述冻干辅料组合物包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(2～4)的甘露醇、海藻糖和甘氨酸，或者包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(1～3)的peg20k、海藻糖和pvpk40，或者包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(2～4)的pvpk40、菊糖和缬氨酸。
40.例如甘露醇、海藻糖和甘氨酸的质量比为7：4：2或8：5：3或9：6：4或其它范围区间内的组合比值；peg20k、海藻糖和pvpk40的质量比为7：4：2或8：5：5或9：6：3或其它范围区间内的组合比值；pvpk40、菊糖和缬氨酸的质量比为7：4：2或8：5：3或9：6：4或其它范围区间内
的组合比值。
41.本技术另一方面提供一种aps5发光底物产品，所述aps5发光底物产品包括aps5、光泽精以及上述的冻干辅料组合物。
42.在其中一个实施例中，所述aps5发光底物产品包括：
43.(1)稀释液；
44.(2)aps5底物冻干组合物；以及，
45.(3)光泽精冻干组合物。
46.在一个具体的示例中，所述aps5底物组合物包括上述的冻干辅料组合物，或/和，所述光泽精组合物包括上述的冻干辅料组合物。
47.可选地，所述aps5底物冻干组合物包括aps5、亚硫酸钠和tris缓冲体系。
48.可以理解的是本技术采用的是tris buffer，但除了tris buffer也可以是其他适合的ampso buffer、borate buffer、ches buffer或amp buffer。
49.进一步可选地，所述aps5底物冻干组合物包括6g/l～7g/laps5、4g/l～6g/l亚硫酸钠和ph为8.5～9.7，0.04mol/l～0.06mol/l的tris缓冲体系。例如6g/l、6.2g/l、6.4g/l、6.6g/l、6.8g/l、7.0g/l的aps5；4g/l、4.5g/l、5g/l、5.5g/l、6g/l的亚硫酸钠；ph为8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7，浓度为0.01mol/l、0.02mol/l、0.03mol/l、0.04mol/l、0.05mol/l、0.06mol/l、0.07mol/l、0.08mol/l、0.09mol/l、0.1mol/l、0.15mol/l、0.20mol/l、0.25mol/l、0.3mol/l的tris缓冲体系。
50.在一个具体的示例中，所述光泽精冻干组合物包括光泽精和tris缓冲体系。
51.可选地，所述光泽精冻干组合物包括0.6g/l～0.7g/l光泽精和ph为7.2～7.6，0.04mol/l～0.06mol/l的tris缓冲体系。
52.进一步可选地，例如0.6g/l、0.62g/l、0.64g/l、0.66g/l、0.68g/l、0.7g/l的光泽精；ph为7.2、7.3、7.4、7.5、7.6，0.04mol/l、0.045mol/l、0.05mol/l、0.055mol/l、0.06mol/l的tris缓冲体系。
53.在一个具体的示例中，所述稀释液包括0.6g/l～0g/l十二烷基硫酸钠、0.1g/l～0.3g/l triton-100和ph为8.8～9.2，浓度为0.04mol/l～0.06mol/l tris缓冲体系。
54.例如0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l的triton-100，ph为8.8、8.9、9.0、9.1、9.2，浓度为0.04mol/l、0.05mol/l、0.06mol/l的tris缓冲体系。
55.其中，所述aps5底物冻干组合物的微球平均粒径为0.5mm～5mm；或/和，所述光泽精冻干组合物的微球平均粒径为0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2.0mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm。例如aps5底物冻干组合物或光泽精冻干组合物的微球平均粒径为0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2.0mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.4mm、2.5mm、2.6mm、2.7mm、2.8mm、2.9mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm、4.5mm
56.本技术另一方面还提供一种aps5发光底物产品的制备方法，所述制备方法包括将所述的aps5、光泽精以及冻干辅料组合物制备成aps5发光底物产品的步骤。
57.在一个具体的示例中，所述制备方法还包括制备稀释液的步骤。
58.本技术还提供一种alp酶的检测方法，所述检测方法包括采用上述的aps5发光底
物产品对待测样品中alp酶检测的步骤。
59.在一个具体的示例中，检测的步骤包括：
60.混合所述的稀释液、aps5底物冻干组合物和光泽精冻干组合物，制备发光底物液，用所述发光底物液对所述待测样品中的alp酶进行检测。
61.以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
62.实施例1：冻干微球制备和冻干辅料初筛
63.(1)冻干预液准备：冻干预液分为储液和冻干辅料两个部分，储液包括试剂中的活性成分物质、缓冲液、表面活性剂和防腐剂等。冻干辅料主要起到赋形、冻干保护剂的作用，不同冻干辅料对冻干微球外观、稳定性和硬度等性能影响较大，因此筛选不同的冻干辅料对于冻干微球来说至关重要，不同冻干辅料体系见表1，按照质量百分比将不同冻干辅料投入ph 7.4、50mm tris buffer中制备成冻干预液。
64.表1不同冻干辅料组合
[0065][0066]
(2)冻干微球制备：使用ivek digispense 3009系统调整出液体积为5μl，将冻干预液滴入存有液氮的分隔器中形成冷冻微球，然后将冷冻微球转移至已预冻至-50℃的真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥曲线如表2所示。
[0067]
表2
[0068][0069][0070]
(3)冻干微球分装：冷冻干燥结束后，在湿度小于40％、温度为25度左右的干燥室内完成对冻干微球的分装工作。注意：从底物滴珠、冻干到分装等过程中，实验均在避光或微光条件下进行，以避免过度曝光对底物检测信号值产生影响。
[0071]
(4)不同冻干辅料冻干微球性能评估
[0072]
将分装好的一部分冻干微球放置在湿度小于40％、温度为50度干燥箱中；高温加速破坏两周后，使用游标卡尺测量冻干微球尺寸变化，在体视显微镜下观察冻干微球的外观，加入超纯水测试其溶解性等性能。统计结果如表3所示，大部分冻干辅料配方均有较好的外观，其中添加pvpk40、海藻糖、bsa等组分，或者提高这些组分的浓度能够改善冻干微球的硬度。根据统计结果来看，所选冻干辅料体系可以是以下组合：
[0073]
组合1：甘露醇(5％～15％)+糖(单糖或多糖，0％～10％)+氨基酸(0％～10％)+bsa(0％～5％)
[0074]
组合2：peg(分子量200～20k，3％～10％)+糖(单糖或多糖，0％～10％)+氨基酸(0％～5％)+pvp(分子量8k～70k，0％～10％)
[0075]
组合3：pvp(分子量8k～70k，5％～10％)+糖(单糖或多糖，0％～10％)+氨基酸(0％～5％)
[0076]
在这些冻干辅料组合下，对aps5底物进行冻干微球工艺优化。
[0077]
表3
[0078]
[0079][0080]
实施例2aps5底物全组分冻干
[0081]
(1)全组分底物冻干预液配制
[0082]
aps5发光底物液具体配方为：130mg/l 9-(4-氯苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基二氢吖啶二钠盐、3.2mg/l光泽精、0.8g/l十二烷基硫酸钠、0.1g/l无水亚硫酸钠、0.2g/l triton-100、0.05％proclin300以及0.3mol/l tris buffer(ph 9.0)。由于tris buffer含量较高，不利于冻干，选择0.3mol/l tris buffer(ph 9.0，含0.05％ proclin300)作为稀释液。冻干预液分为储液和冻干辅料两个部分，储液配方为：130mg/l 9-(4-氯苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基二氢吖啶二钠盐或aps5、3.2mg/l光泽精、0.8g/l十二烷基硫酸钠、0.1g/l无水亚硫酸钠、0.2g/ltriton-100以及0.05mol/l tris buffer(ph 9.0)；储液搭配的冻干辅料体系可以是优选组合1：甘露醇(优选8％)+海藻糖(优选5％)+甘氨酸(优选3％)、优选组合2：peg20k(优选8％)+海藻糖(优选5％)+pvpk40(优选2％)、优选组合3：pvpk40(优选8％)+菊糖(优选5％)+缬氨酸(优选3％)。
[0083]
(2)冻干微球制备参考实施例1
[0084]
(3)稳定性测试
[0085]
将自研aps5底物(底物冻干微球、稀释液)和鲁米根aps5商品化底物，进行37度避光加速两周，自研aps5底物增加50度避光加速两周实验，同时2～8度避光保存样品作为对照；使用超纯水将高浓度1μg/ml alp酶母液梯度稀释至不同浓度的样本，即配即用。取梯度稀释的alp酶样品20μl与100μl aps5底物37度进行反应孵育30秒后，使用亚辉龙iflash3000进行读数。
[0086]
37度加速破坏结果如表4-1、4-2所示，37度加速两周后，鲁米根aps5商品化底物，最大信号值偏差超过30％；三种全组分aps5底物冻干试剂表现出良好的稳定性，整体信号值偏差在15％以内，其中优选组合3最优，信号值偏差在5％以内。
[0087]
表4-1 37度加速破坏两周后鲁米根底物和aps5冻干底物优选组合1信号值变化
[0088][0089]
表4-2：37度加速破坏两周后aps5冻干底物优选组合2和组合3信号值变化
[0090][0091][0092]
50度加速破坏结果如表5所示，50度加速两周后，三种全组分aps5底物冻干试剂表现出较差的稳定性，整体信号值偏差均超过50％，aps5底物全组分冻干实现常温稳定性难度较大，需要进一步优化。
[0093]
表5：50度加速破坏两周后aps5全组分冻干底物信号值变化
[0094][0095][0096]
实施例3组分拆分冻干
[0097]
通过将aps5底物进行全组分冻干后，37度加速破坏两周稳定性表现优秀，但是仍然无法抵抗50度高温加速破坏，信号值掉值超过50％。一种可能性是在高温条件下，加速了aps5底物配方中某些组分进行反应。在开发前期，通过doe设计分析aps5液体底物配方之间的交互作用发现：表面活性剂、aps5和光泽精之间存在较强的交互作用，表面活性剂试剂在常温条件下可以稳定保存，因此将表面活性剂添加到底物稀释液中。剩下aps5和光泽精液体状态下本身不够稳定，且光泽精会对aps5中间产物进行作用，故将aps5和光泽精分别制备成冻干微球。将两种冻干微球存放在一起，待使用时，添加底物稀释液复溶后与酶进行反应。
[0098]
(1)底物冻干预液配制
[0099]
稀释液：0.8g/l十二烷基硫酸钠、0.2g/l triton-100以及0.05mol/l tris buffer(ph 9.0)。
[0100]
aps5底物冻干组合物：6.5g/l 9-(4-氯苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基二氢吖啶二钠盐、5g/l无水亚硫酸钠以及0.05mol/l tris buffer(ph 9.0)。
[0101]
光泽精冻干组合物：0.64g/l光泽精以及0.05mol/l tris buffer(ph 7.4)。
[0102]
储液搭配的冻干辅料体系可以是
[0103]
优选组合1：甘露醇(优选8％)+海藻糖(优选5％)+甘氨酸(优选3％)、优选组合2：peg20k(优选8％)+海藻糖(优选5％)+pvpk40(优选2％)、优选组合3：pvpk40(优选8％)+菊糖(优选5％)+缬氨酸(优选3％)。
[0104]
(2)冻干微球制备参考实施例1
[0105]
(3)稳定性测试
[0106]
将自研aps5底物冻干组合物、光泽精冻干组合物置于50度、湿度小于40％、避光条件下加速破坏，同时2～8度干燥避光保存样品作为对照；使用超纯水将高浓度1μg/ml alp酶母液梯度稀释至不同浓度的样本，即配即用。取梯度稀释的alp酶样品20μl与100μl aps5底物、37度进行反应孵育30秒后，使用亚辉龙iflash3000进行读数。
[0107]
a.aps5底物冻干组合物配方筛选
[0108]
aps5组分冻干组合物微球(滴珠体积为5μl)取4颗溶解于1ml aps5组分冻干稀释液中配制成aps5底物工作液，aps5组分稀释液配方为：3.2mg/l光泽精、0.8g/l十二烷基硫酸钠、0.2g/l triton-100、0.05％ proclin300以及0.3mol/ltris buffer(ph 9.0)。将aps5底物液与酶样品反应后，测试结果如表6所示，组合2有更好的稳定性，50度加速前后信号值偏差在10％以内，作为优选。
[0109]
表6：50度加速破坏两周后aps5组分冻干配方信号值变化
[0110][0111]
b.光泽精组分冻干配方筛选
[0112]
光泽精组分冻干组合物微球(滴珠体积为5μl)取1颗溶解于1ml光泽精组分冻干稀释液中配制成aps5底物工作液，光泽精组分稀释液配方为：130mg/l9-(4-氯苯基硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基二氢吖啶二钠盐、0.8g/l十二烷基硫酸钠、0.1g/l无水亚硫酸钠、0.2g/l triton-100、0.05％ proclin300以及0.3mol/l tris buffer(ph 9.0)。将aps5底物液与酶样品反应后，测试结果如表7所示，组合3有更好的稳定性，50度加速前后信号值偏差在10％以内，作为优选。
[0113]
表7：50度加速破坏两周后光泽精组分冻干配方信号值变化
[0114][0115]
c.组合冻干配方测试
[0116]
将组分冻干配方置于50度、湿度小于40％、避光条件下加速破坏一个月后，取aps5底物冻干组合物微球(5μl滴珠体积，优选冻干辅料组合2：8％peg20k+5％海藻糖+2％ pvpk40)4颗和光泽精冻干组合物微球(5μl滴珠体积，优选冻干辅料组合3：8％ pvpk40+5％菊糖+3％缬氨酸)1颗溶解于1ml稀释液，其中稀释液配方为：0.8g/l十二烷基硫酸钠、0.2g/l triton-100以及0.05mol/l tris buffer(ph 9.0)。将aps5底物液与酶样品反应后，测试结果如表8所示，将aps5底物冻干组合物微球、光泽精冻干组合物微球搭配稀释液后，50度加速一个月信号值变化稳定，不超过10％。从灵敏度上看，aps5组合冻干配方可以对20fg alp酶进行检出，灵敏度达到fg级。
[0117]
表8：50度加速破坏一个月后组合分冻干配方信号值变化
[0118][0119]
实施例4对实施3进行性能验证
[0120]
(1)常温稳定性验证
[0121]
将aps5组分冻干微球、光泽精冻干微球以及稀释液置于常温(25度～30度)、湿度小于40％、避光条件下不同时间，监控18个月效期稳定性。测试结果如表9-1、9-2所示，aps5底物组合配方在常温保存18个月内，测试alp酶样品信号值保持稳定，偏差整体上在10％以内。
[0122]
表9-1：底物冻干组合配方常温放置9个月信号值变化
[0123][0124]
表9-2：底物冻干组合配方常温放置18个月信号值变化
[0125][0126]
(2)温育时间验证
[0127]
将实施例3中aps5底物冻干组合物复溶后制备成底物工作液，取浓度为100pg/ml的alp酶样品20μl与100μl aps5底物工作液、37度进行反应孵育不同时间后，使用亚辉龙iflash3000进行读数。图1表现出了aps5组合底物配方在不同温育时间下的信号值，当温育时间在30s左右时，信号值达到最大，光坪区的持续时间超过10分钟。
[0128]
(3)试剂外观
[0129]
常温放置18个月后，aps5底物冻干组合物微球、光泽精冻干组合物微球外观无萎缩和颜色变化、大小均一、表面光滑；稀释液仍澄清透明，无絮状物。图2是aps5底物冻干组合物微球和光泽精冻干组合物微球外观图。
[0130]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0131]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明
的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.一种冻干辅料组合物，其特征在于，所述冻干辅料组合物包括质量比例为(5～15)：(1～10)：(1～5)的甘露醇、糖类和氨基酸，或者包括质量比为(3～10)：(1～10)：(1～5)：(1～10)的peg、糖类、氨基酸和pvp，或者包括质量比为(5～10：(1～10)：(1～5)的pvp、糖类和氨基酸。2.根据权利要求1所述的冻干辅料组合物，其特征在于，所述peg分子量为20k～200k；所述pvp分子量为8k～70k；所述糖类选自海藻糖、乳糖、菊糖和蔗糖中的一种或多种；所述氨基酸选自甘氨酸、缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸和丙氨酸中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的冻干辅料组合物，其特征在于，所述冻干辅料组合物包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(2～4)的甘露醇、海藻糖和甘氨酸，或者包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(1～3)的peg20k、海藻糖和pvpk40，或者包括质量比例为(7～9)：(4～6)：(2～4)的pvpk40、菊糖和缬氨酸。4.一种aps5发光底物产品，其特征在于，所述aps5发光底物产品包括aps5、光泽精以及权利要求1～3任一项所述的冻干辅料组合物。5.根据权利要求4所述的aps5发光底物产品，其特征在于，所述aps5发光底物产品包括：(1)稀释液；(2)aps5底物冻干组合物；以及，(3)光泽精冻干组合物；所述aps5底物组合物包括权利要求1～3任一项所述的冻干辅料组合物，或/和，所述光泽精组合物包括权利要求1～3任一项所述的冻干辅料组合物。6.根据权利要求5所述的aps5发光底物产品，其特征在于，所述aps5底物冻干组合物包括aps5、亚硫酸钠和tris缓冲体系。7.根据权利要求6所述的aps5发光底物产品，其特征在于，所述aps5底物冻干组合物包括6g/l～7g/l aps5、4g/l～6g/l亚硫酸钠和ph为8.5～9.7，0.01mol/l～0.3mol/l的tris缓冲体系。8.根据权利要求5所述的aps5发光底物产品，其特征在于，所述光泽精冻干组合物包括光泽精和tris缓冲体系。9.根据权利要求6所述的aps5发光底物产品，其特征在于，所述光泽精冻干组合物包括0.6g/l～0.7g/l光泽精和ph为6～8，0.01mol/l～0.3mol/l的tris缓冲体系。10.根据权利要求4至9中任一项所述的aps5发光底物产品，其特征在于，所述稀释液包括0.6g/l～1.0g/l十二烷基硫酸钠、0.1g/l～0.3g/l triton-100和ph为8.8～9.2，0.04mol/l～0.06mol/l tris缓冲体系。11.根据权利要求4至9中任一项所述的aps5发光底物产品，其特征在于，所述aps5底物冻干组合物的微球平均粒径为0.5mm～5mm；或/和，所述光泽精冻干组合物的微球平均粒径为0.5mm～5mm。12.权利要求4至11任一项所述的aps5发光底物产品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将所述的aps5、光泽精以及冻干辅料组合物制备成aps5发光底物产品的步骤。13.根据权利要求12所述的aps5发光底物产品的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括制备稀释液的步骤。
14.一种alp酶的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括采用权利要求4至11任一项所述的aps5发光底物产品对待测样品中alp酶检测的步骤。15.根据权利要求14所述的alp酶的检测方法，其特征在于，检测的步骤包括：混合所述的稀释液、aps5底物冻干组合物和光泽精冻干组合物，制备发光底物液，用所述发光底物液对待测样品中的alp酶进行检测。

技术总结
本申请涉及体外诊断技术领域，主要涉及一种化学发光底物分组分冻干微球及其制备方法。通过将APS化学发光底物进行组分拆分冻干，在使用过程中信号值变化稳定，整体信号值偏差不超过10％。从灵敏度上看，APS5组合冻干配方可以对20fg ALP酶进行检出，灵敏度达到fg级。并且可以常温保存18个月，并兼具稳定性与检测灵敏度。敏度。敏度。


技术研发人员：王作铭 王晶晶 钱纯亘
受保护的技术使用者：深圳市卓润生物科技有限公司
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/10/15