一种靶向性DNA纳米载体的构建及其在精准肿瘤基因治疗中的应用

一种靶向性dna纳米载体的构建及其在精准肿瘤基因治疗中的应用
技术领域
1.本发明属于核酸纳米材料技术领域，具体涉及一种靶向性dna纳米载体的构建及其在精准肿瘤基因治疗中的应用。


背景技术：

2.rna干扰(rnai)被认为对治疗难治性疾病非常有用，如炎症和癌症。作为传统癌症治疗方法的替代，比如手术切除、化疗和放射治疗，rnai通过特异性抑制转录后癌症相关基因产物的表达水平，可以达到理想的抗癌效果。通过设计相应的干扰rna(sirna)序列以引导risc在细胞质中产生同源mrna，可以实现感兴趣的靶基因的沉默。然而sirna在血流中易受酶降解的影响，短暂的血浆消除半衰期大大降低了sirna穿透复杂生物屏障进入癌细胞并引导靶标mrna切割的可能。缺乏安全有效的sirna传递载体是基于sirna的治疗方法向临床应用过渡的一大障碍。因此，已有不少研究在构建靶向递送sirna药物的纳米载体上做出贡献。迄今为止，sirna递送载体主要分为两类：病毒载体和非病毒载体。高细胞转染效率是病毒载体的显著优势，但其免疫原性和致突变性严重限制了其应用。与病毒载体相比，非病毒载体更为安全，更适合在体内递送sirna。但是，非病毒载体面临着转染效率低的缺点。
3.在过去的几十年里，已有不少非病毒载体被开发，包括脂质、树枝状聚合物和无机纳米颗粒等。这些递送载体提高了sirna的装载效率，延长了系统循环时间，并增强了肿瘤的浸润和积聚。例如，美国食品药品监督管理局批准的第一种用于治疗多发性神经病的sirna药物onpattro(patisiran)，采用的是阳离子脂质递送系统。然而，由于递送效率和安全性问题，构建可靠的sirna载体仍然是一个重大挑战。最常用的非病毒载体(如脂质体)主要依靠阳离子聚合物成分来压缩sirna以此促进细胞内sirna的递送。但是，高阳离子电荷可能会对正常组织造成严重的毒副作用，并加速血液中载体的清除，导致基因药物递送效率不足。因此，设计出一种无毒、生物相容性好、具备精确肿瘤靶向性的可用于基因治疗的创新型非阳离子sirna递送系统十分必要。
4.由于dna纳米结构具有独特的性质，例如：良好的生物相容性、结构可预测性、可编辑功能性和便捷的编程性，它们在构建非阳离子sirna载体方面显示出巨大潜力。近来，多种用于sirna递送的多功能dna纳米载体被开发出。例如，sirna复合物、dna四面体、球形核酸和dna水凝胶。与阳离子纳米载体不同，这些带负电荷的dna组装纳米载体可以通过共价偶联或非共价表面结合的方式来执行肿瘤靶向递送，而非利用静电相互作用。特别是，多价球形核酸纳米粒子由于其与细胞表面清除剂受体的高结合亲和力而表现出优异的细胞摄取能力。然而，先前报道的纳米材料递送sirna通常受到繁琐的制备步骤、体内降解抵抗力差以及缺乏特定刺激诱导的货物释放机制的限制。例如，基于dna折纸的纳米载体需要数百个精心设计的dna链组分，这大大增加了实验成本并使设计过程复杂化。因此，开发出一种仅由少数dna链组装的纳米载体十分必要。由于回文寡核苷酸具有相同碱基序列的回文片段可以相互杂交的独特性质，是减少dna成分数量以构建纳米载体的理想候选者。此外，由
于源自回文片段的引入的构建块的高局部浓度，组装效率可以显著提高。
5.基于上述原因，本发明首先验证了通过仅由一个回文dna组分组装的3d结构单元来构建分级球形dna纳米结构(sops3)的可行性，紧接着通过引入靶向配体和带粘性末端的尾巴，开发了一种抗降解的靶向性dna纳米载体(apt-ctps3)，该靶向性dna纳米载体可包裹1987份含有二硫键的基因药物siplk1，负载的基因药物siplk1在靶向dna纳米载体的帮助下，可以特异性转运到细胞质，并在内源性谷胱甘肽(gsh)还原时100％释放，而且该gsh刺激响应的装载sirna药物的靶向dna纳米载体可以通过在细胞水平下调靶plk1 mrna和对应蛋白的表达水平实现高效的基因治疗，并在荷瘤裸鼠模型中显著抑制肿瘤生长，为精准肿瘤基因治疗提供了一个有前景的纳米平台。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对上述问题，提供一种靶向dna纳米载体的构建方法及其在精准肿瘤基因治疗中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种靶向性dna纳米载体的构建方法，其是将回文dna序列与多功能dna序列加入至1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃条件下加热5min后自然冷却至室温，并在室温条件下继续反应1h，得到靶向性dna纳米载体；其中，所述回文dna序列为：5
’‑
ctctgagctcagaggtgtctcgagacacaagaggatcctctt-3’，所述多功能dna序列为：5
’‑
ccttgtgaagtgttttttttctctgagctcagaggtgtctcgagacacaagaggatcct cttttttttttgcagttgatcctttggataccctgg-3’；其中，所述回文dna序列与多功能dna序列的摩尔比为1：1；其中，所述1
×
tae/mg
2+
缓冲液配方为：40mm tris，20mm乙酸，2mm edta和12.5mm mgac2·
4h2o；ph＝7.4。
8.一种由上述构建方法得到的靶向性dna纳米载体。
9.上述一种靶向性dna纳米载体在制备用于肿瘤基因治疗的载药组合物中的应用。
10.一种载药组合物，其包括上述的靶向性dna纳米载体以及被载药物；其中，所述被载药物为sirna药物。
11.本发明的技术原理如下：如图1a所示，将回文片段引入dna序列的中间可以得到通过分子间杂交形成作为结构单元的dna双链体(双链b结构域，平面图中的ds-b)。为了实现dna结构的分级组装介导的生长，设计了四个指向四个方向的粘性末端(单链片段)相互杂交。同时，为了最大限度地减少dna组分的数量，将粘性末端配对以具有相同的碱基序列(即回文序列)，获得两个单链a(ss-a)结构域和两个单链c(ss-c)结构域。由于ds-b结构域的结构刚性介导的空间距离，在一个结构单元内的两个相同的回文粘性末端之间没有相互作用(称为无单元内相互作用)。理论上，通过调节ds-b结构域在纵向上的碱基对(bp)数量，可以将粘性末端准确地排列在该结构单元中，因为添加每个bp后，螺旋上升约0.34nm，扭曲角增加约34.3
°
。在这项研
究中，ds-b结构域被设计为具有14个碱基对以形成稳定的ds片段，并且相同的回文粘性末端在轴平面上交错120
°
。沿着这条线，结构单元可以以高度有组织的方式在不同的轴向平面上自组装，产生仅由一种回文dna组分制成的3d球形dna纳米结构(称为sops3)。与ds-b域类似，ss-a和ss-c也被设计为具有14个碱基对。在sops3的组装过程中，只涉及一个退火步骤。在此基础上，通过分别在回文dna组分的3’端和5’端添加适体muc1和粘性尾部来功能化回文dna组分。另外，引入两个含有poly-t序列(8nt)的间隔物来分离相邻区域，以确保功能结构域的灵活性和可及性，从而获得多功能dna序列。回文dna序列与多功能dna序列共同作用得到靶向性dna纳米载体，修饰有二硫键的基因药物sirna通过与多功能dna序列上的粘性尾部结合，得到负载药物的靶向dna纳米载体。利用muc1适体能很好地选择性识别并结合肿瘤细胞上高表达的糖蛋白粘蛋白1的特性，dna纳米载体可以特异性识别肿瘤细胞，进入细胞质后，在gsh的刺激下，释放药物sirna，抑制目标mrna与相关蛋白的表达，实现基因沉默，最终达到精准肿瘤基因治疗的作用。本发明所提供的一种靶向性dna纳米载体具有以下几个优点：(1)该靶向性dna纳米载体具有良好的抗降解稳定性。
12.(2)该靶向性dna纳米载体具有高特异性，能区分癌变细胞与健康细胞。
13.(3)该靶向性dna纳米载体载药方式便捷。
14.(4)该靶向性dna纳米载体可用于精准肿瘤基因治疗。
附图说明
15.图1：构建球形dna纳米结构的设计示意图。(a)球形dna纳米结构的组装过程以及3d结构单元的两种不同视图。(b)回文dna序列中三个回文片段的示意图，以及对应的热力学数据。
16.图2：构建靶向性dna纳米载体对应两组分(多功能dna组分与回文dna组分)的设计示意图。其中，多功能dna组分由三个功能区组成，包括单链尾部区、回文区和适体区。回文dna组分仅包含一个回文区，回文区由三个不同的回文片段(a、b和c)组成。
17.图3：球形dna纳米结构(sops3)、靶向性dna纳米载体(apt-ctps3)以及载药靶向dna纳米载体(apt-ctps3-siplk1)的原子力显微镜成像。其中，比例尺为100nm。
18.图4：载药靶向dna纳米载体的肿瘤细胞特异性靶向能力分析。图中第一列是细胞核染料hoechst通道图(405nm)；第二列是标记fam荧光基团的药物sirna通道图(488nm)；第三列是标记cy5荧光基团的靶向dna纳米载体通道图(638nm)，第四列是叠加图。
19.图5：载药靶向dna纳米载体对fbs降解的抗性。
20.图6：载药靶向dna纳米载体癌细胞内沉默靶基因能力分析。(a)实时荧光定量评估用不同装载药物siplk1的纳米材料处理的mcf-7细胞中plk1 mrna的表达水平。(b)蛋白免疫印迹分析评估用不同装载药物siplk1的纳米材料处理的mcf-7细胞中plk1蛋白的表达水平。
具体实施方式
21.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明
所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
22.下述实施例中所涉及的dna、sirna、引物序列如下：回文dna序列：5
’‑
ctctgagctcagaggtgtctcgagacacaagaggatcctctt-3’；多功能dna序列：5
’‑
ccttgtgaagtgttttttttctctgagctcagaggtgtctcgagacacaagaggatcctcttttttttttgcagttgatcctttggataccctgg-3’；siplk1-sense：5
’‑
uaaggagggugaucuucuucadtdt-3’，siplk1 antisense-linker：5
’‑
cacttcacaagg-s-s-uaaggagggugaucuucuucadtdt-3’；用于plk1的qrt-pcr扩增的特异性引物：plk1-forward：5
’‑
agcctgaggc ccgatactac ctac-3’，plk1-reverse：5
’‑
attaggagtcccacacagggtcttc-3’；用于gapdh的qrt-pcr扩增的特异性引物：gapdh-forward：5
’‑
ttcaccaccatggagaaggc-3’，gapdh-reverse：5
’‑
ggcatggactgtggtcatga-3’。
23.下述实施例中所涉及的1
×
tae/mg
2+
缓冲液配方为：40mm tris，20mm乙酸，2mm edta和12.5mm mgac2·
4h2o；ph＝7.4。
24.实施例1一种球形dna纳米结构的制备方法，包括以下步骤：将2μl 10μm的回文dna序列加入至18μl 1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应1h，得到球形dna纳米结构(sops3)。
25.实施例2一种靶向性dna纳米载体的制备方法，包括以下步骤：将2μl 10μm的回文dna序列与2μl 10μm的多功能dna序列加入至16μl 1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应1h，得到靶向性dna纳米载体(apt-ctps3)。
26.实施例3一种载药靶向dna纳米载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将2μl 10μm的回文dna序列与2μl 10μm的多功能dna序列加入至16μl1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应1h，得到靶向性dna纳米载体(apt-ctps3)；(2)将2μl 10μm的siplk1-sense与2μl 10μm的siplk1 antisense-linker加入至16μl1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应
1h，得到sirna药物；(3)将20μl步骤(1)得到的靶向性dna纳米载体与20μl步骤(2)得到的sirna药物混合均匀，于室温孵育2h，得到装载sirna药物的靶向性dna纳米载体(apt-ctps3-siplk1)。
27.实施例4一种由多功能dna序列组装而成的载药纳米载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将2μl 10μm的多功能dna序列加入至18μl 1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应1h，得到dna纳米载体(apt-ps3t)；(2)将2μl 10μm的siplk1-sense与2μl 10μm的siplk1 antisense-linker加入至16μl1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应1h，得到sirna药物；(3)将20μl步骤(1)得到的dna纳米载体与20μl步骤(2)得到的sirna药物混合均匀，于室温孵育2h，得到由多功能dna序列组装而成的载药纳米载体(apt-ps3t-siplk1)。
28.实施例5一种不含二硫键的载药靶向dna纳米载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将2μl 10μm的多功能dna序列加入至18μl 1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应1h，得到dna纳米载体(apt-ps3t)；(2)将2μl 10μm的siplk1-sense与2μl 10μm的siplk1 antisense-linker(不含二硫键)加入至16μl 1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应1h，得到sirna药物；(3)将20μl步骤(1)得到的dna纳米载体与20μl步骤(2)得到的sirna药物混合均匀，于室温孵育2h，得到不含二硫键的载药靶向dna纳米载体(apt-ps3t-siplk1-n)。
29.实施例6一种载药脂质体的制备方法，包括以下步骤：(1)将2μl 10μm的siplk1-sense与2μl 10μm的siplk1 antisense加入至16μl1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃加热反应5min后缓慢冷却至室温，并在室温下继续反应1h，得到无修饰的sirna药物；(2)将20μl步骤(1)得到的sirna药物与0.8μl转染试剂lip8000混合均匀，室温下反应1h，得到载药脂质体(lip8000-siplk1)。
30.使用原子力显微镜对sops3、apt-ctps3、apt-ctps3-siplk1进行形貌表征，具体步骤如下：分别取10μl制备好的sops3、apt-ctps3、apt-ctps3-siplk1用1
×
tae/mg
2+
缓冲液稀释10倍后，取15μl稀释液滴加到云母片上，在室温下放置20min；接着，用100μl ddh2o清洗云母片三次后，在氮气下干燥云母片；最后，使用multimode 8原子力显微镜(bruker，germany)对各样品进行形貌表征。原子力成像结果显示(图3)，sops3、apt-ctps3以及apt-ctps3-siplk1均为球形结构，且尺寸逐渐增大。
31.使用激光共聚焦显微镜分析apt-ctps3-siplk1的肿瘤细胞特异性靶向能力，具体步骤如下：分别将人乳腺癌细胞(mcf-7细胞)和人正常肝细胞(l02细胞)接种在含有500μl dmem完全培养基(含有10％fbs和1％青霉素-链霉素)的24孔板上，并在含有5％co2的湿润环境下37℃培养；培养24h后，去除旧培养基，并用pbs洗涤细胞三次；然后，分别向长有mcf-7细胞和l02细胞的孔中加入80μl制备好的载药靶向dna纳米载体，再加入420μldmem培养基
(不含fbs和青霉素-链霉素)。载体在37℃下与细胞孵育2小时后，用pbs洗涤细胞三次，并用4％多聚甲醛在37℃下固定细胞15分钟。再次用pbs缓冲液洗涤三次后，用300μl hoechst 33342溶液(10μg/ml)对细胞核进行染色10分钟。最后，用pbs缓冲剂清洗细胞，并将爬有细胞的盖玻片倒置到用抗荧光淬灭剂预处理的显微镜载玻片上。使用leica sp8激光扫描共聚焦显微镜对细胞摄取dna纳米载体的情况进行分析。共聚焦结果显示(图4)，在mcf-7细胞中可观察到代表apt-ctps3的cy5荧光和代表siplk1的fam荧光，而在l02细胞中未观察到cy5荧光和fam荧光，这意味着apt-ctps3-siplk1能够主动进入靶标mcf-7细胞内部，但不进入非靶标l02细胞中，说明本发明设计的apt-ctps3-siplk1具备肿瘤细胞特异性靶向能力。
32.将apt-ctps3-siplk1与胎牛血清共同孵育，使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对其稳定性进行评估，具体步骤如下：为了探究载药靶向dna纳米载体在胎牛血清中的稳定性，将apt-ctps3-siplk1(最终浓度为500nm)与2μl胎牛血清(终浓度为10％，v/v)混合均匀，在37℃下分别孵育0h、1h、2h、4h、6h和8h，得到反应混合溶液，凝胶上样样品通过将10μl反应混合溶液与10μl 2
×
上样缓冲液混合制备，通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对纳米载体中药物sirna的稳定性进行评估。稳定性评估结果显示(图5)，经10％胎牛血清处理后的没有apt-ctps3作为保护介质的裸露药物sirna，在孵育1h时就被完全降解，失去药物作用，而apt-ctps3-siplk1中的sirna在8h时仍然存在，说明apt-ctps3能够增强药物sirna在胎牛血清中的稳定性，有利于在复杂生物环境中的应用。
33.通过实时荧光定量(qrt-pcr)和蛋白免疫印迹分析(western blot)来评估apt-ctps3-siplk1在癌细胞内沉默靶基因能力，具体步骤如下：(1)qrt-pcr评估目标mcf-7细胞中plk1 mrna的表达水平：首先，mcf-7细胞在6孔板中以4
×
105个细胞/孔的密度在37℃下培养24小时。当生长到约80％时，mcf-7细胞用pbs清洗三次，并以siplk1终浓度200nm用不同的载有sirna的材料孵育处理，包括裸露的基因药物siplk1(naked siplk1)、由多功能dna序列组装而成的纳米载体(apt-ps3t-siplk1)、不含二硫键的载药靶向dna纳米载体(apt-ctps3-siplk1-n)、载药靶向dna纳米载体(apt-ctps3-siplk1)及载药脂质体(lip8000-siplk1)，以pbs作为对照，孵育2小时后，使用dmem完全培养基代替dmem培养液，继续培养46小时，随后用pbs缓冲液洗涤细胞三次，使用trizol试剂盒(invitrogen)提取总rna，将每个样品的总rna均匀调整为1μg，使用evo m-mlv rt kit(accurate biotechnology(hunan)co.，ltd)通过逆转录获得cdna，然后使用sybr green premix pro tag hs qpcr kit在cfx96
tm
实时pcr检测系统上进行qpcr扩增(bio-rad，singapore)，通过2-δδct
方法估计每个样品的plk1 mrna的表达水平，并选择gapdh作为内部参考。(2)western blot评估目标mcf-7细胞中plk1蛋白的表达水平：将mcf-7细胞接种在6孔板中，在37℃、5％co2的湿润环境下孵育24小时后，去除dmem完全培养基，然后分别加入不同载药材料并孵育2小时，以pbs作为对照，用新鲜的dmem完全培养基代替旧培养基并孵育46小时，然后用pbs洗涤细胞三次，并在冰上用100μl含有1％pmsf(苯基甲磺酰氟)的ripa裂解缓冲液裂解细胞15分钟，每个样品中的总蛋白通过收集离心细胞裂解液(4℃，14000rpm，20min)后的上清液获得，并通过bca蛋白检测试剂盒进行定量，使用pbs缓冲液将每个样品中的蛋白质总量调节至5μg/μl，通过10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)进行电泳分离，蛋白转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜后，通过在5％脱脂乳溶液(在含有1.5m nacl、20mm tris-hcl和0.1％吐温-20的1
×
tbst缓冲液中制备)中孵育2小时来封闭膜，添加一抗plk1小鼠单
克隆抗体和β-肌动蛋白兔单克隆抗体，并在4℃下轻轻摇晃培养过夜，随后引入辣根过氧化物酶(hrp)标记的二抗，并在室温下保持2小时，用1xtbst缓冲液洗涤三次后，用ecl工作溶液对膜染色2分钟，通过
tm
xrs成像系统分析目标蛋白(plk1和β-actin)的表达水平。qrt-pcr结果显示(图6a)，apt-ctps3-siplk1-n、lip8000-siplk1以及apt-ctps3-siplk1组都抑制mcf-7细胞内目标plk1 mrna的表达，且apt-ctps3-siplk1组的抑制效率略高于另外两组，这说明设计的apt-ctps3-siplk1能够有效沉默目标基因，抑制plk1 mrna的表达。类似的，western blot评估结果显示(图6b)，apt-ctps3-siplk1-n、lip8000-siplk1以及apt-ctps3-siplk1组都抑制mcf-7细胞内目标plk1蛋白的表达，这说明本发明设计的apt-ctps3-siplk1能够有效沉默目标基因，抑制plk1蛋白的表达。
34.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种靶向性dna纳米载体的构建方法，其特征在于：将回文dna序列与多功能dna序列加入至1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，于95℃条件下加热5 min后自然冷却至室温，并在室温条件下继续反应1h，得到靶向性dna纳米载体；其中，所述回文dna序列为：5
’‑
ctctgagctcagaggtgtctcgagacacaagaggatcctctt-3’，所述多功能dna序列为：5
’‑
ccttgtgaagtgttttttttctctgagctcagaggtgtctcgagacacaagaggatcctcttttttttttgcagttgatcctttggataccctgg-3’。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述回文dna序列与多功能dna序列的摩尔比为1：1。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述1
×
tae/mg
2+
缓冲液配方为：40 mm tris，20 mm 乙酸，2 mm edta和12.5 mm mgac2·
4h2o；ph=7.4 。4.一种由权利要求1所述构建方法得到的靶向性dna纳米载体。5.如权利要求4所述的靶向性dna纳米载体在制备用于肿瘤基因治疗的载药组合物中的应用。6.一种载药组合物，其特征在于：包括权利要求4所述的靶向性dna纳米载体以及被载药物。7.根据权利要求6所述的载药组合物，其特征在于：所述被载药物为sirna药物。

技术总结
本发明提供了一种靶向性DNA纳米载体的构建及其在精准肿瘤基因治疗中的应用，属于核酸纳米材料技术领域。所述靶向性DNA纳米载体的构建基于由单条核苷酸为原料、能朝四个方向立体生长的3D结构单元的组装技术。所述靶向性DNA纳米载体能够高效率装载基因治疗药物小干扰RNA（siRNA），特异性识别肿瘤细胞，在细胞内高浓度谷胱甘肽的刺激下释放药物，从而抑制PLK1 mRNA和蛋白的表达，诱导癌细胞凋亡。所述靶向性DNA纳米载体表现出以下特点：增强的血清稳定性，可以特异性靶向癌细胞，在癌细胞内部刺激性响应释放药物，是一种具备应用前景的肿瘤基因治疗手段。肿瘤基因治疗手段。


技术研发人员：吴再生 吴静挺 郑小琦 林雯青 陈林欢
受保护的技术使用者：福州大学
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/10/15