一种肝病的生物标志物及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肝病的生物标志物及其应用。


背景技术：

2.肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是最普遍的癌症类型之一，大部分hcc患者是由hbv感染引起，乙型肝炎(chb)和肝硬化(lc)是hcc的高危人群，代表肝脏疾病的不断进展和严重程度不断增加。因此早期诊断和治疗成为减少hcc发生和死亡的关键。目前，肝组织活检是诊断与评价不同病因致肝癌和肝硬化的“金标准”。甲胎蛋白(alpha fetoprotein，afp)是hcc的临床诊断标志物，但其灵敏度在40-60％之间，特异性在80-90％之间。尽管一些新的候选生物标志物afp-l3和dcp与afp联合使用可以提高hcc的检测性能，但其敏感性和特异性仍不尽如人意。目前临床缺乏高效可靠的区分chb、lc以及hcc的高诊断性能的血清生物标志物，因此开发鉴别三种肝病的诊断标志物不仅可以改善患者预后，更为临床治疗及药物开发提供相应的思路。
3.专利文献cn112881547a公开了一种肝硬化及肝炎人群早期肝癌诊断标志物的筛选方法，包括以下步骤：s1、数据获取；s2、判别模型构建；s3、筛选标志物；s4、诊断能力验证。其中，肝炎人群早期肝癌诊断标志物包括：肌酐、鞘氨醇、(1s,5r)-2-甲基-5-(1-甲基乙烯基)-2-环己烯-1-醇、d-半乳糖、d-葡萄糖、胆红素、半乳糖鞘氨醇、二十二碳六烯酸、对苯二酚；肝硬化人群早期肝癌诊断标志物包括：6-磷酸海藻糖、脱氧腺苷、γ-亚麻酸、棕榈酸、乙醇酸、二十二碳六烯酸、抗坏血酸、花生四烯酸、胆绿素、6-磷酸葡萄糖、1-磷酸葡萄糖、假尿苷、尿苷、1-甲基腺苷、17a-乙炔雌二醇。
4.专利文献cn112996928a公开了一种检测肝脏疾病的方法，其基于循环上皮细胞的血液浓度及其基因表达来诊断、确定或监测肝脏疾病和病况的方法。其中，hcc分类器基因包括tesc、osbp2、slc6a8、sept5、f2rl3、e2f1、ezh2、cdc20、ccna2、ccnb1、plxnb3、cdc6、mybl2、apobec3b、spp1、akr1b10、top2a、aspm、slc6a9、recql4、nusap1、plvap、fmo1、pdzk1ip1、和fbxo32中的一种或多种。


技术实现要素：

5.为弥补现有技术的不足，本发明提供了一种用于肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的生物标志物，其不仅能区分健康人和肝病患者，还能区分肝细胞癌患者、肝硬化患者、乙型肝炎患者。
6.本发明的第一方面，一种生物标志物或所述生物标志物检测试剂在制备肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的产品中的应用，所述的生物标志物选自c7、anpep、iglv3-19、iglv1-40、qsox1、iglv3-27、a2m、ighv5-51、ighv4-34、igkv4-1、serpina3、habp2、lcat、rbp4、f10、orm1、c4bpb、pcyox1、cfhr2、cpn1、f2、vwf、hspg2、nrp1、ighv3-9、iglv1-47、igkv1-5、jchain、lum、pigr、igkv1-27、igkv1-16、ighv3-7、icam2、cd5l、tgfbi、igfbp2、fbln1、ighv5-10-1、igha1、lgals3bp、fgg、klkb1、cfb、cpn2、
apoc1、clu、serpind1、c1s、lyve1、ighv2-26、fuca1、igkv1-8、f12、proz、igf1、apom、plg、igkv3-15、cfi、camp、sparc、pon3、thbs1、apoa2、masp2、fcn3、c3、gc、c4bpa、ppbp、itih4、c9、c4b、serpina1、afm、cpb2、f13b、c6、serpina10、hp、c5、f7、saa1、c2、agt、apcs、c1rl、mcam、cdh5、igkv3-20、ighv3-49、igkv2d-29、efemp1中的一种或多种。
7.进一步地，所述的肝病患者的乙型肝炎表面抗原(hbsag)阳性和/或乙型肝炎核心抗体(hbcab)阳性，所述肝病患者具有乙型肝炎病毒感染史。
8.进一步地，所述的肝病选自肝癌(如肝细胞癌、胆管细胞癌、转移性肝癌)、病毒性肝炎(如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎)、肝硬化(如病毒性肝炎肝硬化、酒精性肝硬化、代谢性肝硬化、自身免疫性肝硬化)、脂肪肝(如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝)中的一种或多种。
9.优选地，所述的肝病选自肝细胞癌、乙型肝炎或肝硬化中的一种或多种。
10.进一步地，所述的生物标志物为基因或蛋白，特别是蛋白。
11.进一步地，所述的检测试剂包括检测所述生物标志物的含量或表达水平的试剂。
12.进一步地，所述的产品可以为试剂、试剂盒、试纸、基因芯片、蛋白芯片等，其可以包含能够结合所述生物标志物的物质(例如抗体或其片段)；也可以为仪器平台，如高通量测序平台、蛋白质组学分析产品；蛋白质组学分析产品可以包含测量模块(用于测量待测样本中所述生物标志物的含量)，还可以包含分析模块(用于分析待测样本与参比样本中所述生物标志物的含量差异)。
13.进一步地，所述的产品的检测样本为组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液或其级分或经过处理的材料，优选为血清。
14.进一步地，所述的肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的方法包括：检测肝病患者的所述生物标志物的含量或表达水平，与健康人的所述生物标志物的含量或表达水平进行比较；
15.或，检测不同的肝病患者的所述生物标志物的含量或表达水平并进行比较。
16.其中，检测所述生物标志物的步骤包括：获得待测样本，分离蛋白并酶解获得多肽，检测多肽浓度，并用质谱确定所述生物标志物的含量或表达水平(例如绝对或相对表达水平)。
17.进一步地，所述的待测样本可以为组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液等或其级分或经过处理的材料，优选为血清。
18.进一步地，在检测前待测样本经过预处理，预处理包括：将待测样本离心取上清，然后裂解变性，还原，在经烷基化处理，用缓冲液(例如碳酸氢铵溶液)离心洗涤，酶解，离心分离，收集多肽溶液，干燥，然后溶解于溶剂中；优选地，预处理还可包括：将上述溶解于溶剂中的肽过分析柱，用于dia-ms分析。
19.进一步地，所述的分析柱分离的流动相包括流动相水相(a)和流动相有机相(b)；优选地，流动相a可以为0.05-0.2％(v/v)甲酸水溶液，特别是0.1％甲酸水溶液。流动相b可以含0.1％甲酸，80％的乙腈。在本发明的一个实施例中，流动相设置为：0-15分钟为7％-15％溶剂b(80％ can，0.1％甲酸)，15-90分钟为15％-30％溶剂b，90-115分钟30％-50％溶剂b，115-117分钟为50％-95％溶剂b，117-120分钟为95％溶剂b。
20.进一步地，所述的dia-ms分析中，dia采集范围为350-1400质荷比(m/z)。在本发明
26、hspg2、fuca1、iglv1-40、igkv1-8、f12、proz、igf1、f10、apom、plg、apoc1的组合。
31.进一步地，所述的生物标志物为igkv4-1、hspg2、igha1、nrp1、lum、jchain、igfbp2、igkv3-15、ighv3-7、vwf、igkv1-8、cd5l、cfi、camp、clu、sparc、pon3、thbs1、cpn2、apoa2、masp2、fcn3、c3、gc、c4bpa、apoc1、ppbp、apom、plg的组合。
32.进一步地，所述的生物标志物为itih4、hspg2、c9、c4b、igfbp2、serpina1、serpina3、lum、proz、clu、plg、ppbp、afm、apoc1的组合。
33.进一步地，所述的生物标志物为serpind1、cpb2、cpn2、rbp4、plg、f13b、c4bpa、c4bpb、klkb1、cpn1、c6、serpina10、hp、c5、sparc、gc、f7、c3、saa1、c2、agt、apcs、apom、c1rl、mcam、fbln1、igkv4-1、cdh5、iglv1-40、ighv4-34、igkv3-20、ighv3-49、igkv2d-29、hspg2、ighv5-51、cd5l、jchain、efemp1的组合。
34.进一步地，所述的肝病患者的乙型肝炎表面抗原(hbsag)阳性和/或乙型肝炎核心抗体(hbcab)阳性，所述肝病患者具有乙型肝炎病毒感染史。
35.进一步地，所述的肝病选自肝癌(如肝细胞癌、胆管细胞癌、转移性肝癌)、病毒性肝炎(如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎)、肝硬化(如病毒性肝炎肝硬化、酒精性肝硬化、代谢性肝硬化、自身免疫性肝硬化)、脂肪肝(如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝)中的一种或多种。
36.优选地，所述的肝病选自肝细胞癌、乙型肝炎或肝硬化中的一种或多种。
37.进一步地，所述的生物标志物为基因或蛋白，特别是蛋白。
38.本发明的第三方面，提供了一种肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的产品，所述的产品中包含第二方面所述的生物标志物。
39.进一步地，所述的肝病患者的乙型肝炎表面抗原(hbsag)阳性和/或乙型肝炎核心抗体(hbcab)阳性，所述肝病患者具有乙型肝炎病毒感染史。
40.进一步地，所述的肝病选自肝癌(如肝细胞癌、胆管细胞癌、转移性肝癌)、病毒性肝炎(如甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎)、肝硬化(如病毒性肝炎肝硬化、酒精性肝硬化、代谢性肝硬化、自身免疫性肝硬化)、脂肪肝(如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝)中的一种或多种。
41.优选地，所述的肝病选自肝细胞癌、乙型肝炎或肝硬化中的一种或多种。
42.本发明的第四方面，提供了一种肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的产品，包括第二方面所述生物标志物或所述的生物标志物的检测试剂。
43.本发明的第五方面，提供了一种肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的方法，所述的方法包括检测第二方面所述生物标志物的含量或表达水平，和/或将检测的含量或表达水平数值进行比较的步骤。
44.本发明的第六方面，提供了一种区分健康人和肝病患者，和/或区分不同类型肝病患者的方法，所述的方法包括检测第二方面所述生物标志物的含量或表达水平，还包括将检测的含量或表达水平数值进行比较的步骤。
45.本发明的第七方面，提供了一种减少肝病发生和死亡的方法，所述的方法包括检测第二方面所述生物标志物的含量或表达水平，和/或将检测的含量或表达水平数值进行比较的步骤，还包括对肝病或将来具有患肝病的风险的患者施用治疗或预防的药物的步
骤。
46.本发明的第八方面，提供了一种第二方面所述生物标志物的检测试剂。
47.进一步地，所述的检测试剂能够检测所述生物标志物的存在、含量或表达水平。
48.进一步地，所述的检测试剂包括可以与所述生物标志物结合的物质，例如抗体或其结合片段。
49.进一步地，所述的检测试剂还包括获取样本、处理样本以及检测过程中需要的仪器或设备的流动相等。
50.进一步地，所述的检测试剂可基于使用蛋白的已知方法来发挥其功能：例如，可以采用elisa、放射免疫测定法、免疫组织化学法、western印迹、蛋白质组学(例如抗体芯片、质谱(例如数据非依赖采集(data independent acquision，dia)质谱)等。
51.本发明的有益效果为：本发明所筛选出的肝病(如肝细胞癌、肝硬化、乙型肝炎)患者血清中的生物标志物可应用于肝病的诊断、患病风险评估、预后评估或疗效评估，所述生物标志物的灵敏度高、特异性高、准确度高。
附图说明
52.图1所示为抗体芯片检测血清的重复性。
53.图2所示为胰蛋白酶消化的人hek293t细胞裂解物在发现队列(a)和验证队列(b)的重复性。图中横纵坐标数字代表重复检测人hek293t细胞裂解物的不同时间点，方框中的数字代表横纵坐标任意两时间点样本检测结果成对spearman相关系数。
54.图3所示为hc、chb、lc和hcc两两之间差异蛋白的火山图分析(p值《0.05)，蓝色和红色三角形分别代表下调和上调的蛋白。
55.图4所示为基于dia-ms对发现队列和验证队列中检测到的蛋白质进行维恩图分析。
56.图5所示为基于机器学习开发鉴别肝脏疾病的血清蛋白标志物组合。
57.图6所示为在发现队列和验证队列中，chb、lc、hcc分别与hc的多标志物组合的roc曲线(a)和混淆矩阵性能(b)。
58.图7所示为发现队列和验证队列中lc与chb、hcc与chb、hcc与lc的多标志物组合的roc曲线(a)和混淆矩阵性能(b)。
具体实施方式
59.除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
60.本发明中，术语“肝细胞癌”是原发性肝癌中的一种，原发性肝癌主要包括肝细胞癌、胆管细胞性肝癌和混合性肝癌。所述的肝细胞癌具有以下特征：癌细胞排列形成实性团块状，周围富有扩张的血窦。癌细胞境界不清，大小较一致，浆宽。核单个，类圆形，异形性不明显。核分裂象少见。
61.本发明中，术语“乙型肝炎”是由乙型肝炎病毒引起的以肝脏病变为主的一种传染病。基因组是双链、环形、不完全闭合dna。病毒最外层是病毒的外膜或称衣膜，其内层为核心部分，核蛋白即是核心抗原(hbcag)，不能在血清中检出。部分患者可有黄疸发热和肝大
伴有肝功能损害。有些患者可慢性化，甚至发展成肝硬化，少数可发展为肝癌。
62.本发明中，术语“肝硬化”是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。大多数为肝炎后肝硬化，少部分为酒精性肝硬化和血吸虫性肝硬化。病理组织学上有广泛的肝细胞坏死、残存肝细胞结节性再生、结缔组织增生与纤维隔形成，导致肝小叶结构破坏和假小叶形成，肝脏逐渐变形、变硬而发展为肝硬化。
63.本发明中，术语“阈值”是指界限值或临界值，即一个效应能够产生的最低值或最高值。其可以是一个数值、一个数值范围或者一个计算数值或数值范围的公式。
64.本发明中，术语“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。所述的“早期诊断”是指以查明患者将来是否患有疾病或病症。
65.本发明中，术语“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。
66.本发明中，术语“患病风险评估”是指以查明患者诊断时或将来患有疾病或病症的概率。
67.本发明中，术语“疗效评估”是指为患者施药后，评估其治疗效果。
68.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
69.实施例1
70.1、样本收集
71.本实施例共收集两个独立的临床队列的血清样本。
72.发现队列(包括测试子集与训练子集)中的21例健康对照(hc)来自中国医学科学院肿瘤医院北京协和医学院，29例慢性乙型肝炎(chb)和29例肝硬化(lc)患者的血清来自解放军总医院第五医学中心，46例hcc患者术前血清来自中山大学肿瘤防治中心北京大学肿瘤医院。
73.验证队列的75例血清样本来自首都医科大学北京地坛医院，包括15例hc、15例chb患者、15例lc患者和30例hcc患者。
74.所有肝病(chb、lc、hcc)患者均为乙型肝炎表面抗原(hbsag)阳性和/或乙型肝炎核心抗体(hbcab)阳性，具有hbv感染史。
75.2、实验设计
76.使用结合高密度抗体芯片和dia-ms技术的id-map平台分析了发现队列的125例血清样本，75例验证队列通过dia-ms的方法进行检测。然后，用分位数标准化(quantile normalization)对样本间数据进行标准化，标准化后的抗体芯片数据和dia-ms数据分别先在四组样本中进行kruskal-wallis h检验(p值《0.05)，然后用wilcoxon秩和检验(p值《0.05)鉴定两个队列中四组样本两两之间的差异蛋白。最后，通过机器学习得到hc，chb，lc和hcc四组样本两两之间的6组标志物组合。
77.3、实验方法
78.3.1抗体芯片分析
79.用于抗体芯片制备的532种抗体购自美国bio-techne公司(mn，usa)和英国abcam
公司(cambridge，uk)。将532种抗体稀释到～0.2mg/ml，阳性对照为100μg/ml的生物素化免疫球蛋白g(bio-igg)和10μg/ml的alexa fluor 555标记山羊抗人免疫球蛋白g，阴性对照为磷酸盐缓冲盐水(pbs)和100μg/ml的bsa溶液，将所有抗体、阳性对照和阴性对照15μl/孔加入384孔板中。然后将384孔板放入台式离心机上离心2min(1000
×
g)以去除产生的气泡。最后通过芯片点样仪将抗体溶液以两个重复点制在三维d修饰的玻片表面，置于-20℃备用。一张抗体芯片可同时检测四个血清样本中的532个蛋白质靶标。
80.取10μl血清样本，用1
×
pbs溶液稀释10倍，然后加入1μl浓度为20g/l的生物素标记试剂(溶剂为dmso)，室温反应1h以充分标记血清，将标记后的血清加入bio-spin微型分离柱的胶床中心，1000
×
g离心2min以去除过量的生物素分子，重复该步骤4次，收集的流出液中加入400μl离心过的5％脱脂牛奶(溶剂为1
×
pbs)。将芯片在室温静置30min后固定在孵育盘上，用500μl 5％的脱脂牛奶室温下封闭1h；真空泵吸去孵育盘内的封闭液后，将预处理好的生物素标记血清加入孵育盘的每个围栏内，室温条件下结合反应2h；真空泵吸去孵育盘内的溶液，0.05％ pbst洗涤三次，每次10min；将2μg/ml的荧光染料加入到每个围栏中以结合载玻片上捕获的生物素化血清蛋白分子，室温避光孵育1h；真空泵吸去孵育盘内的溶液，0.05％ pbst洗涤三次，每次10min；将芯片晾干，芯片扫描仪扫描抗体芯片，并使用genepix pro图像分析软件导出荧光图像和数据结果。
81.3.2dia-ms分析
82.首先，血清样本在10000rpm下离心3min，将2μl血清上清加入1.5ml离心管中，用100μl的6mol/l尿素裂解液使血清蛋白变性，加入1μl 1mol/l的dtt在37℃水浴中还原60min；然后，在25℃避光条件下，用10μl 500mmol/l的iaa烷基化处理45min，将溶液转移到0.5ml-30k的超滤管中，用200μl浓度为50mmol/l的nh4hco3在12000g下离心洗涤三次，去除多余的烷基化试剂，使烷基化蛋白沉淀在超滤管中；接下来，用0.04mg/ml胰蛋白酶在37℃下酶解16h，在12000g室温下离心15min，离心管收集滤液，向超滤管中再加入200μl纯水，12000g离心15min，收集全部滤液；将收集到的肽溶液真空热干4h后，溶解于20μl的0.1％甲酸中；最后用ds-11分光光度计测定肽浓度，吸光度设定为a280 nm。
83.用q exactive
tm hf组合型四极杆orbitrap
tm
质谱仪(qe-hf)进行数据依赖采集分析(dia)。简而言之，在easy-nlc
tm 1200液相色谱系统上，在最大压力280bar的条件下，用12μl的溶剂a(0.1％甲酸)将3μg的混合肽加载到c18捕获柱(100μm
×
2cm，自包装)上，然后以600nl/min的流速注入c18分析柱(150μm
×
250mm，1.9μm)中。120分钟的梯度设置为：0-15分钟为7％-15％溶剂b(80％ can，0.1％甲酸)，15-90分钟为15％-30％溶剂b，90-115分钟30％-50％溶剂b，115-117分钟为50％-95％溶剂b，117-120分钟为95％溶剂b。
84.qe-hf质谱仪的dia采集方案包括45个可变窗口，扫描范围为350-1400m/z，1da的重叠，母离子隔离窗口设置如下:374-412，412-436.5，436.5-457，457-471.5，471.5-483.5，481.5-484.5，494.5-507，507-520.5，520.5-533.5，53.5-554.5，554.5-563.5，563.5-573.5，583.5-593.5，593.5-604，604-615，615-626，626-636，636-646，646-657，675-668.5，668.5-680，680-691，691-702，702-714，714-726.5，76.5-739.5，739.5-753，753-767，781-796，796-812，812-828.5，828.5-846.5，835.5-964，964-998，998-1040.5，1040.5-1101，1101-1269m/z。dia参数为：nce为28，总循环时间为3.6s，分辨率为30,000，agc为1e6，最大离子注入时间为45ms。
85.用spectronaut pulsar 14软件对dia数据进行分析，如果没有特殊说明均使用默认设置。dia的原始数据通过spectronaut pulsar 14在上述多疾病光谱库中进行搜索。
86.4、结果分析
87.通过抗体芯片和dia-ms技术对发现队列125例血清样本的检测。抗体芯片在阵列内和阵列间检测同一样本的r相关性分别为0.97和0.98(图1)。为了评估dia-ms的重复性，在整个质谱实验期间的15个不同时间点分析相同的胰蛋白酶消化的人hek293t细胞裂解物，批间相关系数(r)达到0.93-0.97(图2)。
88.标准化后的抗体芯片和dia-ms数据通过wilcoxon秩和检验(p《0.05)分析，chb/hc、lc/hc、hcc/hc、lc/chb、hcc/chb和hcc/lc之间分别鉴定到192、330、259、223、213和250个差异表达蛋白(图3)。
89.用包含75名肝病患者的独立队列进行dia-ms分析，在两个队列中可重复检测到313种蛋白质(图4)。然后，通过在随机重复100次的5倍交叉验证试验中训练lasso回归模型，通过特征选择确定用于检测肝脏疾病的多生物标志物组合(图5，表1)。
90.表1多标志物组合在发现队列和验证队列中区分不同肝脏疾病的整体性能
91.[0092][0093]
然后，比较了6种先进的机器学习分类器，通过比较不同分类器的整体性能，选择svm模型作为最终的分类器。最终得到六个用于区分任意两组样本(hc、chb、lc和hcc)的多标志物组合。auc和混淆矩阵的用于hc，chb，lc和hcc组的两两比较标志物组合的性能评估。
[0094]
在发现队列中和验证队列中，使用多标志物组合检测hc中chb患者的auc分别为0.982和0.942，hc中lc患者的auc分别为1.000和0.978，hc中hcc患者的auc分别为1.000和0.982(图6，表2)。由此可见，多标志物组合在检测hc中chb患者、lc患者、hcc患者的灵敏度和特异性高，检测性能好。
[0095]
在发现队列和验证队列中，使用多标志物组合检测chb患者中lc的auc分别为0.998和0.884，而单独使用afp时为0.533。在发现队列中，多生物标志物组合从chb和lc患者中监测hcc的auc分别为0.953和0.966，在验证队列中分别为0.891和0.818，而单独使用afp时为0.717和0.683(图7a和图7b，表2)。由此可见，与单一生物标志物afp相比，多标志物组合在检测高风险chb患者组中lc患者和hcc患者、lc患者组中hcc患者的性能显著提高。
[0096]
表2多标志物组合在发现队列和验证队列中区分不同肝脏疾病的整体性能
[0097]
对比数据子集分类器auc特异性灵敏度精确率准确度f1-分数chb/n测试子集svm0.9850.9050.9310.9310.9200.931chb/n验证队列svm0.9330.8670.8670.8670.8670.867lc/n测试子集svm1.0001.0001.0001.0001.0001.000
lc/n验证队列svm0.9780.8670.9330.8750.9000.903hcc/n测试子集svm1.0001.0001.0001.0001.0001.000hcc/n验证队列svm0.9820.7331.0000.8820.9110.938lc/chb测试子集svm0.9980.9661.0000.9670.9830.983lc/chb验证队列svm0.8840.9330.8670.9290.9000.897lc/chb验证队列afp0.5330.9330.1330.6670.5330.222lc/chb验证队列svm+afpna0.8670.8670.8670.8670.867hcc/chb测试子集svm0.9530.8280.9350.8960.8930.915hcc/chb验证队列svm0.8910.8670.8000.9230.8220.857hcc/chb验证队列afp0.7170.9330.5000.9380.6440.652hcc/chb验证队列svm+afpna0.8000.8670.8970.8440.881hcc/lc测试子集svm0.9660.9310.9570.9570.9470.957hcc/lc验证队列svm0.8180.6000.8330.8060.7560.820hcc/lc验证队列afp0.6830.8670.5000.8820.6220.638hcc/lc验证队列svm+afpna0.5330.9670.8060.8220.879
[0098]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种生物标志物或所述生物标志物的检测试剂在制备肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的产品中的应用，其特征在于，所述的生物标志物选自c7、anpep、iglv3-19、iglv1-40、qsox1、iglv3-27、a2m、ighv5-51、ighv4-34、igkv4-1、serpina3、habp2、lcat、rbp4、f10、orm1、c4bpb、pcyox1、cfhr2、cpn1、f2、vwf、hspg2、nrp1、ighv3-9、iglv1-47、igkv1-5、jchain、lum、pigr、igkv1-27、igkv1-16、ighv3-7、icam2、cd5l、tgfbi、igfbp2、fbln1、ighv5-10-1、igha1、lgals3bp、fgg、klkb1、cfb、cpn2、apoc1、clu、serpind1、c1s、lyve1、ighv2-26、fuca1、igkv1-8、f12、proz、igf1、apom、plg、igkv3-15、cfi、camp、sparc、pon3、thbs1、apoa2、masp2、fcn3、c3、gc、c4bpa、ppbp、itih4、c9、c4b、serpina1、afm、cpb2、f13b、c6、serpina10、hp、c5、f7、saa1、c2、agt、apcs、c1rl、mcam、cdh5、igkv3-20、ighv3-49、igkv2d-29、efemp1中的一种或多种。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肝病选自肝癌、病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝中的一种或多种；优选地，所述的肝病选自肝细胞癌、乙型肝炎或肝硬化中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物为基因或蛋白，特别是蛋白；和/或，所述的检测试剂包括检测所述生物标志物的含量或表达水平的试剂；和/或，所述的产品为试剂、试剂盒、试纸、基因芯片、蛋白芯片、高通量测序平台或蛋白质组学分析产品；和/或，所述的产品的检测样本为组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液或其级分，优选为血清。4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的方法包括：检测肝病患者的所述生物标志物的含量或表达水平，与健康人的所述生物标志物的含量或表达水平进行比较；或，检测不同的肝病患者的所述生物标志物的含量或表达水平并进行比较。5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物为c7、anpep、iglv3-19、iglv1-40、qsox1、iglv3-27、a2m、ighv5-51、ighv4-34、igkv4-1、serpina3、habp2、lcat、rbp4、f10、orm1、c4bpb、pcyox1、cfhr2、cpn1、f2的组合；和/或，所述的生物标志物为vwf、igkv4-1、hspg2、nrp1、c7、ighv3-9、iglv1-47、igkv1-5、jchain、lum、pigr、igkv1-27、igkv1-16、ighv3-7、icam2、cd5l、tgfbi、iglv3-27、igfbp2、fbln1、ighv5-51、ighv5-10-1、igha1、lgals3bp、fgg、klkb1、cfb、f10、cpn2、apoc1、clu、serpind1、c1s的组合；和/或，所述的生物标志物为anpep、igkv4-1、vwf、tgfbi、lyve1、pigr、ighv2-26、hspg2、fuca1、iglv1-40、igkv1-8、f12、proz、igf1、f10、apom、plg、apoc1的组合。6.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物为igkv4-1、hspg2、igha1、nrp1、lum、jchain、igfbp2、igkv3-15、ighv3-7、vwf、igkv1-8、cd5l、cfi、camp、clu、sparc、pon3、thbs1、cpn2、apoa2、masp2、fcn3、c3、gc、c4bpa、apoc1、ppbp、apom、plg的组合；和/或，所述的生物标志物为itih4、hspg2、c9、c4b、igfbp2、serpina1、serpina3、lum、proz、clu、plg、ppbp、afm、apoc1的组合；
和/或，所述的生物标志物为serpind1、cpb2、cpn2、rbp4、plg、f13b、c4bpa、c4bpb、klkb1、cpn1、c6、serpina10、hp、c5、sparc、gc、f7、c3、saa1、c2、agt、apcs、apom、c1rl、mcam、fbln1、igkv4-1、cdh5、iglv1-40、ighv4-34、igkv3-20、ighv3-49、igkv2d-29、hspg2、ighv5-51、cd5l、jchain、efemp1的组合。7.一种用于肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物选自c7、anpep、iglv3-19、iglv1-40、qsox1、iglv3-27、a2m、ighv5-51、ighv4-34、igkv4-1、serpina3、habp2、lcat、rbp4、f10、orm1、c4bpb、pcyox1、cfhr2、cpn1、f2、vwf、hspg2、nrp1、ighv3-9、iglv1-47、igkv1-5、jchain、lum、pigr、igkv1-27、igkv1-16、ighv3-7、icam2、cd5l、tgfbi、igfbp2、fbln1、ighv5-10-1、igha1、lgals3bp、fgg、klkb1、cfb、cpn2、apoc1、clu、serpind1、c1s、lyve1、ighv2-26、fuca1、igkv1-8、f12、proz、igf1、apom、plg、igkv3-15、cfi、camp、sparc、pon3、thbs1、apoa2、masp2、fcn3、c3、gc、c4bpa、ppbp、itih4、c9、c4b、serpina1、afm、cpb2、f13b、c6、serpina10、hp、c5、f7、saa1、c2、agt、apcs、c1rl、mcam、cdh5、igkv3-20、ighv3-49、igkv2d-29、efemp1中的一种或多种。8.根据权利要求7所述的生物标志物，其特征在于，所述的生物标志物为c7、anpep、iglv3-19、iglv1-40、qsox1、iglv3-27、a2m、ighv5-51、ighv4-34、igkv4-1、serpina3、habp2、lcat、rbp4、f10、orm1、c4bpb、pcyox1、cfhr2、cpn1、f2的组合；或，所述的生物标志物为vwf、igkv4-1、hspg2、nrp1、c7、ighv3-9、iglv1-47、igkv1-5、jchain、lum、pigr、igkv1-27、igkv1-16、ighv3-7、icam2、cd5l、tgfbi、iglv3-27、igfbp2、fbln1、ighv5-51、ighv5-10-1、igha1、lgals3bp、fgg、klkb1、cfb、f10、cpn2、apoc1、clu、serpind1、c1s的组合；或，所述的生物标志物为anpep、igkv4-1、vwf、tgfbi、lyve1、pigr、ighv2-26、hspg2、fuca1、iglv1-40、igkv1-8、f12、proz、igf1、f10、apom、plg、apoc1的组合；或，所述的生物标志物为igkv4-1、hspg2、igha1、nrp1、lum、jchain、igfbp2、igkv3-15、ighv3-7、vwf、igkv1-8、cd5l、cfi、camp、clu、sparc、pon3、thbs1、cpn2、apoa2、masp2、fcn3、c3、gc、c4bpa、apoc1、ppbp、apom、plg的组合；或，所述的生物标志物为itih4、hspg2、c9、c4b、igfbp2、serpina1、serpina3、lum、proz、clu、plg、ppbp、afm、apoc1的组合；或，所述的生物标志物为serpind1、cpb2、cpn2、rbp4、plg、f13b、c4bpa、c4bpb、klkb1、cpn1、c6、serpina10、hp、c5、sparc、gc、f7、c3、saa1、c2、agt、apcs、apom、c1rl、mcam、fbln1、igkv4-1、cdh5、iglv1-40、ighv4-34、igkv3-20、ighv3-49、igkv2d-29、hspg2、ighv5-51、cd5l、jchain、efemp1的组合。9.根据权利要求7或8所述的生物标志物，其特征在于，所述的肝病选自肝癌、病毒性肝炎、肝硬化、脂肪肝中的一种或多种；优选地，所述的肝病选自肝细胞癌、乙型肝炎或肝硬化中的一种或多种。10.一种肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的产品，其特征在于，所述产品中包含权利要求7-9任一项所述的生物标志物或所述的生物标志物的检测试剂。

技术总结
本发明提供一种生物标志物或所述生物标志物的检测试剂在制备肝病的诊断、预防、治疗、病情严重程度评估、疗效评估、预后、药物筛选的产品中的应用，所述生物标志物的灵敏度高、特异性高、准确度高。准确度高。准确度高。


技术研发人员：许萌 胡迪
受保护的技术使用者：旦生（北京）医学科技有限责任公司
技术研发日：2023.06.03
技术公布日：2023/10/15