一种耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株H-1975/AR及其应用

一种耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株h-1975/ar及其应用
技术领域
1.本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株h-1975/ar及其应用。


背景技术：

2.肺癌是目前全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，可分为小细胞肺(sclc)和非小细胞肺癌(nsclc)，非小细胞肺癌是肺癌最常见的类型，约占肺癌的85％-90％，一般发现时多为中晚期。非小细胞肺癌目前的主要治疗手段包括化疗、放疗、分子靶向治疗和免疫治疗。
3.表皮生长因子受体(egfr)突变，主要包括19外显子缺失和21外显子密码子的单一替代突变，在东亚人群的肺癌驱动基因中约占50％。对于具有egfr突变的非小细胞肺癌患者，使用表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，egfr-tki)治疗，相对于放化疗能更有效的减少毒副作用、改善生活质量、提高无进展生存期和生存率。故目前无论是国际指南还是国内指南，均推荐具有egfr突变的非小细胞肺癌患者的一线治疗选择酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)。然而，大部分患者在经过第一代酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)治疗约10个月后便会出现获得性耐药，egfr-t790m二次突变是导致一代酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)获得性耐药的主要机制之一。人们针对二次突变egfr的g719x、l861q和s768i等罕见突变位点，研发了相应的二代egfr-tki例如阿法替尼，适应征同一代egfr-tki，但是一种不可逆egfr抑制剂，且二代靶向药物虽然疗效显著，但2/3的患者都会在使用药物1-2年出现抗药性，出现肿瘤重新恶化的情况。尽管每个病人对靶向药产生抗药性的原因不尽相同，但50％～60％的egfr抑制剂耐药与t790m突变有关。
4.因此针对t790m突变的第三代egfr-tki阿美替尼已被用于临床，并取得了良好的疗效，然而患者长时间使用阿美替尼仍会出现获得性耐药。因此，模拟非小细胞肺癌的阿美替尼耐药过程并深入研究其耐药机制对于临床治疗而言具有重大意义。然而，尽管目前国内外已经建立了很多肿瘤的耐药细胞株，但缺乏耐阿美替尼的人源egfr突变的非小细胞肺癌细胞株的耐药机制分析的报道，尚无非小细胞肺癌对阿美替尼的一线耐药的细胞株。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种对第三代egfr-tki药物阿美替尼耐药的非小细胞肺癌细胞株。
6.一种耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株，所述细胞株的保藏编号为cctccno:c2022376。
7.在一些实施例中，所述细胞株在egfr 21号外显子上发生l858r突变并伴有t790m突变。
8.在一些实施例中，所述细胞株的耐药基因包括hla-dpa1、igfbp7和sdc2中的至少
一种。
9.本发明还提供了上述耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株在开发抗肿瘤药物中的应用。
10.本发明还提供了上述耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株在开发肿瘤耐药逆转药物中的应用。
11.本发明还提供了上述耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株在制备阿美替尼耐药的肿瘤模型中的应用。
12.在一些实施例中，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
13.本发明还提供抑制igfbp7和/或sdc2基因表达的试剂在制备阿美替尼耐药逆转剂中的应用。
14.在一些实施例中，抑制igfbp7和/或sdc2基因表达的试剂为化合物和sirna中的至少一种。
15.本发明还提供一种肿瘤阿美替尼耐药逆转剂，所述逆转剂包含抑制igfbp7和/或sdc2基因表达的试剂以及药物学上可接受的辅料。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17.1.本发明提供的耐阿美替尼非小细胞肺癌细胞株更接近于临床上靶向治疗药物治疗后出现耐药的实际情况，可以更好地应用于分析非小细胞肺癌细胞株形态学及生物学特点、抗肿瘤药物敏感性、筛选和评估抗肿瘤药物、开发肿瘤耐药逆转药物、研究更有效的肿瘤治疗方法等。
18.2.本发明通过建立耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株，还发现了其耐药靶基因igfbp7和sdc2，抑制igfbp7和sdc2基因的表达可以明显恢复所述细胞株对阿美替尼的敏感性，逆转耐药。因此，抑制igfbp7和sdc2基因表达的试剂可以用于制备肿瘤阿美替尼耐药逆转剂。
19.本发明的耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株，命名为h-1975/ar，已于2023年1月11日保藏于国家知识产权局指定的保藏单位中国典型培养物保藏中心（cctcc，中国.武汉.武汉大学），保藏编号为cctcc no：c2022376。
附图说明
20.为了更清楚的说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见的，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它附图。
21.图1为h-1975细胞ic50；
22.图2为本发明浓度递增培养阿美替尼耐药细胞示意图；
23.图3为本发明h-1975细胞耐药前后ic50变化；
24.图4为本发明h-1975细胞耐药前后细胞形态变化，上图为显微镜下成像，下图为h-e染色(
×
100)；
25.图5为本发明h-1975细胞耐药前后细胞周期变化；
26.图6为本发明h-1975细胞耐药前后基因表达差异与h-1975/ar细胞kegg通路富集
分析；
27.图7为本发明h-1975/ar细胞egfr-tkis耐药通路变化；
28.图8为本发明两株耐药细胞共同上调基因示意图；
29.图9为本发明共同上调基因在h-1975细胞差异基因火山图中的位置；
30.图10为本发明igfbp7、sdc2、hla-dpa1基因高表达患者预后模型；
31.图11为igfbp7、sdc2、hla-dpa1基因在h-1975/ar细胞中的表达；
32.图12为igfbp7敲减验证，其中si-igfbp7-1符合实验要求；
33.图13为基因敲减后h-1975/ar细胞凋亡率；
34.图14为pcr验证基因敲减后h-1975/ar细胞凋亡相关基因表达。
具体实施方式
35.下面将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通的技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
36.胰岛素样生长因子(igf)结合蛋白的超家族包括六个高亲和力igf结合蛋白(igfbp)和至少四个其他低亲和力结合蛋白，称为igfbp相关蛋白(igfbp-rp)。igfbp7(胰岛素样生长因子结合蛋白7)是一种低亲和力的igf结合蛋白，在调节多种细胞类型(包括刺激前列环素产生和细胞黏附)中的胰岛素样生长因子(igf)作用中起着不可或缺的作用。
37.黏结蛋白聚糖2(syndecan-2，sdc2)，又名纤维蛋白聚糖(fibroglycan)，最早在肺成纤维细胞表面发现，是细胞表面硫酸肝素蛋白多糖家族成员之一硫酸肝素蛋白多糖家族同时还包括sdc1、sdc3和sdc4等，均为单跨膜蛋白多糖。sdc2参与了多种生物学过程，例如在细胞粘附和信号转导中的功能。在斑马鱼胚胎期的血管发育中发挥重要作用，对于海马神经元的分化过程中也是必需的。近年发现sdc2在多种肿瘤中上调表达，是一个促癌因子，如食管癌、结肠癌、前列腺癌、纤维肉瘤等；也有文献报道sdc2可能是一个抑癌因子，如骨肉瘤等。
38.egfr是一种跨膜蛋白，属于her家族其中的一员，广泛表达于非小细胞肺癌。在非小细胞肺癌中，有50％的患者会出现egfr突变，egfr基因的突变频率非常高，尤其是亚裔非吸烟的女性患者。egfr突变中常见的是19号外显子缺失和21号外显子l858r基因突变，从而导致肿瘤发生，以及使用靶向药物治疗后的t790m突变导致耐药。本发明提供的耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株h-1975/ar，其在egfr 21号外显子上发生l858r突变并伴有t790m突变。
39.肺癌分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中，非小细胞肺癌占85％左右，包括腺癌、鳞癌和大细胞癌等。小细胞肺癌患者数量较少，但相比非小细胞肺癌，其进展迅速，治疗手段有限，生存期短。非小细胞转小细胞，一般指非小细胞肺癌转变成小细胞肺癌的疾病发展过程，其特征是癌细胞的组织结构，及化学形态发生变化。非小细胞肺癌，在进行细胞学检查时，细胞学和组织结构，以及免疫表型等方面并没有明显的特征，但如果由非小细胞肺癌转变成小细胞肺癌，则细胞学检查结果会有明显变化：小细胞肺癌的癌细胞一般比较小，
而且形状多呈圆形或者卵圆形，细胞间质少，细胞边缘也不清楚，细胞核可能会呈细颗粒状。核仁并不明显，但核分裂相对比较常见。在egfr-tki耐药的患者中，约3％-10％会由非小细胞肺癌转变为小细胞肺癌。
40.实施例1耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株h-1975/ar的培养
41.本实施例采用阿美替尼药物浓度递增的方法建立源于亲代细胞h-1975的人egfr基因突变阳性的非小细胞肺癌阿美替尼耐药细胞株。该方法包括以下步骤：
42.(1)h-1975细胞株的培养
43.人源egfr突变的非小细胞肺癌细胞株h-1975购自中国科学院上海细胞库。其中，h-1975建系于1988年7月，来源于一位不吸烟的女士，为21号外显子l858r突变并伴有t790m突变，将该细胞株复苏后，0.25％胰蛋白酶消化传代，以1:3传代比例将细胞置于含88％rpmi 1640+10％pbs+1％glutamax+1％sodium pyruvate 100mm solution的培养液中(以下简称h-1975培养基)，在37℃，含5％co2无菌细胞培养箱中培养。
44.(2)阿美替尼药液配制
45.使用10ml二甲基亚砜(dmso)配置浓度为10mm的阿美替尼试剂母液所需化合物质量为：0.01(l)
×
0.01(mol/l)
×
621.75＝0.0622(g)，所需阿美替尼粉末使用精准分析天平进行称量，配置过程中保持避光环境，在涡旋混匀器上涡旋5分钟使阿美替尼充分溶解。阿美替尼工作液浓度需至少稀释母液至0.1％，以避免dmso本身细胞毒性对实验结果造成影响，储备液保存方式和期限：-80℃冰箱中可保存6个月，-20℃冰箱中可保存1个月。
46.(3)检测阿美替尼ic50
47.ic50(halfmaximal inhibitory concentration)即半抑制浓度，即达到50％抑制效果时抑制剂的浓度。取对数生长期细胞，消化、离心并重悬浮后，吸取10μl细胞悬液，注入细胞计数板样本区中，然后插入细胞自动计数仪中进行计数。将细胞悬液稀释成为1.5
×
104/ml，在96孔板中每孔沿边缘注入200μl细胞悬液，每孔中细胞数量约为3000个，细胞加入后使用“十字震荡法”，轻柔摇晃，使细胞在孔板内均匀分布。在细胞贴壁进行后续加药操作，设置空白组：完全培养基，对照组：完全培养基+细胞，实验组：完全培养基+细胞+不同浓度梯度药物，每组至少设置3个复孔。阿美替尼药物浓度分别设置为0.1nm、1nm、10nm、100nm、1μm、10μm。在细胞种板区域周围一圈孔内使用pbs填充以避免“边缘效应”。在培养相应时间后，弃去旧培养基，每孔加入110μl cck-8工作液(100μl 1640+10μl cck-8)，在避光环境中反应3小时后，于酶标仪中读取在450mm波长处吸光值。细胞存活率＝[(实验组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)]
×
100％；细胞抑制率＝[(对照组吸光值-实验组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)]
×
100％。ic50计算使用ic50 calculator[82]工具进行计算。测得h-1975ic50为1.9nm，如图1所示。
[0048]
(4)阿美替尼耐药细胞培养方案
[0049]
将阿美替尼母液稀释为相应浓度后，加入h-1975培养基中使用，初始浓度为10％ic50，采取浓度递增方法进行耐药细胞培养，每一药物梯度细胞同时培养三瓶。给药初期细胞受药物抑制，增殖速率低。在细胞逐渐耐受当前药物浓度后，数量开始增长。在细胞增长至瓶底70-80％时，进行传代，接受下一浓度梯度药物培养。由于初始浓度0.19nm难以配置，向下兼容设定0.1nm为初始浓度，药物培养梯度依次为0.1nm、0.2nm、0.5nm、1nm、2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm，具体示意图见图2，培养耐药细胞的过程中不使
用双抗。重复上述步骤，循环直至培养液中阿美替尼浓度增加至1μm/l，于1μm/l阿美替尼中培养2个月。直至传代的h-1975能在含1μm/l的阿美替尼培养液中以与亲代h-1975细胞株相同的速率稳定生长、传代，即获得本发明的耐阿美替尼的人肺癌细胞系h-1975/ar。
[0050]
(5)阿美替尼耐药细胞株验证
[0051]
取上述培养在含1μm/l的阿美替尼培养液中的h-1975细胞，再次检测细胞ic50，结果如图3所示。随着阿美替尼浓度的增加，原代细胞与耐药细胞的存活率都明显降低。其中h-1975耐药系数为833.58(耐药系数＝耐药细胞ic50/原代细胞ic50)，表明经过药物诱导，h-1975细胞对阿美替尼的敏感性逐渐降低，产生了显著的耐药性，成功的构建了本发明的阿美替尼耐药细胞h-1975/ar。
[0052]
(6)h-1975/ar细胞株形态学观察
[0053]
将载玻片放置在六孔板中，重新悬浮处于对数生长期的细胞后，平均种板到每个孔中。待细胞贴壁后，弃去细胞培养液，使用pbs冲洗三次后，分离出载玻片进行细胞h-e染色。二甲苯固定细胞10分钟，后以95％乙醇浸泡1分钟进行细胞脱水，蒸馏水清洗1分钟后，使用苏木精染色液染色15分钟，蒸馏水清洗掉苏木精染色液后，使用1％盐酸乙醇清洗3秒，促蓝液反蓝30秒，流水冲洗15分钟，0.5％曙红液染色3分钟，最后用自来水冲洗5分钟，滴上中性树脂后，盖上盖玻片。在倒置显微镜下观察h-1975细胞耐药前后形态学变化与he染色变化，结果如图4，结果显示h-1975细胞系在耐药前后形态学变化不明显，he染色较前发现细胞核较前扩大。
[0054]
(7)h-1975/ar细胞周期变化
[0055]
采用流式细胞术检测周期，取密度约为70-80％的各组细胞，离心重悬浮后接种于六孔板，每株细胞三个复孔，在细胞贴壁后24小时后，应用4℃预冷的pbs洗涤收集的细胞3次，离心沉淀细胞，弃上清。以0.5ml pbs重悬细胞，迅速打入3.5ml 70％预冷的乙醇中，吹打均匀，4℃储存过夜。离心乙醇固定过的细胞，弃上清，使用pbs洗涤细胞3次以去除残留的乙醇。然后应用含有0.2mg rnasea的1ml pi/triton x-100染色液重悬细胞，37℃染色15min。最后应用流式细胞仪测定细胞周期。数据使用flowjo 10.0软件进行分析后作图。s期(s-phase)是细胞周期中dna复制发生的时期，代表着处于复制中细胞的数目，反映细胞的增殖与侵袭能力。h-1975/ar细胞较原代细胞，s期细胞数量较前均增多(p＜0.05)，差异具有统计学意义，结果如图5，说明h-1975/ar细胞拥有更大的比例的合成期细胞百分数，提示细胞侵袭与增殖能力较前提高。
[0056]
实施例2h-1975/ar细胞基因表达差异与基因富集
[0057]
采用实施例1方法成功构建阿美替尼耐药h-1975细胞即h-1975/ar细胞后，提取h-1975及h-1975/ar细胞总rna，具体方法为：细胞生长密度达到70-80％时，使用吸出培养液，pbs洗液洗涤后，每1
×
106—2
×
107的培养细胞中加入1ml的rnaex，使用移液器反复吹打使细胞脱落，然后将内含细胞的裂解液转移至离心管中，再用移液器吹打直至裂解液中无明显沉淀(溶液清亮)。室温静置5分钟后，向上述裂解液中加入rnaex体积量1/5氯仿，充分混合，室温静置5分钟。12，000rpm 4℃离心15分钟，此时匀浆液分为三层，即：上清液(含rna)、中间蛋白层及下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出中间蛋白层)。向上清中加入1/2倍rnaex体积的异丙醇，充分混匀，室温下静置10分钟，12，000rpm 4℃离心10分钟，离心后弃上清液，注意不要触碰到rna沉淀。向离心管中加入与rnaex等体积的
80％乙醇(-20℃预冷)，清洗rna沉淀及离心管管壁，7，500rpm 4℃离心5分钟，小心弃去上清，切勿触及沉淀。打开离心管盖，抽真空或室温干燥沉淀约5分钟。向离心管中加入50μl的rna-free水溶解rna，将溶解后的rna放入-80℃中保存。再对rna转录组测序，将两株细胞，各选出三个rna样本进行检测，bioanalyzer2100用于检查rna样品的质量和数量，以确保所有样品的rin＞7.0，将合格的rna样品送至novogene进行文库构建和测序，使用illumina的nebnextulltratmrna文库制备试剂盒制备rna文库，并在illumina hiseq平台上测序。数据处理和可视化注释，选择trim galore(v0.4.2，babraham bioinformatics)来修剪原始读数中的低质量和接头序列，选择edgerr进行差异表达分析选择，选择r pathview来注释kegg通路途径中的基因差异表达状态，利用热图与火山图对差异表达基因进行呈现。利用韦恩图进行同名基因筛选，所有基因使用ncbi id(2022version)进行注释。结果显示：h-1975与h-1975/ar之间一共检测到了18552个差异表达基因，其中有统计学意义的差异表达基因包括206个下调基因，105个上调基因。对基因通路富集的结果显示，h-1975/ar细胞耐药富集基因涉及到67条有意义的通路变化，包括“metabolic pathways”、“viral myocarditis”、“antigen processingandpresentation”、“allograft rejection”、“antigen processing and presentation”、“cell adhesion molecules”、“graftversus host disease”、“type i diabetes”、“htlv-i infection”途径，结果如图6。
[0058]
实施例3耐药通路表达差异及耐药靶点基因
[0059]
本实施例进一步公开了h-1975/ar细胞在egfr-tkis耐药通路上的基因表达差异：h-1975/ar细胞出现了经典pi3k/akt耐药通路中akt3的上调，结果如图7。同时，本发明还培养了阿美替尼耐药人肺癌细胞hcc 827/ar，存在19外显子缺失突变，有一定小细胞肺癌指标表达，并对其进行耐药机制分析。对h-1975/ar和hcc 827/ar中上调的基因取交集，发现有10个基因在两株细胞中都出现了上调，结果如图8，基因具体名称在表1中所示。10个基因在细胞差异表达基因火山图中的位置如图所示，结果如图9，都具有显著上调表达(p＜0.05)。在cepia(http://gepia.cancer-pku.cn/)网站进行绘制生存曲线，以os作为终点结局，基于cox ph模型计算危险度比将5％置信区间添加为虚线。横轴单位设定为月。对igfbp7的分析一共纳入76例病例，对于igfbp7高表达的患者预后更差(p＜0.005)。对sdc2的分析一共纳入512例病例，sdc2高表达的患者预后更差(p＜0.05)。对hla-dpa1的分析一共纳入514例病例，hla-dpa1高表达的患者预后更差(p＜0.005)。其余基因表达和预后之间的关系并不显著。因此，本发明筛选出igfbp7、sdc2、hla-dpa1作为阿美替尼耐药靶点基因，结果如图10。
[0060]
表1表达上调分子
[0061][0062][0063]
实施例4h-1975/ar细胞耐阿美替尼潜在的耐药基因igfbp7、sdc2
[0064]
首先通过pcr的方法在h-1975与h-1975/ar细胞中验证了基因的表达上调。按照实施例2中的方法提取细胞rna，rna定量使用超微量核酸蛋白检测仪进行，以od260/280＞2.0，od260/230＞2.0作为核酸质控标准。将样品浓度稀释到500ng/μl以下。逆转录：rna逆转录按照说明书执行，使用逆转录机器进行逆转录(逆转录溶液成分见表4)，反应条件如下：37℃15min、85℃5sec4℃end逆转录产物为cdna。在20μl pcr反应体系里(组分及体积见表5)，dna模板添加量通常在100ng以下，上一步骤中的cdna再使用3倍体积rnase free water稀释后作为pcr反应体系cdna样品，进行pcr，引物设计见表6。结果显示igfbp7、sdc2、hla-dpa1在细胞耐药后都出现了显著上调(p＜0.05)，结果如图11。
[0065]
由于hla-dpa1既往研究较多，本发明重点研究igfbp7与sdc2两个基因。鉴于基因上调表达会导致耐药，本发明通过构建质粒载体sirna对基因进行敲减，sirna委托生物科技公司构建，载体图谱为pslenti-u6-shrna-cmv-egfp-f2a-puro-wpre。主要流程包括：根据human igfbp7、sdc2基因以及scr基因转录本设计sirna靶点，安排引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的rna干扰载体，替换掉原来的毒性基因。菌落pcr筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。sirna靶向结合dna序列与质粒构建框架见表2、表3。
[0066]
表2sirna靶向结合dna序列
[0067]
[0068][0069]
表3转染用质粒构建框架
[0070]
[0071][0072]
再进行细胞转染，转染实验在h-1975/ar细胞中进行，收集细胞，将细胞消化后制成单细胞悬液，计数后，细胞配成2
×
105cell/ml后，六孔板每孔铺1ml细胞，即2
×
105cell/well，于培养箱中培养，过夜。12～20小时后，观察细胞的融合率达到60％～70％左右，每一个孔的细胞加入125μl不含抗生素和血清的medium，加入100pmol sirna，再加入4μl lipo8000
tm
转染试剂，用枪轻轻吹打混匀。继续培养约48小时后，即可荧光检测以及pcr检测转染效率，转染完成后，3天内使用细胞完成后续实验。经pcr与wb实验验证，在转染48小时后，si-igfbp7与si-sdc2敲减符合实验要求，被作为后续实验对象，结果如图12。
[0073]
再使用相同浓度阿美替尼(2μm)处理，以敲减组细胞凋亡率增加作为支持耐药基因的证据。原代细胞与转染细胞在经2μm阿美替尼处理24小时后，通过流式细胞术检测细胞凋亡率，具体方法同(7)中，结构显示igfbp7敲减组细胞凋亡率由4.32％上升到16.81％，sdc2敲减组细胞由6.16％上升到13.00％，结果如图13。继续使用pcr技术，具体方法同上述，对潜在凋亡因子进行检测，igfbp7及sdc2敲减组细胞在使用2μm阿美替尼处理24小时后，casepase 3、casepase 6、casepase 7、casepase 9、bax均出现上升(p＜0.05)，bcl-2出现下降(p＜0.05)，casepase 8变化不明显，结果如图14。wb实验证实在igfbp7及sdc2下调后，h-1975/ar恢复了对阿美替尼的敏感性，说明h-1975/ar细胞对阿美替尼产生耐药性的靶基因包括igfbp7及sdc2。
[0074]
以上借助具体实施例对本发明做了进一步描述，但是应该理解的是，这里具体的描述，不应理解为对本发明的实质和范围的限定，本领域内的普通技术人员在阅读本说明书后对上述实施例做出的各种修改，都属于本发明所保护的范围。

技术特征：
1.一种耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株的保藏编号为cctccno:c2022376。2.根据权利要求1所述的耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株在egfr21号外显子上发生l858r突变并伴有t790m突变。3.根据权利要求1所述的耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株，其特征在于，所述细胞株的耐药基因包括hla-dpa1、igfbp7和sdc2中的至少一种。4.根据权利要求1～3任一项所述的耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株在开发抗肿瘤药物中的应用。5.根据权利要求1～3任一项所述的耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株在开发肿瘤耐药逆转药物中的应用。6.根据权利要求1～3任一项所述的耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株在制备阿美替尼耐药的肿瘤模型中的应用。7.根据权利要求4～6任一项所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为非小细胞肺癌。8.抑制igfbp7和/或sdc2基因表达的试剂在制备肿瘤的阿美替尼耐药逆转剂中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制igfbp7和/或sdc2基因表达的试剂为化合物和sirna中的至少一种。10.一种肿瘤阿美替尼耐药逆转剂，其特征在于，所述逆转剂包含抑制igfbp7和/或sdc2基因表达的试剂以及药物学上可接受的辅料。

技术总结
本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及一种耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株H-1975/AR及其应用。所述耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株的保藏编号为CCTCCNO:C2022376。所述耐阿美替尼的细胞株在EGFR21号外显子L858R突变并伴有T790M突变，表现为小细胞肺癌表型，对阿美替尼具有耐药性；所述细胞株的耐药基因包括HLA-DPA1、IGFBP7和SDC2中的至少一种。本发明提供的耐阿美替尼的非小细胞肺癌细胞株，为研究非小细胞肺癌对靶向药耐药机制、开发抗肿瘤药物、开发肿瘤耐药逆转药物以及寻找克服非小细胞肺癌耐药的有效治疗方法及指导临床用药提供了耐药细胞模型，具有重要的作用和良好的应用前景。应用前景。应用前景。


技术研发人员：翟林柱 陶佳豪 王科 郑创杰 张翠芬 陈静 林曼迪
受保护的技术使用者：广州中医药大学第一附属医院
技术研发日：2023.03.14
技术公布日：2023/10/15