促组织细胞增生重编程因子制剂及用途的制作方法

1.本技术涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种促组织细胞增生重编程因子制剂及用途。


背景技术：

2.心力衰竭的治疗是临床重大未满足需求，在过去的20年中，心力衰竭的病人的伤残率和死亡率显著上升，至今缺乏改变心力衰竭病程的疗法，所以如何发现新的有效治疗方法是本世纪的医学的最重大的使命之一。
3.心肌细胞的丢失和/或功能的丧失是心力衰竭的病理基础，冠状动脉搭桥和原位心脏移植近年对心力衰竭的治疗提供了新的方法，但是治疗后心脏纤维化和供体严重不足，限制了其临床应用。
4.新出现的心脏细胞移植方法，可以给受损的心脏补充新的有收缩功能的心肌细胞从而可以改善受损心脏的功能，但是心肌细胞为终端分化细胞，成年心肌细胞完全丧失了分裂能力，所以上述的心脏细胞移植的方法由于无法提供足够的有收缩能力的心肌细胞，其临床应用受到很大的限制。
5.此外，心脏基因治疗的领域正在进展，但其尚未在临床上广泛的应用。目前，最为广泛使用基因治疗是通过病毒载体，特别是腺相关病毒(aav)载体实现的。在过去的几十年中，使用腺病毒、相关腺病毒(aav)、慢病毒和dna质粒将兴趣基因导入心肌细胞中。aav和腺病毒都具有高的心肌转染水平，而慢病毒和dna质粒心肌的转染效率低。但是腺病毒可以引起强烈的免疫反应很难临床应用，所以aav为目前心脏基因治疗的基本唯一合适选项。然而，aav在心脏中的药代动力学(从第4天开始表达并且保持至少11个月)可能导致心肌不受控制的生长、肥厚性心肌病和心力衰竭。而且，超过60％的健康人类个体具有针对aav衣壳的中和抗体，其可有效中和通过该方法传递的基因表达，这些缺点限制了aav在心脏基因治疗中的应用。更为严重的是：通过aav递送目标蛋白可能会出现对aav产生严重的免疫反应(过敏)。
6.目前，亟待提出一种新的无基因组整合风险的心脏基因治疗药物。


技术实现要素：

7.鉴于以上问题，本技术实施例提供一种电路、芯片及电子设备，以解决上述技术问题。
8.第一方面，本技术实施例提供一种促组织细胞增生重编程因子制剂，包括7～8摩尔份的编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、2～4摩尔份的编码oct4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码sox2转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码klf4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及1摩尔份的编码lin28转录因子的mrna核酸分子。
9.可选地，包括7～8摩尔份的编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、3摩尔份
的编码oct4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码sox2转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码klf4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及1摩尔份的编码lin28转录因子的mrna核酸分子。
10.可选地，所述促组织细胞增生重编程因子制剂还包括第一溶剂，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为0～15mmol/l，所述第一溶剂中氯化钠的浓度为120～140mmol/l。
11.可选地，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为10mmol/l、氯化钠的浓度为130mmol/l以及蔗糖的浓度为0～0.1g/ml，所述第一溶剂的ph值为7.5；
12.或，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为10mmol/l、氯化钠的浓度为130mmol/l以及磷酸二氢钠的浓度为0～2mmol/l，所述第一溶剂的ph值为7.5。
13.5.根据权利要求1所述的促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，每个所述mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、对应转录因子mrna的编码序列或甲病毒属突变型复制酶mrna的编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列。
14.可选地，所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中部分或全部的核苷酸进行了能够提高所述mrna核酸分子在生物体内稳定性的化学修饰。
15.可选地，所述化学修饰包括利用5-甲基胞嘧啶置换所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子和所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中100％的胞嘧啶，以及利用n1-甲基假尿苷置换所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子和所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中100％的尿嘧啶。
16.可选地，所述突变型复制酶产生nsp2区域的第259位的突变以及nsp2区域的第650位的突变，所述nsp2区域的第259位的突变为丝氨酸s突变为脯氨酸p，所述nsp2区域的第650位的突变精氨酸r突变为天冬氨酸d。
17.第二方面，本技术实施例提供一种上述的促组织细胞增生重编程因子制剂在促进心肌细胞增生或在制备心脏基因治疗药物中的用途。
18.第三方面，本技术实施例提供一种上述的促组织细胞增生重编程因子制剂在促进软骨细胞增生或在制备骨关节修复药物中的用途。。
19.本技术实施例提供的促组织细胞增生重编程因子制剂及用途，包括7～8摩尔份的编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、2～4摩尔份的编码oct4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码sox2转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码klf4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及1摩尔份的编码lin28转录因子的mrna核酸分子；通过上述方式，调整表达复制酶的mrna以及不同的转录因子的mrna核酸分子的摩尔配比，形成了特异性的促组织细胞增生重编程因子制剂，在心肌导入上述的重编程因子制剂后，合成了甲病毒属突变型复制酶，通过甲病毒属突变型复制酶实现上述
各转录因子的合成，能够促使心肌细胞进入细胞分裂及增加心肌细胞数，进而改善受损心脏的心脏功能，特别是改善急性心脏损伤的心脏功能；同时，避免心肌细胞的不受控制的增长，避免出现肥厚性心肌病及心力衰竭。
20.本技术的这些方面或其他方面在以下实施例的描述中会更加简明易懂。
附图说明
21.图1示出了本技术实施例3的荧光素强度随注射时间变化的对比图。
22.图2示出了本技术实施例3的荧光素强度的柱状对比图。
23.图3示出了本技术实施例4的实验现场对比图。
24.图4示出了本技术实施例4的耐受强制电击跑步机心肌梗塞小鼠的比例对比图。
25.图5示出了本技术实施例4的耐受强制电击跑步机时间对比图。
26.图6示出了本技术实施例4的强制电击跑步机距离对比图。
27.图7示出了本技术实施例4的心肌梗塞后瘢痕面积对比图。
28.图8示出了本技术实施例4的心肌细胞的增生对比图。
29.图9示出了本技术实施例4的保护心肌效果对比图。
30.图10示出了本技术实施例5和实施例6中不同实验组表达对比图。
31.图11示出了本技术实施例5和实施例6中不同实验组骨关节腔表达变化对比图。
32.图12示出了本技术实施例5和实施例6中不同实验组ifn-a变化对比图。
33.图13示出了本技术实施例7的软骨厚度显微镜对比图。
34.图14示出了本技术实施例7的软骨厚度检测结果对比图。
35.图15示出了本技术实施例8的不同比例重编程因子组合对心肌治疗疗效评估结果图。
具体实施方式
36.下面详细描述本技术的实施方式，实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性地，仅用于解释本技术，而不能理解为对本技术的限制。
37.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术的方案，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
38.本技术实施例中，需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。
39.而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
40.在本技术实施例的描述中，“示例”或“例如”等词语用于表示举例、说明或描述。本技术实施例中描述为“举例”或“例如”的任何实施例或设计方案均不解释为比另一实施例或设计方案更优选或具有更多优点。使用“示例”或“例如”等词语旨在以清晰的方式呈现相对概念。
41.另外，本技术实施例中的“多个”是指两个或两个以上，鉴于此，本技术实施例中也可以将“多个”理解为“至少两个”。“至少一个”，可理解为一个或多个，例如理解为一个、两个或更多个。例如，包括至少一个，是指包括一个、两个或更多个，而且不限制包括的是哪几个，例如，包括a、b和c中的至少一个，那么包括的可以是a、b、c、a和b、a和c、b和c、或a和b和c。
42.需要说明的是，本技术实施例中，“和/或”描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。另外，字符“/”，如无特殊说明，一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
43.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
44.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
45.本技术一实施例提供了一种促组织细胞增生重编程因子制剂，包括7～8摩尔份的编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、2～4摩尔份的编码oct4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码sox2转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码klf4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及1摩尔份的编码lin28转录因子的mrna核酸分子。
46.在本实施例中，通过调整表达不同的转录因子的mrna核酸分子的摩尔配比，形成了特异性的促组织细胞增生重编程因子制剂，在心肌导入上述的重编程因子制剂后，合成了甲病毒属突变型复制酶，通过甲病毒属突变型复制酶实现上述各转录因子的合成，能够促使心肌细胞进入细胞分裂及增加心肌细胞数，进而改善受损心脏的心脏功能，特别是改善急性心脏损伤的心脏功能；同时，避免心肌细胞的不受控制的增长，避免出现肥厚性心肌病及心力衰竭。
47.作为一种实施方式，该促组织细胞增生重编程因子制剂包括7～8摩尔份的编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、3摩尔份的编码oct4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码sox2转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码klf4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及1摩尔份的编码lin28转录因子的mrna核酸分子。
48.作为一种实施方式，该促组织细胞增生重编程因子制剂还包括第一溶剂，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为0～15mmol/l，所述第一溶剂中氯化钠的浓度为120～140mmol/l。上述的编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、编码oct4转录因子的mrna核酸分子、编码sox2转录因子的mrna核酸分子、编码klf4转录因子的mrna核酸分子、编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及编码lin28转录因子的mrna核酸分子溶解于第一溶剂中，第一溶剂可以由柠檬酸盐和生理盐水配置形成。
49.在本实施方式中，通过第一溶剂可以使各mrna核酸分子不易降解。
50.在一些实施方式中，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为10mmol/l、氯化钠的浓度为130mmol/l以及蔗糖的浓度为0～0.1g/ml，所述第一溶剂的ph值为7.5；
51.在一些实施方式中，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为10mmol/l、氯化钠的浓度为130mmol/l以及磷酸二氢钠的浓度为0～2mmol/l，所述第一溶剂的ph值为7.5。
52.在一些实施方式中，第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为10mmol/l、氯化钠的浓度为130mmol/l、磷酸二氢钠的浓度为0～2mmol/l以及蔗糖的浓度为0～0.1g/ml，所述第一溶剂的ph值为7.5。
53.作为一种实施方式，每个mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、对应转录因子mrna的编码序列或甲病毒属突变型复制酶mrna的编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列。
54.具体地，编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、甲病毒属突变型复制酶mrna编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列；编码oct4转录因子的mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、oct4转录因子的mrna编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列；编码sox2转录因子的mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、sox2转录因子的mrna编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列；编码klf4转录因子的mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、klf4转录因子的mrna编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列；编码glis1转录因子的mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、glis1转录因子的mrna编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列；编码lin28转录因子的mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、lin28转录因子的mrna编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列。
55.作为一种实施方式，所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中部分或全部的核苷酸进行了能够提高所述mrna核酸分子在生物体内稳定性的化学修饰。
56.在一些实施方式中，所述化学修饰包括利用5-甲基胞嘧啶置换所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子和所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中100％的胞嘧啶，以及利用n1-甲基假尿苷置换所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子和所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中100％的尿嘧啶。
57.作为一种实施方式，所述突变型复制酶产生nsp2区域的第259位的突变以及nsp2区域的第650位的突变，所述nsp2区域的第259位的突变为丝氨酸s突变为脯氨酸p，所述nsp2区域的第650位的突变精氨酸r突变为天冬氨酸d。
58.在本实施方式中，在心肌导入上述的重编程因子制剂后，合成了甲病毒属突变型复制酶，通过甲病毒属突变型复制酶实现上述各转录因子的合成，能够实现各转录因子的有限自我复制，避免心肌细胞的不受控制的增长，避免出现肥厚性心肌病及心力衰竭，提高了重编程因子制剂的安全性。
59.在其他实施方式中，上述的重编程因子制剂也可以不包括编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子，可以利用心肌细胞中的复制酶合成各转录因子。
60.本技术一实施例还提供了上述的促组织细胞增生重编程因子制剂在促进心肌细
胞增生或在制备心脏基因治疗药物中的用途。
61.其中，利用心肌肌肉内注射方法导入该重编程因子制剂，并通过机体心脏本身细胞产生表达各重编程因子，从而启动表观遗传学部分重编程，心肌细胞得到表观遗传表达被重新调整，使得心肌细胞的表观遗传学状态逆转而更接近年轻状态，从而快速促进受损心脏的修复和功能改善。
62.本技术一实施例还提供了上述的促组织细胞增生重编程因子制剂在促进软骨细胞增生或在制备骨关节修复药物中的用途。
63.其中，本技术的发明人意外发现该重编程因子制剂可以在骨关节腔、皮肤和肌肉内高效表达，可以恢复受损软骨的再生。
64.实施例1：促组织细胞增生重编程因子制剂的制备
65.a)制备编码甲病毒属突变型复制酶的mrna
66.步骤一、利用genearttm gibson hifi reaction(美国thermo fisher，a46624)合成突变型复制酶dna编码序列(编码甲病毒属突变型复制酶的dna核酸分子且不含多聚腺苷酸序列)，合成成功后将该突变型复制酶dna编码序列克隆于pcdna3.3载体质粒中以备工业化生产。
67.1.1突变型复制酶dna编码序列：5’非翻译区dna序列(seq id no.9)、突变型复制酶编码序列、3’非翻译区dna序列(seq id no.10)，其中，突变型复制酶编码序列分为nsp1区域片段(seq id no.3)、nsp2区域片段(seq id no.4)、nsp3区域片段(seq id no.5)、nsp4区域片段(seq id no.6)四个dna片段，四个dna片段均为经过修饰后的高gc含量片段。四个dna片段以gblock形式直接订购于美国idt公司。
68.具体包括如下步骤：按照表1组装gibson反应，在pcr仪器中50℃反应60分钟，获得pcr产物。
69.表1 gibson反应体系
[0070][0071]
[0072]
1.2将pcr产物转化one shottm top10化学感受态大肠杆菌细胞，具体包括如下步骤：
[0073]
用无核酸酶水按照1:5稀释上述gibson反应体系(pcr产物)，12μl无核酸酶水和3μlgibson反应体系，混匀，冰上反应；
[0074]
将1μl稀释液加入one shottm top10化学感受态大肠杆菌细胞中并混合，转化混合物在冰上孵育20～30分钟；
[0075]
将细胞在42℃孵育30秒，不要摇晃；
[0076]
立即将反应管转移到冰上并在冰上孵育2分钟；
[0077]
加入450μl室温s.o.c.培养液(美国life technology)；
[0078]
37℃下以300rpm摇动1小时；
[0079]
取100μl，涂细菌培养板(100μg/ml ampicillin or 50μg/ml kanamycin.)；
[0080]
37℃度过夜，挑选细菌克隆，37℃摇菌，一代测序挑选含正确序列的双突变复制酶序列质粒。
[0081]
步骤二、通过pcr添加mrna的poly-(a)尾巴得到复制酶mrna的dna合成模版
[0082]
其中，poly-(a)尾巴包括120个腺苷酸。
[0083]
按照表2制备pcr预混液(总体积为200μl，八个反应各25μl)；
[0084]
表2pcr预混液的组成
[0085][0086][0087]
按照表3所示反应条件进行pcr反应；
[0088]
表3 pcr反应条件
[0089]
循环次数变性退火扩展195℃,2
–
3min
ꢀꢀ
2-3198℃,20s60℃,15s72℃,60s3272℃,3min
ꢀꢀ
[0090]
通过凝胶电泳检查pcr产物的质量；
[0091]
切胶回收pcr产物(qiaquick pcr purification kit,qiagen,cat.no.28106)，将尾模板的最终浓度调整为100ng/μl，作为体外转录合成编码复制酶mrna的dna合成模版。
[0092]
步骤三、体外转录合成编码复制酶mrna
[0093]
1、按照表4组装mrna帽结构和核苷酸混合物：
[0094]
帽子结构3
′‑
o-me-m7g(5
′
)ppp(5
′
)g rna cap analog(new england biolabs,cat.no.s1411s),-methylcytidine-5
′‑
triphosphate(me-ctp；trilink,cat.no.n1014)，n1-methyl-pseudo-utp(trilink,cat.no.n1019)，其他组分均来自megascript t7试剂盒(ambion,cat.no.am1334)。
[0095]
表4 mrna帽结构和核苷酸混合物
[0096][0097][0098]
2、按照表5组装编码复制酶mrna体外转录体系：
[0099]
表5编码复制酶mrna体外转录体系
[0100]
组分用量(ml)终浓度dnase/rnase-free water1.2 custom ntp(from last step)14.8 tailed pcr product,100ug/μl1640ng/μlt7 buffer,10x((from megascript t7 kit)4.01xt7 enzyme mix,10
×
(from megascript t7 kit)4.01x
[0101]
3、将反应置于pcr仪器在37℃孵育3～6h。
[0102]
4、向每个样品中添加2μl turbo dnase(来自megascript t7试剂盒,ambion,cat.no.am1334)。
[0103]
5、轻轻混合并在37℃下孵育15min。
[0104]
6、使用megaclear试剂盒(ambion,cat.no.am1908)，纯化经过dnase和rnaa seiii处理的反应；用总共100μl的洗脱缓冲液洗脱修饰的mrna(50μl的洗脱缓冲液洗脱两次)。
[0105]
7、使用磷酸酶(antarctic phosphatase(new england biolabs,cat.no.m0289s)处理纯化的修饰mrna。
[0106]
8、向每个样品(～100μl)中，添加11μl 10
×
磷酸酶缓冲液，然后添加2μl磷酸酶；轻轻混合样品并在37℃下孵育0.5～1h。
[0107]
9、洗脱后，在nanodrop分光光度计中测量修饰的编码复制酶mrna的浓度。预期的总产量应为～50ug(30～70ug范围；一次40μl ivt反应的100μl洗脱体积为300～700ngμl)。
通过添加洗脱缓冲液或te缓冲液(ph 7.0)，将浓度调节至100ng/μl，或者fplc提纯。
[0108]
b)制备各编码转录因子mrna
[0109]
编码转录因子mrna的合成步骤与编码复制酶mrna类似，包括如下步骤：
[0110]
步骤一、利用genearttm gibson hifi reaction(美国thermo fisher，a46624)合成特异性修饰的目标因子dna编码序列(编码转录因子mrna的核酸分子不含多聚腺苷酸序列)；
[0111]
其中，特异性修饰的目标因子dna编码序列：5’非翻译区dna序列(seq id no.9)、复制酶5’端特异性dna序列(seq id no.7)、目标因子dna编码序列(请参见表6)、复制酶3’端特异性dna序列(seq id no.8)、3’非翻译区dna序列(seq id no.10)。
[0112]
步骤二、通过pcr在特异性修饰的目标因子dna编码序列上添加mrna的poly-(a)尾巴得到编码转录因子mrna的dna合成模版；
[0113]
步骤三、体外转录合成编码转录因子mrna。
[0114]
按照上述方法分别合成表6所示的5种编码转录因子mrna。
[0115]
表6不同编码转录因子mrna的dna合成模版
[0116][0117]
c)编码甲病毒属突变型复制酶的mrna、编码oct4转录因子的mrna、编码sox2转录因子的mrna、编码klf4转录因子的mrna、编码glis1转录因子的mrna以及编码lin28转录因子的mrna的摩尔比为7:3:1:1:1:1，溶解于第一溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，0.15g/ml蔗糖无核酸酶蒸馏水，ph7.5)中。
[0118]
实施例2：制备不同的编码荧光蛋白的mrna
[0119]
编码荧光蛋白mrna的合成步骤与编码复制酶mrna类似，包括如下步骤：
[0120]
步骤一、利用genearttm gibson hifi reaction(美国thermo fisher，a46624)合成特异性修饰的荧光蛋白dna编码序列(编码荧光蛋白mrna的核酸分子不含多聚腺苷酸序列)；
[0121]
其中，特异性修饰的荧光蛋白dna编码序列：5’非翻译区dna序列(seq id no.9)、
复制酶5’端特异性dna序列(seq id no.7)、目标荧光蛋白dna编码序列(请参见表7)、复制酶3’端特异性dna序列(seq id no.8)、3’非翻译区dna序列(seq id no.10)。
[0122]
步骤二、通过pcr在特异性修饰的目标荧光蛋白dna编码序列上添加mrna的poly-(a)尾巴得到编码荧光蛋白mrna的dna合成模版；
[0123]
步骤三、体外转录合成编码荧光蛋白mrna。
[0124]
按照上述方法分别合成表7所示的2种编码转录因子mrna。
[0125]
表7不同的编码荧光蛋白的mrna的dna合成模版
[0126][0127]
实施例2-egfp蛋白mrna制剂：编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码egfp蛋白的mrna，溶解于第一溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，0.15g/ml蔗糖无核酸酶蒸馏水，ph7.5)中。
[0128]
实施例2-萤火虫荧光素蛋白mrna制剂：编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码萤火虫荧光素蛋白的mrna，溶解于第一溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，0.15g/ml蔗糖无核酸酶蒸馏水，ph7.5)中。
[0129]
对比例1：普通萤火虫荧光素蛋白mrna制剂
[0130]
编码egfp蛋白的mrna溶解于第一溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，0.15g/ml蔗糖无核酸酶蒸馏水，ph7.5)中。
[0131]
对比例2：空mrna制剂
[0132]
第一溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，0.15g/ml蔗糖无核酸酶蒸馏水，ph7.5)。
[0133]
对比例3：编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码萤火虫荧光素蛋白的mrna，溶解于生理盐水中。
[0134]
对比例4：编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码萤火虫荧光素蛋白的mrna，溶解于第二溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，ph7.5)中。
[0135]
对比例5：
[0136]
编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码萤火虫荧光素蛋白的mrna，溶剂在磷酸钙溶液中。
[0137]
对比例6：
[0138]
编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码萤火虫荧光素蛋白的mrna，溶解在rnaimax转染试剂(life technologies)中。
[0139]
对比例7：
[0140]
编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码萤火虫荧光素蛋白的mrna，溶解在invivo jetpei转染试剂(polyplus)中。
[0141]
对比例8：
[0142]
编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码萤火虫荧光素蛋白的mrna，溶解在mc3纳米脂质体(cayman chem)中。
[0143]
对比例9：
[0144]
编码vegfa蛋白mrna的合成步骤与编码复制酶mrna类似，包括如下步骤：
[0145]
步骤一、利用genearttm gibson hifi reaction(美国thermo fisher，a46624)合成特异性修饰的vegfa蛋白dna编码序列(编码vegfa蛋白mrna的核酸分子不含多聚腺苷酸序列)；
[0146]
其中，特异性修饰的vegfa蛋白dna编码序列：5’非翻译区dna序列(seq id no.9)、复制酶5’端特异性dna序列(seq id no.7)、vegfa蛋白dna编码序列、复制酶3’端特异性dna序列(seq id no.8)、3’非翻译区dna序列(seq id no.10)。
[0147]
步骤二、通过pcr在特异性修饰的vegfa蛋白dna编码序列上添加mrna的poly-(a)尾巴得到编码vegfa蛋白mrna的dna合成模版；
[0148]
步骤三、体外转录合成编码vegfa蛋白mrna。
[0149]
制剂包括编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码vegfa蛋白的mrna，溶解于第一溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，0.15g/ml蔗糖无核酸酶蒸馏水，ph7.5)中。
[0150]
对比例10：
[0151]
编码甲病毒属突变型复制酶的mrna、编码oct4转录因子的mrna、编码sox2转录因子的mrna、编码klf4转录因子的mrna、编码glis1转录因子的mrna以及编码lin28转录因子的mrna的摩尔比为7:1:1:1:1:1，溶解于第一溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，0.15g/ml蔗糖无核酸酶蒸馏水，ph7.5)中。
[0152]
对比例11：
[0153]
编码甲病毒属突变型复制酶的mrna、编码oct4转录因子的mrna、编码sox2转录因子的mrna、编码klf4转录因子的mrna、编码glis1转录因子的mrna以及编码lin28转录因子的mrna的摩尔比为7:0.5:1:1:1:1，溶解于第一溶剂(10mmol/l柠檬酸盐，130mmol/l氯化钠，0.15g/ml蔗糖无核酸酶蒸馏水，ph7.5)中。
[0154]
对比例12：
[0155]
编码甲病毒属突变型复制酶的mrna以及编码egfp蛋白的mrna，溶解在mc3纳米脂质体(cayman chem)中。
[0156]
实施例3：表达成像实验
[0157]
小鼠心脏特异报告基因绿色荧光蛋白(egfp)或萤火虫荧光素蛋白的mrna制剂心肌内注射验证，萤火虫荧光蛋白(luci)mrna制剂的表达通过ivis成像仪进行表达定量检测，具体步骤如下，暴露小鼠左侧胸部区域，切口胸腔，显露心脏，分为9个实验组，9个实验组在小鼠左侧心室游离侧心肌内分别注射上述实施例2的报告基因修饰性mrna制剂，对比例1的普通萤火虫荧光素蛋白mrna制剂、对比例2的空mrna制剂、对比例3的制剂、对比例4的制剂、对比例5的mrna纳米脂质体颗粒rnaimax递送制剂，对比例6的rnaimax递送制剂，对比
例7的invivo jetpei递送制剂，对比例8的mc3纳米脂质体，对比例5至对比例8分别按厂家说明书进行有限自我复制m rna心肌内注射递送。
[0158]
实验结果及分析：
[0159]
请参阅图1和图2所示，本技术实施例2的萤火虫荧光素蛋白mrna制剂心肌内高效表达，如图1所示，实施例2的单次有限自我复制萤火虫荧光素蛋白mrna制剂表达的峰值的时间为注射后480小时，萤火虫荧光素蛋白表达的持续的时间为注射后1300小时，与对比例1的普通火虫荧光素mrna制剂相比，实施例2的表达的峰值和持续时间都显著性提高。
[0160]
如图2所示，实施例2的制剂对比其他制剂成分(对比例3至对比例8)报告基因有限自我复制mrna表达最高，在心脏肌肉注射应用中非脂质体递送报告基因有限自我复制mrna对比脂质体递送报告基因mrna表达显著性增高。
[0161]
请参阅图12所示，实施例2的制剂心脏心肌内注射后，与对比例8的制剂相比，实施例2的制剂注射24小时后检测小鼠血清的ifn-a无明显升高，说明实施例2的mrna制剂对比mc3纳米颗粒无免疫反应。
[0162]
实施例4：心肌治疗效果评估实验
[0163]
小鼠心脏冠状动脉左前降支结扎心肌梗塞模型建立和实施例1的制剂治疗及疗效评估。具体步骤如下：
[0164]
1，小鼠心脏冠状动脉左前降支结扎心肌梗塞模型建立：选择适合的c57小鼠，异氟醚麻醉，在手术开始前，对小鼠的胸部进行体表消毒，通过在小鼠的胸部进行中线切口，用手术剪刀或剥离器小心地暴露出心脏，使用显微外科技术和放大镜，找到小鼠心脏的左前降支(left anterior descending artery)，并用可吸收线将其结扎，结扎的位置位于冠状动脉近心脏的位置，这会导致左心室下部心肌缺血和梗死，将小鼠心脏冠状动脉左前降支结扎心肌梗塞模型分为4个实验组，4个实验组分别将实施例1的重编程因子mrna制剂，实施例2的egfp蛋白mrna制剂，对比例2的制剂，对比例9的制剂在心肌缺血和梗死的区域多点(2-3点)心肌内注射后，将小鼠的胸骨和胸肌缝合，确保创口牢固封闭。第5个实验组(假手术组)采用假手术的健康小鼠，将实施例1的重编程因子mrna制剂在心肌区域多点(2-3点)心肌内注射后，将小鼠的胸骨和胸肌缝合，确保创口牢固封闭。
[0165]
2，强制点击跑步机分别评估实施例1的重编程因子mrna制剂、实施例2的egfp蛋白mrna制剂，对比例2的制剂，对比例9的制剂、假手术组治疗后心脏功能改善，跑步机未启动，待测小鼠休息和适应30min，10％坡度，按5m/min速度启动速度每5min增加5m/min,直到25m/min，总时间36.8min，总距离507.4m，评估小鼠耐受跑步机比例，坚持时间，跑行的距离。
[0166]
3，上述五个实验组(实施例1的重编程因子mrna制剂、实施例2的egfp蛋白mrna制剂，对比例2的制剂，对比例9的制剂、假手术组)心脏梗塞后纤维化染色，将小鼠心脏取出并进行4％pfa固定，将固定的心脏进行脱水和浸渍，以便在切片前使其能够被切割。使用逐渐升级的醇浓度(如70％、80％、95％、100％)进行脱水处理，然后将心脏浸泡在适当的组织包埋剂中(如蜡或冻结介质)，将包埋的心脏切割成薄片，通常为4-8微米的厚度。使用显微切片机或切片刀片进行切割。将切片转移到玻璃载玻片上，将心脏切片浸泡在picrosirius red染料中，然后用酸性溶液洗去多余染料，最后，使用显微镜观察切片，胶原纤维呈红色或橙色，image j定量纤维化范围和比例。
[0167]
实验结果及分析：
[0168]
图3至图9所示，本技术的mrna制剂快速表达重编程因子改善受损心脏功能，如图3至图7所示，通过强制电击跑步机评估小鼠心脏冠状动脉左前降支结扎心脏心肌梗塞模型进行实施例1的重编程因子mrna制剂治疗效果评估，对比实施例2的报告基因处理组，实施例1的重编程因子mrna制剂治疗心肌梗塞后心脏功能明显提高；请参阅图4所示，实施例1的制剂比实施例2的制剂表现在耐受强制电击跑步机心肌梗塞小鼠的比例明显升高；请参阅图5所示，实施例1的制剂比实施例2的制剂耐受强制电击跑步机时间明显延长；请参阅图6所示，实施例1的制剂比实施例2的制剂强制电击跑步机距离明显延长；请参阅图7所示，实施例1的制剂比实施例2的制剂心肌梗塞后瘢痕面积明显缩小。
[0169]
请参阅图8，对比实施例2的报告基因mrna制剂和对比例9的vegfa mrna制剂组处理，实施例1的重编程因子mrna制剂处理组，心肌细胞增生指标ki67表达明显上调，而实施例2的报告基因mrna制剂和对比例9的vegfa mrna制剂组对心肌细胞的增生没有影响。
[0170]
请参阅图9所示，实施例2的报告基因mrna制剂和对比例9的vegfa mrna制剂组处理，实施例1的重编程因子mrna制剂处理组，心肌损伤指标ctnt表达无明显变化，说明实施例1的重编程因子mrna制剂通过促进心肌细胞增生而发挥保护作用而不是通过保护心肌细胞而实现，而实施例2的对比报告基因mrna制剂组以及对比例9的vegfa蛋白mrna制剂组对心肌损伤指标ctnt明显改善，显示对比例9的vegfa mrna制剂保护心肌的效果。
[0171]
实施例5：
[0172]
小鼠内皮肤内注射实施例2的egfp蛋白mrna制剂，取相应的实施例2的egfp蛋白mrna注射到皮肤内即表皮和真皮之间后，相应的时间点，小动物成像仪测定荧光强度。
[0173]
小鼠内皮肤内注射对比例12的egfp蛋白mrna制剂，取相应的对比例12的egfp蛋白mrna制剂注射到皮肤内即表皮和真皮之间后，相应的时间点，小动物成像仪测定荧光强度。
[0174]
实施例6：
[0175]
小鼠肌肉内进行实施例2的egfp蛋白mrna制剂注射，取相应的实施例2的egfp蛋白mrna注射到小鼠后腿肌肉内后，相应的时间点，小动物成像仪测定荧光强度。
[0176]
小鼠肌肉内进行对比例12的egfp蛋白mrna制剂注射，取相应的对比例12的egfp蛋白mrna注射到小鼠后腿肌肉内后，相应的时间点，小动物成像仪测定荧光强度。
[0177]
实验结果及分析：
[0178]
请参阅图10至图12所示，本技术实施例2的mrna制剂在皮肤，肌肉及骨关节腔高效表达。
[0179]
如图10所示，实施例2的egfp蛋白mrna制剂可以在小鼠皮肤内注射后3小时后(a，对应实施例5)和肌肉内注射3小时后(b，对应实施例6)快速而高效表达。请参阅图11所示，实施例2的egfp蛋白mrna制剂在骨关节腔内快速而高效表达，24小时表达显著，96小时仍然高效表达；对比例12的egfp蛋白mrna制剂的24小时有较弱的表达，96小时即没有表达；说明实施例2的mrna制剂与对比例12的制剂相比，高度有利。
[0180]
实施例7：
[0181]
骨关节腔进行实施例2的egfp蛋白mrna制剂注射，碘乙酸软骨损伤后进行实施例1的重编程因子mrna制剂骨关节腔注射恢复软骨再生。选择sd大鼠，异氟醚麻醉，在手术开始前，对大鼠的手术区域进行皮肤消毒，使用手术刀小心地切开大鼠的皮肤，分离软组织暴露
膝关节或软骨，使用细小的针尖或显微钳在软骨表面创建多个刺激点，碘乙酸溶液应用于软骨损伤区域，将小鼠分为两个实验组，两个实验组分别将实施例1的重编程因子mrna制剂及实施例2的egfp蛋白mrna制剂注射在受损的软骨组织后软组织和皮肤缝合，确保创口牢固封闭，5周后取软骨组织并行肉桂酸橙g染色he染色。第三个实验组采用(假手术组)采用假手术的健康小鼠，将实施例1的重编程因子mrna制剂注射在软骨组织，5周后取软骨组织并行肉桂酸橙g染色he染色。
[0182]
具体步骤：
[0183]
1,固定软骨组织：将要研究的软骨组织取下，并使用4％pfa固定剂固定组织。
[0184]
2,嵌包：将固定的软骨组织进行脱水处理，以便将其嵌入石蜡中。逐渐将软骨组织置于递增浓度的脱水醇中(70％、95％、100％乙醇)，每一浓度保持5分钟时间以确保充分脱水。然后，将组织浸入透明剂苯胶中，使其透明化。
[0185]
3，嵌包软骨组织：将透明化的软骨组织置于熔化的石蜡中，并使其固化成石蜡块。
[0186]
4，切片：使用组织切片机将软骨石蜡块切成非常薄的切片，厚度在5微米。
[0187]
5，脱脂：将软骨切片浸入脱脂剂中，去除切片中的石蜡，以便后续染色。
[0188]
6，肉桂酸橙g染色：将脱脂后的软骨切片置于肉桂酸橙g染色溶液中，染色时间5分钟。
[0189]
7，清洗：将染色后的切片进行适当的清洗，以去除多余的染料。
[0190]
8，脱水和封片：逐渐将软骨切片浸入递减浓度的脱水醇中，然后转移到透明剂中，最后将其覆盖在玻璃载玻片上，并用封片剂覆盖切片，使其密封。
[0191]
9，显微镜观察：显微镜下软骨呈红色，细胞核和胶原纤维呈蓝色，摄像并he染色：首先，需要获得经过4％pfa固定和包埋的组织切片经过脱水和包埋过程，最终得到切片；去蜡脱水：将蜡块的切片浸入去蜡剂xylene中，以去除蜡质。
[0192]
水洗：将去蜡的切片在流动自来水下洗涤，以彻底去除去蜡剂残留。染色：将切片依次浸入染色剂中，首先是血红素染剂(hematoxylin)，它染色细胞核和细胞核周围的物质。然后将切片转移到酸性酒红(eosin)溶液中，它染色胞浆和细胞外基质。
[0193]
脱水：将染色好的切片依次浸入不同浓度的醇中(如70％醇、95％醇和绝对醇)，以脱水切片。清洁剂处理：将切片浸入适当的清洁剂中，例如xylene或其他清洁剂，以去除醇并使切片透明。封片：将切片置于适当的介质中，如玻璃片和覆盖玻片之间的透明封片剂(如mounting medium)，然后用玻片盖片盖好。
[0194]
完成上述步骤后，切片准备就绪。使用显微镜，可以通过he染色的切片观察细胞核的染色情况(呈蓝色或紫色)，胞浆和细胞外基质的染色情况(呈粉红色)，image j软件进行软骨的厚度定量,用graphpad prism软件进行统计和数据输出。
[0195]
实验结果及分析：
[0196]
如图13和图14所示，本技术实施例1的重编程因子mrna制剂在大鼠骨关节腔高效表达恢复受损软骨再生。碘乙酸破坏软骨模型(骨关节炎模式)建立成功后，对比实施例2的gfp mrna制剂治疗组(图13中b)，硅酸橙g染色提示实施例1的重编程因子mrna制剂显著增加软骨的厚度，实现碘乙酸破坏软骨后修复(图13中c)，基本恢复到正常水平(图13中a)。请参阅图14所示，为image j定量输出对应组大鼠软骨厚度的结果对比，结果同显微镜下观察一致。
[0197]
实施例8：不同比例重编程因子组合对心肌治疗疗效评估
[0198]
本实施例分为六个实验组：
[0199]
实验组1(空制剂处理组)：采用对比例2的制剂；
[0200]
实验组2(egfp mrna制剂处理组)：采用实施例2的egfp蛋白mrna制剂；
[0201]
实验组3(vegf mrna制剂处理组)：采用对比例9的制剂；
[0202]
实验组4(oskgl(3:1:1:1:1)mrna制剂处理组)：采用实施例1的制剂；
[0203]
实验组5(oskgl(1:1:1:1:1)mrna制剂处理组)：采用对比例10的制剂；
[0204]
实验组6(oskgl(1:1:1:1:1)mrna制剂处理组)：采用对比例11的制剂；
[0205]
如实施例4建立小鼠心脏冠状动脉左前降支结扎心肌梗塞模型，采用不同实验组进行治疗，在对应时间点进行horvath表观时钟检测(https://horvath.genetics.ucla.edu/html/dnamage/)和如实施例4进行心脏梗塞后纤维化染色，image j评估心脏梗塞后疤痕的大小。
[0206]
实验结果及分析：如图15所示，实验组4对比实验组2，实验组1，实验组5，实验组6，明显降低horvath表观年龄，明显缩小心脏梗塞后疤痕的面积。以上所述的仅是本技术的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本技术的保护范围。

技术特征：
1.一种促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，包括7～8摩尔份的编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、2～4摩尔份的编码oct4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码sox2转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码klf4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及1摩尔份的编码lin28转录因子的mrna核酸分子。2.根据权利要求1所述的促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，包括7～8摩尔份的编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、3摩尔份的编码oct4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码sox2转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码klf4转录因子的mrna核酸分子、1摩尔份的编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及1摩尔份的编码lin28转录因子的mrna核酸分子。3.根据权利要求1所述的促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，所述促组织细胞增生重编程因子制剂还包括第一溶剂，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为0～15mmol/l，所述第一溶剂中氯化钠的浓度为120～140mmol/l。4.根据权利要求3所述的促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为10mmol/l、氯化钠的浓度为130mmol/l以及蔗糖的浓度为0～0.1g/ml，所述第一溶剂的ph值为7.5；或，所述第一溶剂中柠檬酸盐的浓度为10mmol/l、氯化钠的浓度为130mmol/l以及磷酸二氢钠的浓度为0～2mmol/l，所述第一溶剂的ph值为7.5。5.根据权利要求1所述的促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，每个所述mrna核酸分子包括5’帽结构、5’utr序列、对应转录因子mrna的编码序列或甲病毒属突变型复制酶mrna的编码序列、3’utr序列和多聚腺苷酸序列。6.根据权利要求1所述的促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子以及所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中部分或全部的核苷酸进行了能够提高所述mrna核酸分子在生物体内稳定性的化学修饰。7.根据权利要求6所述的促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，所述化学修饰包括利用5-甲基胞嘧啶置换所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子和所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中100％的胞嘧啶，以及利用n1-甲基假尿苷置换所述编码甲病毒属突变型复制酶的mrna核酸分子、所述编码oct4转录因子的mrna核酸分子、所述编码sox2转录因子的mrna核酸分子、所述编码klf4转录因子的mrna核酸分子、所述编码glis1转录因子的mrna核酸分子和所述编码lin28转录因子的mrna核酸分子中100％的尿嘧啶。8.根据权利要求1所述的促组织细胞增生重编程因子制剂，其特征在于，所述突变型复制酶产生nsp2区域的第259位的突变以及nsp2区域的第650位的突变，所述nsp2区域的第259位的突变为丝氨酸s突变为脯氨酸p，所述nsp2区域的第650位的突变精氨酸r突变为天冬氨酸d。9.如权利要求1～8中任一项所述的促组织细胞增生重编程因子制剂在促进心肌细胞
增生或在制备心脏基因治疗药物中的用途。10.如权利要求1～8中任一项所述的促组织细胞增生重编程因子制剂在促进软骨细胞增生或在制备骨关节修复药物中的用途。

技术总结
本申请实施例提供的促组织细胞增生重编程因子制剂及用途，包括编码甲病毒属突变型复制酶的mRNA、编码Oct4转录因子的mRNA、编码Sox2转录因子的mRNA、编码Klf4转录因子的mRNA、编码Glis1转录因子的mRNA以及编码Lin28转录因子的mRNA；通过上述方式，调整表达复制酶的mRNA以及不同的转录因子的mRNA核酸分子的摩尔配比，在心肌导入上述的重编程因子制剂后，通过甲病毒属突变型复制酶实现各转录因子的合成，能够促使心肌细胞进入细胞分裂及增加心肌细胞数，改善受损心脏的心脏功能，特别是改善急性心脏损伤的心脏功能；同时，避免心肌细胞的不受控制的增长，避免出现肥厚性心肌病及心力衰竭。及心力衰竭。及心力衰竭。


技术研发人员：王刚 于寅 盛强龙 杨帆
受保护的技术使用者：臻赫医药（杭州）有限公司
技术研发日：2023.08.15
技术公布日：2023/10/15