一种血清中芳香族氨基酸的检测方法与流程

1.本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种血清中芳香族氨基酸的检测方法。


背景技术：

2.芳香族氨基酸（aaa）包括苯丙氨酸（phe）、酪氨酸（tyr）和色氨酸（trp）等。其中，苯丙氨酸、色氨酸是人体必需氨基酸，在生命活动中起着极为重要的作用。aaa的代谢情况在肝、肾、神经精神疾病等疾病诊断中也具有重大意义，因此定量分析血液中的aaa不仅在蛋白质化学和评价病人的营养状况方面十分重要，而且在多种疾病的诊断治疗以及在病因学的研究方面十分关键。
3.目前，临床测定aaa的方法有很多，包括高效液相色谱法（hplc）、毛细管电泳法（ce）、质谱法（ms）等等。其中hplc是分析aaa的常用方法。hplc-邻苯二甲醛（opa）衍生法作为经典方法的代表，其灵敏度高并且可以同时测定20多种氨基酸；但是样品前处理复杂，需梯度洗脱，衍生产物不稳定。此外，现有技术中，已有采用高效液相色谱-荧光法(hplc-fld)同时测定血清中三种aaa的个别报道，但是由于phe、tyr、trp的荧光特性不一致而不能在同一波长下同时进行3种aaa的测定，因此不能满足某些疾病的临床诊断与监测需要。


技术实现要素：

4.为解决上述技术难题，特提出本发明。
5.首先，本发明提供了一种芳香族氨基酸的检测方法，包括：（1）将待测样本与偏磷酸混合，分离获得上清液；（2）采用等度洗脱反相色谱法联合紫外法检测所述上清液；其中，等度洗脱反相色谱法的检测条件包括：色谱柱为cn柱；流动相为体积比为1：18~22的甲醇和乙酸水的混合液；所述乙酸水中，乙酸占水的体积百分含量为0.05%~0.2%。
6.本发明发现，选择偏磷酸作为蛋白沉淀剂时，待测样本前处理用时短且沉淀效果好，而且使得上清液的ph在cn柱可接受范围内，能够保护cn柱、提高cn柱的使用寿命，同时使得上清液在上述优化后的高效液相色谱检测条件下，获得的aaa色谱图中杂质少，峰形好，响应高，从而大幅度提高了检测方法的准确度，实现在同一紫外检测波长下准确测定多种aaa。
7.优选地，所述乙酸水中，乙酸占水的体积百分含量为0.08%~0.15%。
8.优选地，紫外法的检测波长为210~278nm。
9.本发明进一步发现，选择210~278nm的检测波长时，本发明的检测方法能够在同一紫外波长下实现对苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸的准确测定，使得三种aaa的检测准确性和线性范围等指标均较好。
10.优选地，紫外法的检测波长为210~230nm。
11.在上述检测波长时，能够使得三种aaa的检测准确性和线性范围等指标更好。
12.优选地，紫外法的检测波长为215nm。
13.优选地，待测样本与偏磷酸混合后的混合液中，偏磷酸的浓度为40~60mg/ml。
14.优选地，待测样品与偏磷酸溶液的体积比为（1~2）：（1~3）。
15.优选地，将待测样本与偏磷酸混合后，振荡提取3~15min，分离获得上清液。
16.在上述振荡时间下，使得蛋白沉淀剂对待测样本的沉淀效果更佳。
17.优选地，取40~60μl所述上清液进行所述检测。
18.优选地，所述流动相的流速为0.5~1 ml/min。
19.优选地，色谱柱的柱温为35~45℃，更优选为38~42℃。
20.优选地，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸。
21.优选地，步骤（2）的检测时间为11min以内；更优选为10min之内。
22.所述步骤（2）的检测时间为从进样开始到出现苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的三个吸收峰的时间。
23.优选地，所述检测方法无需柱前和柱后衍生。
24.优选地，采用3%~8%的牛血清白蛋白（bsa）配制标准样品和/或质控样品。
25.一方面能够提高标准曲线和质控样品的准确性及可靠性；另一方面由于牛血清白蛋白易获得性，还可进一步降低检测成本。
26.在一些实施方案中，所述检测方法还包括建立标准曲线。
27.优选地，采用外标法建立标准曲线。
28.本发明中的待测样本包括但不限于血清。
29.本领域技术人员可以进一步通过对上述优选方案进行组合，以得到其它的较优实施方案。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明的检测方法前处理操作简单，用时短，无需柱前、柱后衍生，在同一紫外吸收波长下采用等度洗脱方式即可在11分钟内同时测定血清中多种aaa含量，该方法具有快速、准确、高通量、灵敏度高、结果稳定、检测成本低等优点。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1是实施例1的液相色谱图。
具体实施方式
33.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
35.下述实施例中溶液的配制方法如下：储备液的配制方法：准确称取phe10.0mg、tyr10.0mg、trp10.0mg，用0.1mol/l的盐酸水溶液溶解并稀释至10ml，分别配制成6154μmol/l、5519μmol/l、4896μmol/l的标准储备液，分装后置于-20℃冰箱中备用。
36.标准工作溶液配制：精密吸取一定体积5%bsa置于2ml的ep管中，再分别依次精密吸取一定体积的phe标准储备液、tyr标准储备液和trp标准储备液置于该ep管中，涡旋10s混匀，得到浓度为307.7μmol/l的phe、276.0μmol/l的tyr和244.8μmol/l的trp混合标准工作溶液，命名为标准工作溶液s7。将标准工作溶液s7用5%bsa稀释成系列标准工作溶液s1、s2、s3、s4、s5、s6，s1-s7中phe、tyr和trp的浓度分别为3.08、6.15、12.31、30.77、61.54、123.08和307.7μmol/l；2.76、5.52、11.04、27.6、55.2、110.4和276.0μmol/l；以及2.45、4.90、9.79、24.48、48.96、97.92和244.8μmol/l。
37.蛋白沉淀剂配制：准确称取偏磷酸10g，用纯水溶解并稀释至100ml，配制成浓度为100mg/ml的偏磷酸溶液。
38.实施例1
39.本实施例提供了一种血清中芳香族氨基酸的检测方法，步骤如下：（1）待测样本预处理：取200μl试验样品溶液加入到等体积的100mg/ml偏磷酸中，以1500rpm振荡5min，随后4000rpm/min离心10分钟，移取上清液200μl，采用高效液相色谱结合紫外检测器进行检测，进样量为50μl；（2）通过高效液相色谱-紫外法测定经预处理后的样品溶液，高效液相色谱采用等度洗脱反相色谱法建立待测物的分离条件如下：以甲醇-水-乙酸为流动相体系，流动相为甲醇-乙酸水体积比为1：19的混合溶液，乙酸水中的乙酸的含量为0.1%，流动相的流速为0.8ml/min，色谱柱为xselect hss cyano (cn)柱，柱温设定为40℃，紫外检测波长为215nm。
40.检测结果如图1所示，tyr、phe和trp的保留时间分别为5.3min、5.9min和9.5min。
41.进一步，对上述检测方法进行方法学评价。
42.1、标准曲线建立采用外标法建立标准曲线，结果如表1所示，phe在3.08~307.7μmol/l的线性范围内，tyr在2.76~276μmol/l，trp在2.45~244.8μmol/l的线性范围内，线性相关性良好，相关系数r分别为0.9999、0.9981和0.9999，准确度范围分别为95.3% ~102.0%、88.6% ~106.7%和96.5% ~102.2%。
43.表1标准曲线结果
44.2、回收率实验将混合血清样品2.4 ml分为3组，第1组加入80μl 0.1mol/l盐酸水溶液作为基础样品，第2、3组分别加入一定量aaa混合标样使phe、tyr和trp在血清中的浓度分别为12.31和246.16μmol/l、11.04和220.80μmol/l、9.79和195.84μmol/l，每组平行测定三次，取其平均值计算回收率。
45.结果如表2所示，phe、tyr和trp的回收率分别为98.4%、97.8%和96.2%。
46.表2回收率结果
47.以上结果表明，本发明的检测方法的回收率良好。
48.对比例1
49.本对比例提供了一种芳香族氨基酸的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：将乙酸水替换为纯水。
50.对比例2
51.本对比例提供了一种芳香族氨基酸的检测方法，步骤仅与实施例1不同的是：将偏磷酸替换为相同浓度的高氯酸。
52.效果例1
53.采用同一待测样本，比较实施例1和对比例1的检测结果，如表3所示。
54.表3 实施例1和对比例1的检测结果对比
55.由表3可知，实施例1中流动相采用乙酸水时，色氨酸保留时间往后移，与杂峰分离度更好，拖尾峰得到明显改善。
56.效果例2
57.参照实施例1的回收率实验方法，比较实施例1和对比例2的回收率测试结果，如表4所示。
58.表4 回收率结果比较
59.结果表明，使用偏磷酸作为蛋白沉淀剂时，aaa回收率有明显提高。
60.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种芳香族氨基酸的检测方法，其特征在于，包括：（1）将待测样本与偏磷酸混合，分离获得上清液；（2）采用等度洗脱反相色谱法联合紫外法检测所述上清液；其中，等度洗脱反相色谱法的检测条件包括：色谱柱为cn柱；流动相为体积比为1：18~22的甲醇和乙酸水的混合液；所述乙酸水中，乙酸占水的体积百分含量为0.05%~0.2%。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，待测样本与偏磷酸混合后的混合液中，偏磷酸的浓度为40~60mg/ml。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，将待测样本与偏磷酸混合后，振荡提取3~15min，分离获得上清液。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，取40~60μl所述上清液进行所述检测。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.5~1 ml/min。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，色谱柱的柱温为35~45℃。7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，紫外法的检测波长为210~278nm。8.根据权利要求1~7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述芳香族氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸。9.根据权利要求1~7中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）的检测时间为11min以内。10.根据权利要求1~7中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法无需柱前和柱后衍生。

技术总结
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种血清中芳香族氨基酸的检测方法。该检测方法包括：将待测样本与偏磷酸混合，分离获得上清液；然后采用等度洗脱反相色谱法联合紫外法检测所述上清液。本发明的检测方法前处理操作简单，用时短，无需柱前、柱后衍生，在同一紫外吸收波长下采用等度洗脱方式即可在11分钟内同时测定血清中多种芳香族氨基酸的含量，该方法具有快速、准确、高通量、灵敏度高、结果稳定、检测成本低等优点。测成本低等优点。测成本低等优点。


技术研发人员：张新星 赵炽娜 栗琳 周立 丁亮 郑佳 宋兆晴 薛元强
受保护的技术使用者：江苏豪思睦可生物科技有限公司 武汉豪思医学检验实验室有限公司 湖南豪思生物科技有限公司
技术研发日：2023.09.06
技术公布日：2023/10/15