检测药物基因组学相关基因CYP2D6多态性的建库试剂盒及其应用的制作方法

检测药物基因组学相关基因cyp2d6多态性的建库试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因cyp2d6多态性的建库试剂盒及其应用。


背景技术：

2.近年来随着精准医疗的逐步推广,药物基因组学(pharmacogenomics,pgx)作为实现个体化给药的有力手段得到了迅猛发展。药物基因组学是基于药物反应的遗传多态性提出来的,遗传多态性是药物基因组学的基础。药物遗传多态性表现为药物代谢酶的多态性、药物受体的多态性和药物靶标的多态性等。这些多态性的存在可能导致许多药物治疗中药效和不良反应的个体差异。药物基因组学从基因水平揭示这些差异的遗传特征，鉴别基因序列中的差异,在基因水平研究药效的差异,并以药物效应及安全性为目标,研究各种基因突变与药效及安全性之间的关系。
3.药物代谢体内过程的第1相需有药物代谢酶的催化，其中最主要的代谢酶是细胞色素p450(cyp)酶系。cyp2d6(cytochrome p450family 2subfamily d member 6)是cyp450酶系中最先被发现的受单基因控制的酶。不同个体的cyp2d6活性存在很大的差异，从无代谢活性、低活性、正常活性到高活性。cyp2d6基因型的等位基因变异及亚变异型已超过100种，且新的等位基因仍在不断被发现。最常见的cyp2d6等位基因及其活性如表1：
4.表1 cyp2d6等位基因及其活性
[0005][0006][0007]
基于上述等位基因及其活性，我们可以预测4种「传统」的活性表型，即慢代谢、中间代谢、快代谢及超快代谢。一些实验室将cyp2d6的活性细分为7类，如表2：
[0008]
表2 cyp2d6表型及其定义
[0009][0010]
传统的基因突变检测方法,如sanger测序、基因芯片杂交和实时荧光pcr等仅能对基因的部分序列或特定snp位点进行检测,对复杂变异类型的检测存在局限性。
[0011]
本专利设计一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因cyp2d6多态性建库试剂盒。仅需微量基因组dna,通过酶切打断、加接头构建好文库,然后再利用自主设计cyp2d6全基因组探针对文库进行杂交捕获和富集,即可快速完成靶向文库构建。通过可逆末端测序法进行测序,实现对可能影响药物和化合物代谢的cyp2d6基因进行快速精准分型。一次检测就可以快速获得cyp2d6的基因型与代谢药物能力,同时本试剂盒操作简便,极易实现自动化检测,特别适用于大样本量相关研究,对于发现新的基因型也有很大意义。


技术实现要素：

[0012]
本发明描述了一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因cyp2d6多态性建库试剂盒,以低起始量的基因组dna为模板通过酶切反应打断、末端修复和加a尾、磁珠纯化、加特定index扩增后纯化即可完成文库构建；然后再通过浓缩混合不同样本后使用个性化定制cyp2d6全基因组探针对文库进行杂交孵育过夜，最后再通过链霉素磁珠对杂交产物进行捕获和富集、扩增纯化后得到最终的靶向文库定量后即可进行高通量测序。待测序数据下机后,通过试剂盒配套的生物信息学分析软件进行比分析，即可快速完成对cyp2d6基因的精准分型，避免脱靶。
[0013]
本发明提供一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因cyp2d6多态性的建库试剂盒，所述试剂盒包括碱基序列seq id no 1-no 36中的至少20种；优选包括至少24种；更优选包括至少28种；特别优选包括至少32种；最优选包括全部36种。
[0014]
[0015][0016][0017]
本发明另一方面还涉及上述建库试剂盒检测药物基因组学相关基因cyp2d6多态性。
[0018]
本发明另一方面还涉及上述建库试剂盒在确定患者服用阿立哌唑、丁苯那嗪、氟
哌啶醇、他莫昔芬、美托洛尔和/或甲氧氯普胺等药物治疗的起始剂量中的应用。
[0019]
与现有技术相比,本发明技术方案具有如下优点:
[0020]
本发明制造出的建库试剂盒,可利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因cyp2d6全基因组序列；仅需少量量基因组dna用于构建dna文库,模板起始量可低至150ng；利用自主设计cyp2d6全基因组探针对文库进行杂交捕获和富集,效率高；本试剂盒index多达24对，可实现24个文库同时构建和一起上机测序；通过简单易用的边合成边ngs测序解决方案,实现对可能影响药物和化合物代谢的cyp2d6基因进行快速精准分型；一次检测就可以快速获得cyp2d6的基因型与代谢药物能力,同时本试剂盒操作简便。在患者服用阿立哌唑、丁苯那嗪、氟哌啶醇、他莫昔芬、美托洛尔、甲氧氯普胺等药物治疗的起始剂量中具有良好的临床应用前景,也可对健康人群提供风险评估,有效规避潜在用药的不当风险，便于临床的推广。
附图说明
[0021]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0022]
图1为实施例1中5个样本的电泳结果。
具体实施方式
[0023]
实施例1
[0024]
1.1样本准备
[0025]
5名志愿者，提取血清dna样本，每个dna样本取300ng左右。
[0026]
1.2片段化反应
[0027]
表1片段化反应体系
[0028]
10x fea reaction buffer2.5μl5x fea enzyme mix5μlfea enhancer1.25μl样本dna300ng(不超过16.25μl)nf-h2o补足至25μltotal25μl
[0029]
片段化反应体系见表1。配制好反应体系后，混匀离心后，进行片段化反应，热盖设置85℃，反应程序见表2。
[0030]
表2片段化反应程序
[0031]
4℃1min32℃20min65℃30min
[0032]
(此步骤后需提前将vahts dna clean beads取出，室温平衡30min；配制2％琼脂糖凝胶和80％乙醇)
[0033]
1.3接头连接反应
[0034]
将上一步反应管离心后放在冰盒上，加入2.7μl ts-adt(15μm)，混匀离心后，放回
冰盒上；根据表3配制mix。
[0035]
表3 mix配制表
[0036]
buffer1-new7μlbuffer2-new23μlnf-h2o20.8μlenzyme21.5μl
[0037]
向上一步反应管中加入52.3μl mix后，混匀离心后，进行接头连接反应；反应无需热盖，反应体积80μl，反应程序见表4。
[0038]
表4接头连接反应程序
[0039]
20℃15min4℃∞
[0040]
1.4连接产物纯化
[0041]
1)vahts dna clean beads室温平衡30min后，充分混匀，根据样本数量准备1.5ml离心管，写号并复核，每管分装80μl。
[0042]
2)将上一步反应体系(约80μl)离心后对应样本编号转移至1.5ml离心管中，涡旋混匀，室温静置5min。
[0043]
3)瞬时离心，置于磁力架上，轻轻左右旋转离心管，使磁珠聚集，待溶液澄清后，弃上清液。
[0044]
4)加入200μl 80％乙醇(新鲜配制)，注意不要冲起磁珠，使磁珠完全浸于溶液中，约30s后，弃上清液。
[0045]
5)重复步骤4)一次，用10μl移液器尽量将上清液弃干净，打开管盖室温晾干5min。
[0046]
6)待磁珠干燥，即磁珠表面无明显反光后，加入22μl nf-h2o，涡旋混匀，室温静置5min。
[0047]
7)瞬时离心，置于磁力架上，待溶液澄清后，室温待用。
[0048]
1.5文库扩增
[0049]
表5文库扩增反应体系
[0050]
hifi hotstart readymix25μlts-primer1n(10μm)2.5μlindex(10μm)2.5μl上一步纯化产物上清液20μltotal50μl
[0051]
根据表5配制反应体系，混匀离心后，放在冰盒上，准备进行文库扩增反应，反应程序见表6。(此步骤后需提前将vahts dna clean beads取出，室温平衡30min)
[0052]
表6文库扩增反应程序
[0053][0054][0055]
1.6文库质检
[0056]
取5μl上一步扩增产物跑2％琼脂糖凝胶电泳，观察条带平均大小应在300bp左右。
[0057]
1.7文库纯化
[0058]
1)vahts dna clean beads室温平衡30min后，充分混匀，根据样本数量准备2套1.5ml离心管，写号并复核，其中1套每管分装54μl vahts dna clean beads(此步中磁珠体积为剩余反应体系的1.2倍，若跑胶过程有损失，需重新计算磁珠体积)。
[0059]
2)将上一步剩余扩增产物(约45μl)对应样本编号转移至有磁珠的1.5ml离心管中，涡旋混匀，室温静置5min(此时体系较为粘稠，需较长时间才能澄清)。
[0060]
3)瞬时离心，置于磁力架上，轻轻左右旋转离心管，使磁珠聚集，待溶液澄清后，弃上清液。
[0061]
4)加入200μl 80％乙醇(新鲜配制)，注意不要冲起磁珠，使磁珠完全浸于溶液中，约30s后，弃上清液。
[0062]
5)重复步骤4)一次，用10μl移液器尽量将上清液弃干净，打开管盖室温晾干3min。
[0063]
6)待磁珠干燥，即磁珠表面无明显反光后，加入25μlnf-h2o，涡旋混匀，室温静置5min。
[0064]
7)瞬时离心，置于磁力架上，待溶液澄清后，对应样本编号取24μl上清液至新的一套1.5ml离心管中，注意不要吸到磁珠，管盖上需写全样本编号和实验日期。
[0065]
8)纯化后的文库可暂存于4℃；若24h内不使用，则存放于-20℃。
[0066]
1.8文库定量
[0067]
取1μl纯化后的文库用qubit测定dsdna浓度并记录。
[0068]
2杂交
[0069]
2.1预文库混合
[0070]
混合杂交文库数量最多为24个，每个文库的标准投入量为250ng；
[0071]
根据qubit定量结果进行计算并在1.5ml离心管中进行预文库混合后，混匀离心待用。(此步骤可将杂交试剂提前取出，置于4℃解冻)；
[0072]
2.2杂交体系配制
[0073]
表7杂交block配制
[0074]
human cot dna5μlnadprep nanoblockers(for illumina)2μl
adapter blocker7μl
[0075]
如果有多个pool，可以配制mix。
[0076]
将配制好的杂交block混匀离心，每个pool加入7ul。混匀离心后，将杂交体系置于真空浓缩仪中，浓缩至刚好无液体，室温待用。
[0077]
2.3杂交试剂准备
[0078]
将提前取出解冻的nadprep hybrid capture reagents中的杂交试剂hyb#1和hyb#2混匀离心。
[0079]
2.4准备杂交探针
[0080]
将分装好的探针(4μl/支)从-20℃取出，置于冰上解冻，瞬时离心，冰上备用。然后按照表8配置杂交反应混合液(其余试剂加入探针管中)，使移液器将杂交反应液吹打均匀。
[0081]
表8杂交block配制
[0082]
hyb#18.5μlhyb#22.7μlnf-h2o1.8μlcyp2d6 panel探针4μltotal [0083]
2.5杂交
[0084]
使用移液器将混合均匀后的杂交反应液加入到已经真空浓缩干燥的文库1.5ml离心管底部，使用移液器轻柔吹打混匀15-20次，瞬时离心，室温孵育10min。
[0085]
再次涡旋混匀，瞬时离心，将离心管中的全部杂交反应混合液(约17ul)转移至1套新的0.2mlpcr管中，并复核管号，瞬时离心备用，启动如下表9杂交程序。
[0086]
表9杂交程序
[0087][0088]
将pcr管置于pcr仪中，确认管盖盖紧，盖上pcr仪盖，运行表9程序，65℃杂交过夜(约16-18h)
[0089]
3捕获
[0090]
3.1捕获试剂准备
[0091]
(开始实验之前，提前将cap beads取出室温平衡30min)
[0092]
取出nadprep hybrid capture reagents室温自然解冻，涡旋混合均匀。链霉素亲和磁珠涡旋混合均匀，室温平衡30min。
[0093]
1份105ul wash buffer 1；2份155ul wash buffer 2。
[0094]
分装好后置于pcr仪，开启洗脱程序，见下表10，65℃孵育1h(至少孵育15min)后弃上清；将pcr
[0095]
表10洗脱程序
[0096][0097]
磁珠悬浮液配制见表11。
[0098]
表11磁珠悬浮液配制表
[0099]
hyb#18.5μlhyb#22.7μlnf-h2o5.8μltotal [0100]
3.1.1捕获磁珠清洗
[0101]
1)将链霉素亲和磁珠涡旋混匀15s，确保完全混匀。吸取50ul磁珠至1.5ml低吸离心管中。
[0102]
2)向离心管中加入100ul bead wash buffer，轻柔吹吸混匀10次，瞬时离心，置于磁力上，待液体完全澄清后，弃上清。
[0103]
3)重复2)两次。
[0104]
4)向离心管中加入17μl配制好的磁珠悬浮液，轻柔吹吸混匀，将全部磁珠悬浮液转移至0.2mlpcr管中，置于pcr仪洗脱程序65℃孵育5min。
[0105]
3.2磁珠捕获
[0106]
将杂交管从杂交程序转移到洗脱程序，迅速吹打混匀捕获磁珠，全部加入到杂交体系中，并使用移液器轻轻吹打混匀，将杂交管保持在洗脱程序孵育45min。
[0107]
65c孵育时，每10-12min从pcr仪中取出杂交管涡旋混匀一次，确保磁珠完全悬浮迅速放回洗脱程序中(取出混匀到放回pcr仪中，该过程不超过5s)。
[0108]
3.3热洗脱
[0109]
1)孵育结束后交管中加入100μl65℃wash buffer1，吸吹混匀含有磁珠的杂交体系。
[0110]
2)pcr管置于磁力板上，待液体完全请后(5-10s就会澄清，不能等待过长时间)，弃上清；将pcr管从磁力板上拿起，逃速加入150μl 65℃wash buffer 2，轻柔吹吸10次混合均匀,放进pcr仪中，65℃孵育5min。
[0111]
3)重复上述步骤2)一次。
[0112]
3.4室温洗脱
[0113]
1)将pcr管瞬时离心后置于磁力板上，待液体完全澄清后，弃上清；加入150ul室温washbuffer1，涡旋混匀，室温孵育2min，期间涡旋混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀。
[0114]
2)将pcr管瞬时离心后置于磁力板上，待液体完全澄清后，弃上清，加入150ul室温washbuffer3，涡旋混匀，室温孵育2min，期间涡旋混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分混匀。
[0115]
3)将pcr管瞬时离心后置于磁力板上，待液体完全澄清后，弃上清，加入150ul室温washbuffer4，涡旋混匀，室温孵育2min，期间涡旋混匀30s后静置30s，交替进行，确保充分
混匀。
[0116]
4)将pcr管瞬时离心后置于磁力板上，待液体完全澄清后，弃上清，之后换10ul移液器去除少量残余buffer。
[0117]
5)将pcr管从磁力板上取下，加入23ulnf-h20，使用移液器吹打，重悬磁珠，确保混合均匀。
[0118]
4post-pcr及终文库纯化
[0119]
4.1post-pcr
[0120]
按表12配制终文库扩增反应体系。
[0121]
表12 post-pcr反应体系
[0122]
hifi hotstart readymix25μlp5+p7(25μm)2μl捕获样本与磁珠混合液(加入前充分混匀)23μltotal50μl
[0123]
反应程序见表13，在pcr仪上进行扩增反应。(此步后需提前将vahts dna clean beads取出，室温平衡30min；配制2％琼脂糖凝胶和80％乙醇)
[0124]
取出，室温平衡30min；配制2％琼脂糖凝胶和80％乙醇)
[0125]
表13 post-pcr反应程序
[0126][0127]
总量为6ug时，按表格跑15个循环:如总量小于6ug，可适当增加1-2个循环。(待终文库质检结束后，判断文库浓度是否低于3ng/ul，再进行加循环操作)
[0128]
4.2终文库质检
[0129]
取5μl上一步扩增产物上清液跑2％琼脂糖凝胶电泳，观察条带平均大小是否在300bp左右。
[0130]
4.3终文库纯化
[0131]
1)vahts dna clean beads室温平衡30min后，充分混匀，根据pool数量准备1.5ml离心管，写号并复核，每管分装54μlvahts dna clean beads。
[0132]
2)将post-pcr产物置于96孔磁力板上，澄清后将上清液(约45μl)转移至磁珠中，涡旋混匀，室温静置5min。
[0133]
3)瞬时离心，置于磁力架上，轻轻左右旋转离心管，使磁珠聚集，待溶液澄清后，弃
上清液。
[0134]
4)加入200μl 80％乙醇(新鲜配制)，注意不要冲起磁珠，使磁珠完全浸于溶液中，约30s后，弃上清液。
[0135]
5)重复步骤4)一次，用10μl移液器尽量将上清液弃干净，室温晾干5min。
[0136]
6)待磁珠干燥，即磁珠表面无明显反光后，加入25μl db，涡旋混匀，室温静置5min。
[0137]
7)瞬时离心，置于磁力架上，待溶液澄清后，对应pool名称将上清液转移至另1套1.5ml离心管中，注意不要吸到磁珠，管盖上需写pool编号和实验日期。
[0138]
8)纯化后的终文库可暂存于4℃；若24h内不使用，则存放于-20℃。
[0139]
4.4终文库定量
[0140]
取1μl纯化后的终文库用qubit测定dsdna浓度并记录，5名志愿者样本的检测结果如下表所示。
[0141][0142][0143]
从检测结果可以看出，本发明所述试剂盒能够检测出cyp2d6基因多态性，可以准确地对cyp2d6基因进行精准的分析。
[0144]
实施例2：临床样本检测
[0145]
目前我们已经收集了31个健康志愿者的血液样本提取基因组dna后构建文库进行检测，这31个健康志愿者由20个女性志愿者与11个男性志愿者组成，年龄范围在20-50之间，分2批进行检测。第一批为20个志愿者，检测时间为2021年11月；第二批为11个志愿者，检测时间为2023年3月。根据已检测的31个临床样本的结果统计，脱靶率为0％。本发明所述cyp2d6全基因杂交捕获探针可以准确捕获到cyp2d6基因，根据已检测的31个临床样本的结果统计，脱靶率为0％。对于常规样本的检测表明本发明所述探针和方法及试剂盒能够检测出cyp2d6基因多态性。
[0146]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

技术特征：
1.一种建库试剂盒，所述试剂盒包括碱基序列seq id no 1-no 36的引物中的至少20种。2.根据权利要求1所述的建库试剂盒，所述试剂盒包括碱基序列seq id no 1-no 36的引物中的至少24种。3.根据权利要求1所述的建库试剂盒，所述试剂盒包括碱基序列seq id no 1-no 36的引物中的至少28种。4.根据权利要求1所述的建库试剂盒，所述试剂盒包括碱基序列seq id no 1-no 36的引物中的至少32种。5.根据权利要求1所述的建库试剂盒，所述试剂盒包括碱基序列seq id no 1-no 36的引物中全部36种。6.权利要求1-5任意一项所述的建库试剂盒检测药物基因组学相关基因cyp2d6多态性。7.权利要求1-5任意一项所述的建库试剂盒在确定患者服用阿立哌唑、丁苯那嗪、氟哌啶醇、他莫昔芬、美托洛尔和/或甲氧氯普胺治疗的起始剂量中的应用。

技术总结
本发明公开了一种利用杂交捕获法检测药物基因组学相关基因CYP2D6的建库试剂盒及其应用，所述试剂盒包括碱基序列SEQID NO1-NO36的引物中的至少20种。本发明的试剂盒一次检测就可以快速获得CYP2D6的基因序列，通过序列比对分型获得CYP2D6基因代谢药物能力分型，不仅可以对患病人群提供精准用药,从计量、药效、不良反应等多方面给予个性化用药提醒,改善患者疗效并减少或避免药物副作用；还可以对健康人群提供风险评估,有效规避潜在用药的不当风险；同时使用的二代测序技术通量大，通过特别适用于大样本量相关研究,对于发现新的基因型也有很大意义。也有很大意义。也有很大意义。


技术研发人员：刘聪
受保护的技术使用者：湖南基因脸谱健康科技有限公司
技术研发日：2023.06.26
技术公布日：2023/10/15