一种基于特征标志物质GC-IMS指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法及其应用与流程

一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于气味物质分析检测技术领域，具体涉及一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法及其应用。


背景技术：

2.生姜，别名白姜、均姜，属姜科姜属多年生草本植物根茎，具有独特的辛辣味，是传统的药食两用经济作物。生姜的组分多而复杂，不仅含有蛋白质、维生素、膳食纤维等人体必需营养物质，而且富含挥发油成分、姜辣素组分和二苯基庚烷成分等。
3.生姜因其特殊芳香风味和辛辣风味，作为调味佳品被广泛应用在中餐烹饪和各类食品中。风味是决定生姜品质的主要因素之一，生姜风味特性主要由生姜中挥发性风味物质决定。生姜的特征挥发性风味物质不仅是指导消费者采购的重要感官指标之一，也是影响生姜品质和加工特性的重要因素，其成分及含量对生姜精深加工和综合利用起着十分关键的作用。
4.目前，对于生姜风味研究主要集中在生姜风味物质化学组分的定性定量分析，各种香气物质组分差异及其影响因素(遗传特性、环境因子和栽培措施等因素)等问题上，已有研究发现对新鲜生姜呈香影响最大的是一系列单萜类物质，如香叶醇，芳樟醇，及香叶醛等，但是，对于生姜风味成分中的关键致香物质、键合态风味前体物质、风味的生物合成途径及其相关酶的生理功能、贮藏和加工过程挥发性物质变化的机理等研究得较少。除此之外，生姜在贮藏和流通过程中极易发生腐烂，产生不愉快的“腐烂味”，极大影响了生姜的商品价值，造成严重的经济损耗，而对“腐烂味”的关键物质基础和标志性化合物还未发现有此方面研究报道。
5.因此，从分子水平上对“姜辣味”和“腐烂味”关键贡献物质活性物质进行深入研究和解析，明确标志性化合物是十分必要和迫切的，该研究不但有助于认识特征风味形成的实质，还可以为生姜贮藏风味品质保持、减耗和调控提供更多科学数据和技术支撑。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法。
7.本发明分别以不同新鲜程度的生姜为原料，基于gc-ims分析了正常生姜和腐烂生姜的特征标志物质的差异，建立了基于风味指纹信息的正常生姜和腐烂生姜的区分方法，为判断生姜腐烂程度提供了理论依据。
8.本发明所提供的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，具体包括如下步骤：
9.(1)将腐烂生姜和正常生姜分别用破壁料理机处理为匀浆后作为生姜样品；
10.(2)利用顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪分别对腐烂生姜和新鲜生姜样品中挥
发性化合物进行检测和统计，得到腐烂生姜特征标志物的gc-ims指纹图谱；
11.(3)根据(2)中获得的腐烂生姜特征标志物的gc-ims指纹图谱对生姜腐烂程度进行鉴定。
12.上述的步骤(2)中，腐烂生姜特征标志物的gc-ims指纹图谱的获得是：利用顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪分别对腐烂生姜和正常生姜样品中挥发性化合物进行检测，先得到gc-ims样本数据，通过cc-ims自带lav分析软件及gc-ms工作站软件xcalibur自带的nist10标准库自动检索各组分质谱数据，对gc-ims样本数据进行统计分析后实现的。
13.上述的步骤(2)中，顶空进样的操作为：分别称取待测样置于20ml顶空瓶中，密封后在35～45℃、振摇速度为400～450rpm/min条件下孵育10～18min后，80～90℃顶空进样针取样500ul，注入气相离子迁移谱中。
14.优选的，(2)中，顶空进样的操作为：分别称取待测样置于20ml顶空瓶中，密封后在40℃、振摇速度为500rpm/min条件下孵育15min后，85℃顶空进样针取样500ul，注入气相离子迁移谱中。
15.本发明中采用顶空进样的操作，无需对样品进行复杂的前处理，能最大限度地反映样品的真实情况。
16.上述的步骤(2)中，所述的顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪，离子迁移谱的检测条件为：漂移管长度9～12cm；管内线性电压350～450v/cm；漂移管温度40～50℃；漂移气为高纯氮气，纯度≥99.999％；漂移气体流速120～180ml/min。
17.优选的，步骤(2)中，离子迁移谱的检测条件为：漂移管长度9.8cm；管内线性电压400v/cm；漂移管温度45℃；漂移气为高纯氮气，纯度≥99.999％；漂移气体流速150ml/min。
18.上述的步骤(2)中，所述的顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪，气相色谱的检测条件为：弱极性色谱柱fs-se-54-cb-1柱，该色谱柱对于胺类物质具有良好的检测效果，色谱柱的柱长为15m，内径0.53mm，粒径1μm；柱温55～65℃；分析时间30～50min；载气高纯氮气，纯度≥99.999％；柱流速初始为1～5ml/min，保持2min，2min-10min柱流速线性增加至8～15ml/min，10min-20min柱流速线性增加至80～120ml/min，20min-30min柱流速线性增加至140～180ml/min，保持15min。
19.优选的步骤(2)中，气相色谱的检测条件为：色谱柱fs-se-54-cb-1柱，柱长15m，内径0.53mm，粒径1μm；柱温60℃；分析时间45min；载气高纯氮气，纯度≥99.999％；柱流速初始为2ml/min，保持2min，2min-10min柱流速线性增加至10ml/min，10min-20min柱流速线性增加至100ml/min，20min-30min柱流速线性增加至150ml/min；保持15min。
20.上述的步骤(2)中，所述的腐烂生姜特征标志物包括：庚酸、乙酸、己酸、丙硫醇、异丁醛单体、异丁醛二聚体、三乙胺、3-戊酮、异戊醇、过氧化乙酰丙酮。
21.优选的，上述步骤(3)中通过对腐烂生姜和正常生姜样品的gc-ims指纹图谱特征标志物质进行比较，完成对生姜腐烂程度的鉴定。
22.或者，上述步骤(3)中基于gc-ims对正常生姜和腐烂生姜挥发性化合物主成分进行分析，绘制挥发性成分的主成分得分图，进一步根据组间距离确认生姜的腐烂程度，完成对生姜腐烂程度的鉴定。
23.此外，一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法在识别腐烂生姜的特征标志物中的应用，也是本发明所重点保护的范围。
24.此外，一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法在识别腐烂味生姜特征标志物质的应用，所述的特征标志物质为庚酸、乙酸、己酸、丙硫醇、异丁醛单体、异丁醛二聚体、三乙胺、3-戊酮、异戊醇、过氧化乙酰丙酮，这也是本发明所要保护的重点之一。
25.一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法在生姜贮藏过程中维持生姜风味品质中的应用，由于该方法有助于认识特征风味形成的实质，还可以为生姜贮藏风味品质保持提供科学数据支撑，因此也是本发明所重点保护的对象。
26.本发明有益效果在于：
27.(1)本发明基于gc-ims指纹图谱，明确了生姜“腐烂味”的关键物质基础和标志性化合物，根据新鲜生姜和腐烂生姜的区别特征标志物质，即生姜“腐烂味”的关键物质基础和标志性化合物对生姜的腐烂程度进行快速鉴别，为快速确定生姜腐烂程度提供了科学的依托；
28.(2)本发明对生姜样品处理时也不需要添加任何化学试剂，而是将生姜均浆后直接进样，方法简单、鉴定高效且分析成本低；并且，本发明采用顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪，可获得正常生姜和腐烂生姜指纹图谱，真实直观地反映正常生姜和腐烂生姜特征标志物差别；
29.(3)本发明在生姜腐烂程度的鉴定方法中引入了主成分分析法进行验证分析，使得鉴定结果准确性有多重保障，该方法有助于认识特征风味形成的实质，还可以为生姜贮藏风味品质保持、减耗和调控提供更多科学数据和技术支撑。
附图说明
30.图1为本发明的实施例1中正常生姜和腐烂生姜的gc-ims指纹图谱；
31.图2为本发明的实施例1中腐烂生姜的特征化合物gc-ims指纹图谱；
32.图3为本发明的实施例1中正常生姜和腐烂生姜中挥发性有机物gc-ims谱图的差异对比情况；
33.图4为本发明的实施例1中基于gc-ims正常生姜和腐烂生姜挥发性化合物pca分析。
具体实施方式
34.为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
35.实施例1
36.(一)试验材料的准备
37.试验用生姜为实验人员于2021年秋在莱芜一生姜种植基地采集的同一品种、同一规格的新鲜生姜2份，各10kg，窖藏于不同条件的冷藏库内，一份保存完好，一份呈现了明显的腐烂气味。
38.2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮等试剂均为分析纯，北京国药集团化学试剂有限公司。
39.(二)仪器与设备
40.电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；
41.ks-1053破壁料理机，广州市祁和电器有限公司；
42.flavour气相色谱-离子迁移谱联用仪配ctc pal rsi自动顶空进样器(gc-ims)德国g.a.s.mbh公司。
43.(三)实验过程
44.一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，包括如下步骤：
45.(1)各取5kg正常生姜和腐烂生姜，用破壁料理机处理为匀浆后作为生姜样品。
46.(2)利用顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪对腐烂生姜和正常生姜样品中挥发性化合物进行检测，得到gc-ims样本数据。
47.具体测定条件如下：分别称取待测样1.00g置于20ml顶空瓶中，密封后在40℃、振摇速度为500rpm/min条件下孵育15min后，85℃顶空进样针取样500ul，注入气相离子迁移谱中，每个样品重复3次。
48.gc条件：色谱柱fs-se-54-cb-1柱(15m
×
0.53mm
×
1μm)；柱温60℃；分析时间45min；载气高纯氮气(纯度≥99.999％)；柱流速初始为2ml/min，保持2min，2min-10min柱流速线性增加至10ml/min，10min-20min柱流速线性增加至100ml/min，20min-30min柱流速线性增加至150ml/min；保持15min。
49.ims条件：漂移管长度9.8cm；管内线性电压400v/cm；漂移管温度45℃；漂移气为高纯氮气(纯度≥99.999％)；漂移气体流速150ml/min。
50.采用cc-ims自带的lav分析软件及软件内置的nist数据库和ims数据库(gc
×
ims library search)人工检索各组分数据对gc-ims样本数据进行统计分析，得到腐烂生姜的特征标志物，包括庚酸、乙酸、己酸、丙硫醇、异丁醛单体、异丁醛二聚体、三乙胺、3-戊酮、异戊醇、过氧化乙酰丙酮的gc-ims指纹图谱。
51.(3)指纹图谱的分析
52.将步骤(2)获得正常生姜和腐烂生姜指纹图谱进行特征区域比较，具体见图1，比较其颜色深浅变化及峰体积大小。
53.其中，每一横行代表一个生姜中的全部信号峰，每一纵列代表同一挥发性物质在不同生姜中的信号峰，颜色越深表示峰强度越大，含量越高。
54.从图1中可以看出：图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰，从上到下依次为正常生姜样品及腐烂生姜样品的3个平行；图中每一列代表同一挥发性有机物在正常生姜和腐烂生姜样品中的信号峰。
55.图中a区域表示物质为正常生姜和腐烂生姜中均含有的物质，主要包括beta-蒎烯(单体、二倍体、三倍体)、月桂烯单体、罗勒烯、莰烯二聚体、己酸甲酯单体、5-甲基-2-庚烯-4-酮、顺式-3-辛烯-1-醇(单体、二聚体)等物质，主要呈现松脂香气及柑橘柠檬的香气。
56.图中b区域表示物质在由正常生姜变为腐烂生姜过程中化合物含量呈现下降趋势，主要包括左旋-beta-蒎烯、芳樟醇单体、莰烯单体、异戊酸乙酯、丁酸丙酯、四氢芳樟醇、萜品油烯、水芹烯(单体、二聚体)、左旋龙脑等物质，为正常生姜中的主要成分，呈现樟脑、薄荷、柠檬及果香味。c区域的化合物在腐烂生姜中含量极低，甚至完全消失，包括格蓬酯(单体、二聚体)、桃金娘烯醇、1-癸醇、(e,e)-2,4-壬二烯醛、异蒲勒醇(单体、二聚体)、芳樟
醇二聚体、氧化芳樟醇、二氢月桂烯醇、正辛醛(单体、二聚体)、月桂烯单体、2-己烯醛(单体、二聚体)等化合物，这些化合物使得正常生姜中的青草味、辛辣味、薄荷味、柠檬味、樟脑味等味道在生姜腐烂过程中逐渐消失，取而代之的为区域d中的化合物，其含量在腐烂生姜中逐渐增多，主要为酸类物质及醇类物质，如庚酸、乙酸、己酸等具有酸臭味的物质及具有可厌气味的丙硫醇，多为生姜腐烂过程中发酵产生；还有异丁醛(单体、二聚体)、三乙胺、3-戊酮、异戊醇、过氧化乙酰丙酮等呈强烈的氨臭味及刺激性气味的物质。
57.为了更清晰地比较正常生姜与腐烂生姜的gc-ims指纹图谱，现将图1中的d部分放大，作为图2。
58.从图2中可以看出，所示的共计21种化合物，其在腐烂生姜中的含量明显高于正常生姜中的含量，其来源可能是由于生姜腐烂在过程中发酵产生，因而可以作为腐烂生姜的特征标志物质。
59.应用软件内置的nist数据库和ims数据库(gc
×
ims library search)可对物质进行定性分析，并利用gallery plot插件，直观且定量地比较正常生姜和腐烂生姜挥发性有机物差异，收集挥发性组分气相保留时间、离子迁移时间，具体见表1。
60.表1腐烂生姜中特征化合物定性数据
[0061][0062]
说明书
[0063][0064]
根据表1中的部分数据进行分析，通过正常生姜和腐烂生姜中上述化合物的峰体积可以看出：腐烂生姜中上述20种化合物的峰体积相差较大，主要体现在庚酸、乙酸、己酸等具有酸臭味的物质在腐烂生姜中的峰体积明显大于正常生姜中的峰体积；且异丁醛(单体、二聚体)、三乙胺、3-戊酮、异戊醇、过氧化乙酰丙酮等呈强烈的氨臭味及刺激性气味的物质的峰体积也大幅增加。
[0065]
图3为正常生姜和腐烂生姜中挥发性有机物的gc-ims谱图的差异对比。从图中可以看出，正常生姜和腐烂生姜中的挥发性有机物存在显著差异。
[0066]
为了更加明显地对比这种差异，可采用差异对比模式：选取正常生姜样品的谱图作为参比，腐烂生姜的谱图扣减参比，如果二者挥发性有机物一致，则扣减后的背景为白色，而红色代表该物质的浓度高于参比，蓝色代表该物质的浓度低于参比。
[0067]
由图可知：腐烂生姜中损失了正常生姜中呈现辛辣味和柠檬味等正常生姜的典型化合物，同时产生了具有刺激性和腐败性气味的腐烂生姜特征性化合物，如庚酸、乙酸、己酸、丙硫醇、异丁醛单体、异丁醛二聚体、三乙胺、3-戊酮、异戊醇、过氧化乙酰丙酮等。
[0068]
(4)主成分分析法对生姜腐烂程度鉴定。
[0069]
基于gc-ims分析正常生姜和腐烂生姜挥发性成分主成分分析(pcr)；对全部特征区域的物质出峰数据进行正交变换和降维，实现对生姜样品进行快速聚类。
[0070]
图4为正常生姜和腐烂生姜挥发性成分的pca得分图。
[0071]
表2为腐烂生姜中特征化合物前两个主成分因子的载荷矩阵图。
[0072]
表2腐烂生姜中特征化合物主成分因子载荷矩阵
[0073][0074]
从图4中可以看出正常生姜和腐烂生姜，组间相距较远，说明正常生姜和腐烂生姜中挥发性香气化合物之间差异明显。
[0075]
一般而言，正常生姜和腐烂生姜前两主成分累计贡献率大于75％，即可根据正常生姜和腐烂生姜的挥发性香气成分可实现正常生姜和腐烂生姜样品的区分，本发明图4中显示，正常生姜和腐烂生姜前两主成分累计贡献率为95％，薄荷酮-单体、2-乙基-3-甲基吡嗪、6-甲基-5-庚烯-2-酮、cis-4-庚烯醇、过氧化乙酰丙酮-单体、薄荷酮-二聚体、己酸、3-戊酮-单体在第一主成分上作用突出；庚酸乙酯、异丁醛-单体、异丁醛、异戊醇、3-戊酮-二聚体、乙酸甲酯、醋酸、三乙胺、庚酸、3-甲基-2-丁烯醛在第二主成分上具有突出贡献，说明这两个主成分基本可完全反映正常生姜和腐烂生姜样品组别间的所有特征，完全能够达到生姜贮存过程腐烂预警的目的，并可对市面上流通的生姜样品的品质进行检测。

技术特征：
1.一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：（1）将腐烂生姜和正常生姜分别用破壁料理机处理为匀浆后作为生姜样品；（2）利用顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪分别对腐烂生姜和正常生姜样品中挥发性化合物进行检测与统计，得到腐烂生姜特征标志物的gc-ims指纹图谱；（3）根据（2）中获得的腐烂生姜特征标志物的gc-ims指纹图谱对生姜腐烂程度进行鉴定。2.如权利要求1所述的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，在其特征在于，（2）中，利用顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪分别对腐烂生姜和新鲜生姜样品中挥发性化合物进行检测，先得到gc-ims样本数据，通过cc-ims自带lav分析软件及gc-ms工作站软件xcalibur自带的nist10标准库自动检索各组分质谱数据，对gc-ims样本数据进行统计分析，来获得到腐烂生姜特征标志物的gc-ims指纹图谱。3.如权利要求1所述的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，在其特征在于，（2）中，顶空进样的操作为：分别称取待测样置于20 ml顶空瓶中，密封后在35~45℃、振摇速度为400~450 rpm/min条件下孵育10~18 min后，80~90℃顶空进样针取样500ul，注入气相离子迁移谱中。4.如权利要求1所述的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，在其特征在于，（2）中所述的顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪，离子迁移谱的检测条件为：漂移管长度9~12 cm；管内线性电压350~450 v/cm；漂移管温度40~50℃；漂移气为高纯氮气，纯度≥99.999%；漂移气体流速120~180 ml/min。5.如权利要求1所述的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，其特征在于，（2）中所述的顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪，气相色谱的检测条件为：色谱柱fs-se-54-cb-1柱，柱长15 m，内径0.53 mm，粒径1
µ
m；柱温55~65℃；分析时间30~50 min；载气高纯氮气，纯度≥99.999%；柱流速初始为1~5 ml/min，保持2 min，2 min-10min柱流速线性增加至8~15 ml/min，10 min-20min柱流速线性增加至80~120 ml/min，20 min-30min柱流速线性增加至140~180 ml/min，保持15min。6.如权利要求1所述的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，其特征在于，（2）中所述的腐烂生姜特征标志物包括：庚酸、乙酸、己酸、丙硫醇、异丁醛单体、异丁醛二聚体、三乙胺、3-戊酮、异戊醇、过氧化乙酰丙酮。7.如权利要求1所述的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，其特征在于，（3）中通过对腐烂生姜和正常生姜样品的gc-ims指纹图谱特征标志物质进行比较，完成对生姜腐烂程度的鉴定。8.如权利要求1所述的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法，其特征在于，（3）中基于gc-ims对正常生姜和腐烂生姜挥发性化合物主成分进行分析，绘制挥发性成分的主成分得分图，进一步根据组间距离确认生姜的腐烂程度，完成对生姜腐烂程度的鉴定。9.如权利要求1所述的一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法在识别腐烂生姜的特征标志物中的应用。10.如权利要求1所述一种基于特征标志物质gc-ims指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度
的方法在生姜贮藏过程中维持生姜风味品质中的应用。

技术总结
本发明属于气味物质分析检测技术领域，具体涉及一种基于特征标志物质GC-IMS指纹图谱快速鉴定生姜腐烂程度的方法。该方法是利用顶空气相色谱-离子迁移谱联用仪对腐烂生姜和正常生姜样品中挥发性化合物进行检测，得到GC-IMS样本数据；采用CC-IMS自带LAV分析软件及GC-MS工作站软件Xcalibur自带的NIST10标准库自动检索各组分质谱数据对GC-IMS样本数据进行统计分析，得到腐烂生姜的特征标志物，包括庚酸、乙酸、己酸、丙硫醇、异丁醛单体、异丁醛二聚体、三乙胺、3-戊酮、异戊醇、过氧化乙酰丙酮等的GC-IMS指纹图谱，来对生姜腐烂程度进行鉴定。定。定。


技术研发人员：闫新焕 谭梦男 潘少香 宋烨 刘雪梅 郑晓冬 杜文瑜 古思梦 曹宁 王承秀 曹天雪
受保护的技术使用者：中华全国供销合作总社济南果品研究所
技术研发日：2023.06.06
技术公布日：2023/10/15