用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体miRNA及获得方法和应用

用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna及获得方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体涉及用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna及获得方法和应用。


背景技术：

2.巨噬细胞是一种功能性可塑性细胞，在体内发挥清除细胞垃圾、病原体和异物等重要作用。根据激活方式和分泌因子的不同，巨噬细胞主要分为经典激活(m1)和替代激活(m2)两种亚型。m1型巨噬细胞表面高表达cd80、cd86分子，分泌促炎因子如白细胞介素-6(il-6)、肿瘤坏死因子α(tnf-α)等，参与病原体清除过程，加速细胞外基质降解和细胞凋亡，具有很强的促炎和抗肿瘤生长能力；m2型巨噬细胞表面高表达arg-1、ym-1分子，通过分泌免疫抑制性细胞因子il-10、转化生长因子β(tgf-β)等发挥免疫调节作用，参与组织损伤后调节炎症消退阶段，促进伤口愈合和组织修复，促进肿瘤的发生发展。因此，调节巨噬细胞极化状态是一种重要的免疫治疗策略，可用于调节炎症反应和免疫应答，并用于治疗多种癌症、自身免疫性疾病、心血管疾病等。事实上，巨噬细胞m1型与m2型的转化平衡是免疫应答的th1与th2之间的平衡，这种平衡维持体内稳态平衡，而不平衡则诱发慢性炎症和疾病。已有研究证实巨噬细胞的极化状态的改变是多数炎症发病的重要机制，而诱导m1型巨噬细胞向m2型巨噬细胞转化将成为多数炎症的潜在治疗靶点。
3.目前，临床上应用于巨噬细胞极化调节的药物包括一些激动剂和抑制剂，还有一些天然成分和化学物质，如多酚类化合物和芳香化合物等。普鲁卡因酰胺(pru)是一种5-ht4受体激动剂，具有促进m2型巨噬细胞极化的作用，也能提高腹腔巨噬细胞的m2型极化状态；此外，pru还具有治疗便秘和肠胃疾病的作用；但是，pru在未知酶的水平上也会增加生长因子释放和趋化因子，并可能存在一定的心血管副作用等缺点。自噬抑制剂(cq)是一种能够抑制自噬过程的药物，也能够抑制m1型巨噬细胞极化状态的发生；cq通过减少ros和nf-κb的产生来促进巨噬细胞极化状态的转化；但cq可能会导致药物耐药性和负面心脏副作用等问题。因此，需要寻找一种绿色、安全、有效的巨噬细胞极化调节剂，在炎症治疗中具有重要的应用前景。
4.外泌体是目前研究的一个热点，尤其是外泌体中的mirna。外泌体是一类由细胞分泌的携带胞质组分的纳米级别的膜性小泡，机体各种各样的细胞都能分泌这类膜性小泡。而mirna是一类长度约18～24个核苷酸(nt)的内源性小rnas，不可编码蛋白质，但可通过转录后调控影响基因表达。mirna可以通过抑制翻译和诱导mrna降解来抑制基因的表达。此外，外泌体还具有性质稳定、易于获取、生物安全性高等特点。目前，植物外泌体样纳米颗粒(pelns)中的rna主要为mrnas、mirnas、长非编码rnas、小分子rnas(srnas)。这些小rnas在裸露状态极易被环境中的核糖核酸酶(rnase)降解，而进入pelns后可保持高度的稳定性，并随外泌体的转移到达目标组织或细胞，发挥生物活性，这也是pelns具有跨界调控功能的分子基础之一。虽然已有不少外泌体及其相关mirna被报道可缓解炎症，但目前关于茶叶外
泌体样纳米颗粒及其相关mirna介导巨噬细胞极化从而缓解炎症的研究尚未见报道。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna及获得方法和应用。
6.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
7.本发明提供一种用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna，所述茶叶外泌体mirna为osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3p中任意一种。
8.作为本发明的进一步优化方案，所述茶叶外泌体mirna从新鲜茶叶中获取。
9.一种用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna的获得方法，具体步骤为：
10.步骤一、采用梯度离心法将经过滤后的新鲜茶叶榨汁进行提纯获得茶叶外泌体样纳米颗粒；
11.步骤二、利用small rna测序筛选茶叶外泌体样纳米颗粒中差异表达的mirna；
12.步骤三、步骤二筛选出的差异表达mirna中筛选出用于调节巨噬细胞极化的候选mirna，按照其成熟序列体外合成相应模拟物，将模拟物转染至炎症巨噬细胞模型中共孵育，评估候选mirna调控巨噬细胞极化的潜力、治疗炎症的潜力，根据分析结果筛选获得用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna。
13.一种用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna在制备治疗炎症药物中的应用，所述茶叶外泌体mirna通过调节巨噬细胞极化以缓解和治疗炎症。
14.作为本发明的进一步优化方案，所述osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3以茶叶外泌体样纳米颗粒为载体。
15.一种巨噬细胞极化调节剂，包含用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna，具体为osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3p中任意一种。
16.作为本发明的进一步优化方案，所述osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3p可通过负向调控机制，促进m1型巨噬细胞向m2型方向分化。
17.本发明提具有如下有益效果：
18.1)本发明发现osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3p中任意一种茶叶外泌体mirna，均可以通过调控巨噬细胞极化进而缓解和治疗炎症，为植物来源的外泌体在炎症治疗中以巨噬细胞为调控靶点提供一定的理论依据；
19.2)本发明中茶叶外泌体mirna以茶叶外泌体样纳米颗粒为载体，基于茶叶具有来源广泛、获取便捷、成本低等优势，提取茶叶外泌体样纳米颗粒，外泌体作为生物活性分子或药物的纳米载体具有先天优势，避免了人工合成的脂质体、高分子等材料带来的细胞毒性等问题，相比传统药物治疗，生物安全性更高，同时，外泌体更易于储存和运输，因此，茶叶外泌体样纳米颗粒非常适宜临床转化应用，mirna可以人工合成，成本低，可以实现大规模的生产；
20.3)本发明研究发现osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3p可通过负向调控机制，促进m1型巨噬细胞向m2型方向分化，为今后基于osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3p的基于巨噬细胞极化调控炎症提供了研究基础。
附图说明
21.图1是透射电镜观察茶叶外泌体样纳米颗粒的形态图(a)和茶叶外泌体样纳米颗粒对raw264.7细胞的细胞毒性测试图(b)。
22.图2是利用全转录组测序在茶叶组(tea)与茶叶外泌体样纳米颗粒组(tenps)比较中筛选出外泌体mirna的差异表达火山图。
23.图3是茶叶外泌体中上调mirna的go富集中生物过程(biological process，bp)、细胞组分(cellular component，cc)、分子功能(molecular function，mf)的分析结果图(a)和茶叶外泌体中上调mirna的kegg富集分析结果图(b)。
24.图4是根据预测的mirna构建出mirna-gene-pathway相关网络示意图。
25.图5是采用rt-qpcr技术检测分析巨噬细胞表面标志物表达水平情况图。
26.图6是采用rt-qpcr技术检测分析相关炎症因子基因表达水平情况图。
27.图7是采用elisa技术检测分析相关炎症因子的蛋白表达水平情况图。
具体实施方式
28.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
29.1、材料
30.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
31.2、方法
32.2.1茶叶外泌体样纳米颗粒(tenps)的分离纯化及其表征
33.2.1.1将100g新鲜茶叶洗净后放入榨汁机，加入1
×
pbs200ml，榨取的新鲜茶叶汁用纱布过滤去除残渣，重复过滤两次后分装于50ml离心管中；在4℃下梯度离心，6000g离心60min，8000g离心60min，12000g离心60min，18000g离心60min；按照外泌体提取纯化试剂盒(ur52121)说明书的要求，取30ml上清液加入7.5ml的聚乙二醇，振荡混匀，在4℃冰箱里孵育120min；孵育完毕的混合液，4℃，18000g离心60min；利用1
×
pbs悬浮沉淀，通过450μm滤头过滤，进一步将滤液置于纯化柱中，4℃，18000g离心10min，所得纯化液即为提取所得的tenps；
34.2.1.2取10μl步骤2.1.1中所得的tenps滴于洁净的石蜡膜上，用有碳涂层的铜网正面吸附样品，约5min后，取走铜网，用滤纸吸干铜网表面残留液滴，用磷钨酸染色1min，自然晾干后利用透射电镜观察外泌体的形态和大小，如图1(a)所示，tem结果显示分离的tenps具有典型的外泌体结构。
35.为了验证步骤2.1.1中所得tenps是否具有细胞毒性，我们将不同蛋白浓度的tenps作用于raw264.7细胞，通过mtt试剂盒检测细胞活力来评估tenps的细胞毒性，测试结果如图1(b)所示，小于100μg/ml的tenps对细胞没有任何毒性。
36.2.2利用small rna测序筛选茶叶外泌体样纳米颗粒中差异表达的mirna
37.根据步骤2.1.1制备的tenps，委托商业机构novogene对tenps中srna进行提取、文库构建、测序；具体而言，利用agilent 2100pic600对rna的数量及碎片的分布进行了准确
的测量，样品检测合格后，使用small rna sample pre kit构建文库，并对待测序样本添加测序接头，然后用pcr扩增得到cdna文库。
38.将tenps中长度筛选后的srna定位到茶叶的参考序列上得到mapped srna，然后与mirbase数据库中所有植物的mirna序列进行比对匹配，对于一些在现有数据库中没有匹配上的srna，我们通过mirevo和mirdeep2软件预测，得到了161个新的前体mirna和145个成熟体mirna，预测得到novel mirna的情况如表1所示：
39.表1预测的novel mirna及各样本srna与之比对情况统计表
40.typestotaltenps-1tenps-2tenps-3tea-1tea-2tea-3mapped mature145127125119133130127mapped star58242930423434mapped hairpin161142140134150149148mapped uniq srna51597878737731033852841mapped total srna63738792010212876215458119139473
41.初步筛选：根据mirna的预测结果，对mirna进表达量(counts)的统计，并采用基于负二项分布的deseq2进行分析，差异表达mirna筛选条件为：padj《0.01&|log2(foldchange)|》1，结果表明：总共193个差异表达mirna，其中，上调表达mirna有106个，下调表达mirna有87个，具体如图2所示。
42.火山图(volcano plot)是一类用来展示组间差异数据的图像，常见于rna表达谱和芯片的数据分析，在本发明中，用于分析mirna的差异表达。
43.2.3筛选用于调节巨噬细胞极化的候选mirna
44.根据步骤2.2筛选的差异表达mirna进行聚类分析，结果表示差异表达mirna在不同实验条件下，高表达与低表达mirna在组内重复实验中保持相对均匀的表达模式，揭示出这些同类mirna可能具有相似的功能，然后利用miranda和rnahybrid两个软件对分析得到的已知novel mirna进行靶基因预测，最终结果取两个软件的交集，得到mirna和靶基因间的对应关系，部分结果如表2所示：
45.表2部分mirna靶基因预测
46.[0047][0048]
go数据库的全称是gene ontology(基因本体)，该数据库把基因的功能分成了三个部分，分别是：生物过程(biological proces，bp)、细胞组分(cellular component，cc)、分子功能(molecular function，mf)；本发明中，通过对上调mirna的靶基因进行go分析，可以找到上调mirna的靶基因的go分类条目，寻找不同样品的差异mirna可能和哪些基因功能的改变有关。
[0049]
本发明基于go数据库对上调mirna的靶基因进行功能富集分析，结果表明，在生物过程层面，靶基因与多种分子调控和代谢过程相关，比如初级代谢过程、转录过程、生物组分形成过程。在细胞组分方面，靶基因富集于细胞器的形成和代谢过程，如细胞局部化、代谢过程、细胞组分的组织和细胞运输等方面。在分子功能方面，靶基因富集于蛋白质结合、催化活性、小分子结合、酶结合、离子结合、核苷酸结合等方面，如图3(a)所示。
[0050]
kegg(kyoto encyclopedia of genes and genomes)数据库是关于pathway的主要公共数据库。通过获取数据库资源，可以检测kegg通路中失调基因的富集统计情况。本发明中，用于对上调mirna的靶基因进行通路富集。
[0051]
基于kegg公共数据库对上调mirna的靶基因进行通路富集，从kegg富集结果可知，上调mirna靶基因在多种代谢、免疫、炎症过程中都有显著富集。特别是其中富集到了结肠炎(ibd)相关的通路，揭示出tenps中特异性mirna对于炎症的潜在调控作用。如图3(b)所示。
[0052]
为了进一步证实tenps的炎症调控作用与功能性mirna之间的关联，我们根据富集结果，筛选出了与炎症关联最密切的三条通路：nf kappa b signaling pathway；pi3k akt signaling pathway；toll-like receptor signaling pathway。选定每条通路中与炎症发生相关的关键基因，然后构建出mirna-gene-pathway相关网络示意图，如图4所示，直观展现出tenps中关键mirna(用于调节巨噬细胞极化的候选mirna)在炎症进展过程中的可能存在的调控作用。
[0053]
2.4候选mirna促进m1巨噬细胞向m2细胞极化
[0054]
根据步骤2.3筛选出的候选mirna，按照其成熟序列体外合成相应模拟物(mirna mimic)，将模拟物转染至炎症巨噬细胞模型中共孵育，评估tenps中候选mirna调控巨噬细胞极化的潜力。分组如下：对照组、模型组、osa-mir 166d-5p组、gma-mir 396a-3p组。运用实时荧光定量pcr技术检测分析巨噬细胞表面标志物和相关炎症因子在上述几组中的相对表达水平。运用elisa技术检测分析相关炎症因子的蛋白在上述几组中的相对表达水平。
[0055]
候选mirna的rt-qpcr检测方法如下：
[0056]
(1)总rna提取
[0057]
利用trizol试剂进行各组raw264.7细胞中总rna的提取；
[0058]
(2)逆转录反应
[0059]
采用primer-script
tm rt-pcr kit试剂盒，具体逆转录体系及条件如表3所示：
[0060]
表3逆转录反应体系及条件
[0061][0062]
(3)rt-qpcr反应
[0063]
采用sybr premix ex taq
tm
试剂盒，反应体系及条件如表4所示：
[0064]
表4rt-pcr反应体系及条件
[0065][0066][0067]
所述检测巨噬细胞表面标志物的引物包括：
[0068]
用于检测mincle的引物分别如seq id no：1-2所示；
[0069]
用于检测cd206的引物分别如seq id no：3-4所示；
[0070]
用于检测irf-4的引物分别如seq id no：5-6所示；
[0071]
用于检测irf-5的引物分别如seq id no：7-8所示；
[0072]
用于检测内参基因gapdh的引物分别如seq id no：9-10所示。
[0073]
上述引物序列见表5：
[0074]
表5引物序列信息
[0075]
序列编号引物名称引物序列(5'-3')seq id no:1mincle-faccaaatcgcctgcatccseq id no:2mincle-rcacttgggagtttttgaagcaseq id no:3cd206-fcctatgaaaattgggcttacgg
seq id no:4cd206-rctgacaaatccagttgttgaggseq id no:5irf-4-faggtcctgctgagtttcggagaseq id no:6irf-4-rtcctccgaggcgttaatgtggtseq id no:7irf-5-fatctacgaggtctgctccaaseq id no:8irf-5-rcaggctctgtgatgctcagseq id no:9gadph-faggtcggtgtgaacggatttgseq id no:10gadph-rggggtcgttgatggcaaca
[0076]
巨噬细胞表面标志物表达水平变化结果：根据步骤(1)-(3)对巨噬细胞表面标志物的相对表达水平检测。根据各标志物、内参gadph的ct值，利用相对定量公式2-δδct计算分析相对表达量的倍数变化。
[0077]
结果表明，对比control组，模型组m1型表面标志物表达水平升高，m2型表面标志物表达水平降低。当预测的不同mirna的mimic转染巨噬细胞后，m1型表面标志物mincle、irf-5表达水平显著降低；与之对应，m2型表面标志物cd206、irf-4表达水平显著升高；结果如图5所示。
[0078]
2.5候选mirna通过调节巨噬细胞极化治疗炎症
[0079]
根据步骤2.3筛选出的候选mirna，按照其成熟序列体外合成相应模拟物(mirna mimic)，将模拟物转染至巨噬细胞模型中共孵育，评估tenps中候选mirna治疗炎症的潜力。分组如下：对照组、模型组、osa-mir 166d-5p组、gma-mir 396a-3p组。运用实时荧光定量pcr技术检测分析相关炎症因子在上述几组中的相对表达水平。运用elisa技术检测分析相关炎症因子的蛋白在上述几组中的相对表达水平。
[0080]
候选mirna的rt-qpcr检测体系如下：
[0081]
(1)总rna提取
[0082]
利用trizol试剂进行各组raw264.7细胞中总rna的提取
[0083]
(2)逆转录反应
[0084]
采用primer-script
tm rt-pcr kit试剂盒，具体逆转录体系及条件如表3所示；
[0085]
(3)rt-qpcr反应
[0086]
采用sybr premix ex taq
tm
试剂盒，反应体系及条件如表4所示；
[0087]
所述检测相关炎症因子的引物包括：
[0088]
用于检测il-6的引物分别如seq id no：11-12所示；
[0089]
用于检测arg-1的引物分别如seq id no：13-14所示；
[0090]
上述引物序列见表6：
[0091]
表6引物序列信息
[0092]
序列编号引物名称引物序列(5'-3')seq id no:11il-6-faatttcctctggtcttctggagtseq id no:12il-6-rgtgactccagcttatctcttggtseq id no:13arg-1-fcagaagaatggaagagtcagseq id no:14arg-1-rcagatatgcagggagtcacc
[0093]
巨噬细胞相关炎症因子mrna水平变化结果：根据步骤(1)-(3)测定对炎症因子的相对表达水平检测，利用相对定量公式2-δδct计算分析相对表达量的倍数变化。
[0094]
结果表明，当候选不同mirna的mimic转染巨噬细胞后，促炎因子il-6等表达水平显著降低；与之对应，免疫抑制性细胞因子arg-1等表达水平显著升高；结果如图6所示。
[0095]
巨噬细胞相关炎症因子的蛋白表达水平变化结果：结果表明，当不同mirna的mimic转染巨噬细胞后，m1型巨噬细胞分泌的促炎因子il-6的蛋白表达水平出现不同程度的降低，与之对应，m2型巨噬细胞分泌的免疫抑制性细胞因子arg-1的蛋白表达水平出现不同程度的升高；如图7所示。
[0096]
通过上述实验，表明茶叶外泌体样纳米颗粒及其相关mirna(用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna)可以通过调控巨噬细胞极化进而缓解和治疗炎症，为植物来源的外泌体在炎症治疗中以巨噬细胞为调控靶点提供一定的理论依据。
[0097]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna，其特征在于：所述茶叶外泌体mirna为osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3p中任意一种。2.根据权利要求1所述的用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna，其特征在于：所述茶叶外泌体mirna从新鲜茶叶中获取。3.一种如权利要求1-2任一所述的用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna的获得方法，其特征在于：具体步骤为：步骤一、采用梯度离心法将经过滤后的新鲜茶叶榨汁进行提纯获得茶叶外泌体样纳米颗粒；步骤二、利用small rna测序筛选茶叶外泌体样纳米颗粒中差异表达的mirna；步骤三、从步骤二筛选出的差异表达mirna中筛选出用于调节巨噬细胞极化的候选mirna，按照其成熟序列体外合成相应模拟物，将模拟物转染至炎症巨噬细胞模型中共孵育，评估候选mirna调控巨噬细胞极化的潜力、治疗炎症的潜力，根据分析结果筛选获得用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna。4.一种如权利要求1-2任一所述的用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna在制备治疗炎症药物中的应用，其特征在于：所述茶叶外泌体mirna通过调节巨噬细胞极化以缓解和治疗炎症。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3以茶叶外泌体样纳米颗粒为载体。6.一种巨噬细胞极化调节剂，其特征在于：包含权利要求1-2任一所述的用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体mirna，具体为osa-mir 166d-5p、gma-mir 396a-3p中任意一种。7.根据权利要求6所述的巨噬细胞极化调节剂，其特征在于：所述osa-mir166d-5p、gma-mir 396a-3p可通过负向调控机制，促进m1型巨噬细胞向m2型方向分化。

技术总结
本发明公开了一种用于调节巨噬细胞极化的茶叶外泌体miRNA及获得方法和应用，所述茶叶外泌体miRNA为osa-miR 166d-5p、gma-miR 396a-3p中任意一种，所述茶叶外泌体miRNA从新鲜茶叶中获取。本发明发现osa-miR 166d-5p、gma-miR 396a-3p中任意一种茶叶外泌体miRNA，均可通过调控巨噬细胞极化进而缓解和治疗炎症，为植物来源的外泌体在炎症治疗中以巨噬细胞为调控靶点提供一定的理论依据，茶叶外泌体miRNA以茶叶外泌体样纳米颗粒为载体，基于茶叶具有来源广泛、获取便捷、成本低等优势，提取茶叶外泌体样纳米颗粒，外泌体作为生物活性分子或药物的纳米载体具有先天优势，避免了人工合成的脂质体、高分子等材料带来的细胞毒性等问题，相比传统药物治疗，生物安全性更高。生物安全性更高。生物安全性更高。


技术研发人员：郑磊 侯林海 颜玲
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：2023.08.14
技术公布日：2023/10/19