用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基及金耳原种制作方法

1.本发明涉及金耳菌种技术领域，具体而言涉及一种用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基及金耳原种制作方法。


背景技术：

2.金耳(学名：naematelia aurantialba(bandoni&m.zang)millanes&wedin)是耳包革科、耳包革属真菌。金耳菌种是由金耳菌丝和毛韧革菌丝两种组合构成，是二型菌丝结合体。金耳含有丰富脂肪，蛋白质和磷、硫、锰、铁、镁、钙、钾等微量元素，是一种营养滋补品，并可作为药用。
3.金耳菌种制作一般包括母种活化、原种制作、栽培种扩繁三个步骤，现有技术中大多沿用传统方式的固体制种进行原种的制作，一般过程为：采用木屑、麦麸、玉米面、稻壳、棉籽壳、白糖等以不同比例混合装袋并灭菌，再接入母种，并在18-25℃的温度下培养，使菌丝长满培养瓶，吃透培养基，菌丝扭结形成白色肉质原基，原基直径达4-5cm后用作原种。
4.但是因为固体菌种利用木屑等原料，菌丝吃透培养基并长满菌种袋需要一定时间，菌丝较慢的生长速度使原种制作周期可长达45-50天，从而导致金耳菌种制作周期长。


技术实现要素：

5.本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基及金耳原种制作方法，通过对传统金耳原种制作步骤进行改变，将金耳原种从使用固体种转变为使用液体发酵种，极大程度的降低了金耳原种制作成本，缩短了金耳原种制作周期，进而缩短了金耳栽培种制作周期。
6.本发明第一方面涉及一种用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基，包括一级发酵液体培养基、二级发酵液体培养基和发酵罐液体培养基；
7.所述一级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉5-10g，豆粨粉0-5g，葡萄糖10-15g，蛋白胨1-3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg；
8.所述二级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉5-10g，豆粨粉0-5g，葡萄糖10-15g，蛋白胨1-3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g；
9.所述发酵罐液体培养基是在所述一级发酵液体培养基中加入重量百分比为1.5％-2.0％的木屑粉。
10.在可选的实施方式中，所述一级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉10g，葡萄糖15g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg。
11.在可选的实施方式中，所述一级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉5g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素
b110mg。
12.在可选的实施方式中，所述一级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉10g，豆粨粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg。
13.本发明第二方面涉及一种高海拔地区金耳原种制作的方法，包括以下步骤：
14.s1、将金耳固体母种接种至一级发酵液体培养基中，并在恒温摇床中以预设的温度和转速进行震荡培养，得到金耳一级液体菌种；
15.s2、将步骤s1得到的金耳一级液体菌种接种至二级发酵液体培养基中，并在恒温摇床中以预设的温度和转速进行震荡培养，得到金耳二级液体菌种；
16.s3、将步骤s2得到的金耳二级液体菌种接种至发酵罐液体培养基中，持续通入过滤的无菌空气，并在预设的温度下进行培养，得到金耳原种。
17.在可选的实施方式中，所述步骤s1中，每100ml的一级发酵液体培养基接种金耳固体母种3.0-5.0cm2。
18.在可选的实施方式中，所述步骤s1中，培养条件如下：
19.温度22-26℃，转速140-200r/min，培养时间84-96h。
20.在可选的实施方式中，所述步骤s2中，金耳一级液体菌种的接种量为二级发酵液体培养基总体积的5％-15％。
21.在可选的实施方式中，所述步骤s2中，培养条件如下：
22.温度22-26℃，转速200-240r/min，培养时间84-96h(可以给个范围)。
23.在可选的实施方式中，所述步骤s3中，金耳二级液体菌种的接种量为发酵罐液体培养基总体积的5％-10％；
24.培养条件如下：
25.通气量为3-5l/min，发酵罐内的温度为22-26℃，培养时间96-120h。
26.通过上述方案的实施，本发明提出的用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基，给金耳菌种中的菌丝生长提供一个最佳的营养、酸碱度、温度、供氧量，使菌丝快速生长，迅速扩繁，在短时间达到一定菌球数量，完成一个发酵周期。
27.本发明的金耳原种制作方法，通过三次生物发酵，第一次发酵高温低速富营养，促进休眠菌丝活化，加速萌发；接着进行第二次发酵，低温高速，促进菌丝迅速扩繁，形成菌丝球；最后通过发酵罐扩大培养，已达到最佳菌丝活力、生物量；如此，扩繁17-20天即可制得金耳原种，且每毫升菌丝干重可达7.16-9.23mg/ml，菌丝球直径均在2mm以下，极大的缩短了金耳原种制作周期，进而缩短了金耳栽培种制作周期。
附图说明
28.图1是本发明的高海拔地区金耳原种制作的方法的流程图。
29.图2是本发明的实施例1中一级发酵培养过程实物图。
30.图3是本发明的实施例1中二级发酵培养过程实物图。
31.图4是本发明实施例1得到的金耳原种菌丝球实物图。
具体实施方式
32.为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。
33.在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以以很多方式中任意一种来实施。
34.临夏地区属于高寒冷凉区，海拔平均2000米，年平均气温5.6～9.7℃，本发明的试验是在临夏县北塬试验站内进行，该地海拔2000米左右，因此，本发明涉及的高海拔地区是指海拔为1900-2300m的地区，本发明的配方调试条件适应于高海拔地区，但包括不限于高海拔地区。
35.金耳菌种是金耳菌丝和粗毛硬革菌菌丝两种混合而成，在培育金耳菌种的过程中，需保证金耳菌丝和粗毛硬革菌菌丝均生长正常才能用于栽培。
36.基于此，本发明提供一种液体培养基，利用生物发酵原理，通过给菌丝提供最佳生长条件使菌丝快速生长，迅速扩繁，扩繁17-20天即可得金耳原种，缩短了原种制作周期，极大程度的降低了原种制作成本。
37.在本发明示例性的实施例中，提供一种用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基，包括：
38.一级发酵液体培养基：按比例每升培养基含可溶性淀粉5-10g，豆粨粉0-5g，葡萄糖10-15g，蛋白胨1-3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg，ph 6-7。
39.二级发酵液体培养基：按比例每升培养基含可溶性淀粉5-10g，豆粨粉0-5g，葡萄糖10-15g，蛋白胨1-3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g。
40.发酵罐液体培养基：在一级发酵液体培养基中加入重量百分比为1.5％-2.0％的木屑粉。
41.木屑粉主要成分是粗纤维和碳水化合物，即能提供碳源物质，又能给菌丝球提供“寄生核”，对菌丝球的形成与发育有明显的促进作用，并且可以获得在栽培料中迅速定植的液体菌种。
42.应该理解为，可溶性淀粉为本领域常见物质，例如，玉米淀粉、马铃薯淀粉等，本领域技术人员可根据实际情况选择，在此不对其种类进行进一步限定。
43.在本发明优选的实施例中，主要通过改变配方中的可溶性淀粉，豆粨粉，葡萄糖，蛋白胨的比例调整液体培养基的c/n(即碳源和氮源的质量比)，经调试，本发明一级发酵液体培养基的c/n范围在20：1～30：1之间，符合金耳生长的营养需求。
44.在本发明其中一个优选的实施例中，通过控制配方的c/n对可溶性淀粉、豆粨粉、葡萄糖、蛋白胨的用量进行调整，c/n设置为20：1，配方如下：
45.可溶性淀粉10g，豆粨粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg，ph 6-7。
46.在本发明另一个优选的实施例中，通过控制配方的c/n对可溶性淀粉，豆粨粉，葡萄糖，蛋白胨的用量进行调整，c/n设置为25：1，配方如下：
47.可溶性淀粉5g，豆粨粉5g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg，ph 6-7。
48.在本发明另一个优选的实施例中，通过控制配方的c/n对可溶性淀粉，豆粨粉，葡萄糖，蛋白胨的用量进行调整，c/n设置为30：1，配方如下：
49.可溶性淀粉10g，豆粨粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg，ph 6-7。
50.优选的，二级发酵液体培养基与一级发酵液体培养基的区别在于将一级发酵液体培养基中的维生素b1去除。
51.在本发明另一个优选的实施例中，还提供了一级发酵液体培养基的制备方法，包括：
52.1、纯净水煮至40-60℃，加入可溶性淀粉和豆粨粉，边加边搅拌，搅拌均匀；
53.2、取葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素b1，纯净水化开，加入第1步的溶液中，边加边搅拌，小火加热，煮制1min，加纯净水至足量；
54.3、用精密ph试纸检测，ph6-7即可，否则用1mol/l的naoh溶液或hcl溶液调整。
55.4、将配制好的液体培养基，115℃灭菌30min，冷却备用。
56.可以理解的，二级发酵液体培养基的制备方法即按照前述一级发酵液体培养基的制备方法制备，只需去除维生素b1即可。
57.在本发明另一个优选的实施例中，还提供了发酵罐液体培养基的制备方法，包括：
58.木屑粉制备：选取新鲜无霉变的阔叶树木屑用纯净水浸泡24-36h，121℃灭菌30min，再沥干水分置于电热恒温烘箱中65℃烘干至恒重，使用粉碎机粉碎，过120目筛(孔径0.125mm)，备用。
59.照前述一级发酵液体培养基的制备方法制备，只需在第2步中，取葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素b1，以及重量为一级发酵液体培养基重量的1.5％的前述木屑粉，纯净水化开，加入第1步的溶液中，边加边搅拌，小火加热，煮制1min，加纯净水至足量。
60.在本发明另一个示例性的实施例中，提供一种高海拔地区金耳原种制作的方法，包括以下步骤：
61.s1、将金耳固体母种接种至一级发酵液体培养基中，并在恒温摇床中以预设的温度和转速进行震荡培养，得到金耳一级液体菌种；
62.s2、将步骤s1得到的金耳一级液体菌种接种至二级发酵液体培养基中，并在恒温摇床中以预设的温度和转速进行震荡培养，得到金耳二级液体菌种；
63.s3、将步骤s2得到的金耳二级液体菌种接种至发酵罐液体培养基中，持续通入过滤的无菌空气，并在预设的温度下进行培养，得到金耳原种。
64.在可选的实施方式中，所述步骤s1中，每100ml的一级发酵液体培养基接种金耳固体母种3.0-5.0cm2。
65.在更为优选的实施例中，每100ml的一级发酵液体培养基接种金耳固体母种4.0cm2，接种时，将金耳母种切成1cm2大小的碎块再接种。
66.在可选的实施方式中，所述步骤s1中，培养条件如下：
67.温度20-26℃，转速140-200r/min，培养时间84-96h。
68.在更为优选的实施例中，温度24℃，转速180r/min，培养时间96h。
69.在可选的实施方式中，所述步骤s2中，金耳一级液体菌种的接种量为二级发酵液体培养基总体积的5％-15％，即每升二级发酵液体培养基中需接种50-150ml的金耳一级液
体菌种。
70.在更为优选的实施例中，按照15％接种量将一级液体菌种接种于放有二级发酵液体培养基的1l摇瓶内，装液量400-500ml，尤其优选为400ml，摇瓶装液量在40％-50％之间时溶氧量最佳，可为菌丝生长提供充足的氧气。
71.在可选的实施方式中，所述步骤s2中，培养条件如下：
72.温度22-26℃，转速200-240r/min，培养时间84-96h。
73.在更为优选的实施例中，温度24℃，转速240r/min，培养时间96h。
74.在可选的实施方式中，所述步骤s3中，金耳二级液体菌种的接种量为发酵罐液体培养基总体积的5％-10％，即每升发酵罐液体培养基中需接种50-150ml的金耳二级液体菌种。
75.培养条件如下：
76.通气量为3-5l/min，发酵罐内的温度为22-26℃，培养时间96-120h。
77.在更为优选的实施例中，按照15％接种量将二级液体菌种接种于放有发酵罐液体培养基的发酵罐内，24℃，通气量4.5l/min，培养48h；之后再在24℃，调整通气量至3l/min，培养48-72h，得到金耳原种。
78.发酵罐为深层发酵，此步骤前期高通氧量保证罐内o2浓度，促进菌丝迅速生长，形成优势，以减小污染；后期减小通氧量，以降低对菌丝的机械损伤，保持菌丝完整，保证活力。在上述条件下得到的金耳原种，金耳菌丝干重可达7.16-9.23mg/ml，菌丝球直径均在2mm以下。
79.下面结合具体的实施例对本发明的方案进一步描述。
80.以下试验均于临夏回族自治州农业科学院北塬试验站实验室内开展，海拔2010～2035米。
81.实施例1
82.一、金耳母种活化
83.1.活化培养基配方：马铃薯(去皮)200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，蛋白胨2g，硫酸镁1g，维生素b
1 1片(10mg)，琼脂15g，ph自然，蒸馏水1000ml。
84.2.活化培养基的制备：
85.①
马铃薯去皮称取200g，切成约1cm3的方块。加入马铃薯块，400ml纯化水煮沸15min(熟而不烂)，6层纱布过滤两次，留滤液备用；
86.②
称取葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，蛋白胨2g，硫酸镁1g，维生素b
1 1片，用200ml纯化水化开，加入上一步滤液中，边加边搅拌，备用；
87.③
称取20g琼脂粉，用200ml纯化水化开，加入上一步滤液中，边加边搅拌，搅拌均匀后小火加热，煮沸后2min关火，补水至1000ml，搅拌均匀，分装；121℃灭菌20分钟；
88.④
平板制备：10cm直径的玻璃培养皿提前灭菌备用，超净工作台紫外照射30分钟备用。每个平板倒培养基约15ml，即厚0.5cm左右即可。
89.⑤
检测：等培养皿中的冷凝水散尽后封口，在37℃下放至1天，若无杂菌生长即可使用。
90.3.活化：取金耳菌种1cm2大小的方块接种于步骤2制备的活化培养基中央，倒置，22℃恒温培养9天，得到活化后的金耳母种。
91.二、金耳原种制作(液体培养)
92.1.液体培养基配方：
93.一级发酵液体培养基：按比例每升培养基含玉米淀粉10g，豆粨粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg，ph 6.5。
94.二级发酵液体培养基：可溶性淀粉10g，豆粨粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，ph 6.5。
95.发酵罐液体培养基：在一级液体菌种液体培养基中加入重量百分比为1.5％的木屑粉。
96.2.液体培养基的制备
97.一级发酵液体培养基的制备：
98.①
用纯净水煮至60℃，加入玉米淀粉和豆粨粉，边加边搅拌，搅拌均匀。
99.②
取葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素b1，纯净水化开，加入上一步溶液中，边加边搅拌，小火加热，煮制1分钟，加纯净水至足量。
100.③
用精密ph试纸检测，ph6.5即可，否则用1mol/l的naoh溶液或hcl溶液调整。
101.④
将配制好的液体培养基，121℃灭菌20min，冷却备用。
102.二级发酵液体培养基的制备与一级发酵液体培养基的制备的区别在于：第
②
步中没有维生素b1。
103.发酵罐液体培养基的制备与一级发酵液体培养基的制备的区别在于：第
②
步中还需要加入重量百分比为1.5％的木屑粉。
104.木屑粉的获得过程为：选取新鲜无霉变的阔叶树木屑浸泡后灭菌烘干至恒重，使用粉碎机粉碎，过120目筛(孔径0.125mm)，备用。
105.3.金耳原种的培养
106.一级液体菌种的获得：每100ml上述一级液体菌种液体培养基接种金耳母种4cm2左右，将金耳母种切成1cm2大小的方块进行接种，24℃，180r/min，培养96h，得到金耳一级液体菌种，发酵培养过程如图2所示。
107.二级液体菌种的获得：按照15％接种量将一级液体菌种接种于放有二级发酵液体培养基的1l摇瓶内，装液量400ml，22℃，240r/min，培养96h，得到金耳二级液体菌种，发酵培养过程如图3所示。
108.发酵罐液体菌种的获得：按照15％接种量将二级液体菌种接种于放有上述的发酵液体培养基的发酵罐内，24℃，通气量4.5l/min，培养48h；再24℃，通气量3l/min，培养72h，得到金耳发酵罐液体菌种，既原种。
109.如图3所示，在上述条件下得到的金耳原种，通过20天的培育金耳菌丝干重可达9.23mg/ml，菌丝球直径在2mm以下。
110.实施例2
111.本实施例与实施例1的不同之处在于步骤二中金耳原种一级发酵液体培养基原料配比，以及二级发酵液体培养基原料配比不同，本实施例中的一级发酵液体培养基原料配比为玉米淀粉5g，豆粨粉5g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg，ph 7；二级发酵液体培养基原料配比为玉米淀粉5g，豆粨粉5g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，ph 7。
112.其余步骤与参数均与实施例1相同。
113.在上述条件下得到的金耳原种，通过20天的培育金耳菌丝干重可达7.76mg/ml，菌丝球直径在2mm以下。
114.实施例3
115.本实施例与实施例1的不同之处在于步骤二中金耳原种一级发酵液体培养基原料配比，以及二级发酵液体培养基原料配比不同，本实施例中的一级发酵液体培养基原料配比为玉米淀粉10g，豆粨粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg，ph 7；二级发酵液体培养基原料配比为玉米淀粉10g，豆粨粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，ph 7。
116.其余步骤与参数均与实施例1相同。
117.在上述条件下得到的金耳原种，通过20天的培育金耳菌丝干重可达7.16mg/ml，菌丝球直径在2mm以下。
118.对比例1
119.对比例1与实施例1的不同之处在于步骤二中发酵罐液体培养基中原料不同，对比例1中的发酵罐液体培养基中不添加木屑粉。
120.其余步骤与参数均与实施例1相同。
121.在上述条件下得到的金耳原种，通过20天的培育金耳菌丝干重可达6.69mg/ml，菌丝球直径在2mm以下。
122.对比例2
123.对比例2与对比例1的不同之处在于：步骤二中金耳二级发酵液体培养基原料配比不同，本对比例中的二级发酵培养基原料配比为：玉米淀粉25g，豆粨粉5g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，ph 6.5。
124.其余步骤与参数均与实施例1相同。
125.发酵结束后对发酵罐中的金耳原种进行指标测定：试验发现单一碳源发酵的效果不及复合碳源，不添加木屑粉时二次发酵后金耳原种菌丝生物量(菌丝生物量用菌丝干重表示，单位为mg/ml)，仅为4.89mg/ml。
126.金耳栽培种接种及培养
127.分别采用实施例1、实施例2和实施例3得到的金耳原种，栽培料选择市售的金耳栽培料，以每1200g栽培料6ml金耳原种进行接种，穴接两孔，于22℃培养。
128.栽培料接种液体菌种后均在48h内开始萌发，接种穴周围可见白色绒毛，且22℃下最快20天长满料包。
129.由上述过程可知，本发明在20天左右即可培育得到金耳菌种，整个金耳栽培种制作周期也只有40天左右，栽培种制作周期短，极大程度的降低了金耳原种制作成本。
130.虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。

技术特征：
1.一种用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基，其特征在于，包括一级发酵液体培养基、二级发酵液体培养基和发酵罐液体培养基；所述一级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉5-10g，豆粨粉0-5g，葡萄糖10-15g，蛋白胨1-3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg；所述二级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉5-10g，豆粨粉0-5g，葡萄糖10-15g，蛋白胨1-3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g；所述发酵罐液体培养基是在所述一级发酵液体培养基中加入重量百分比为1.5％-2.0％的木屑粉。2.根据权利要求1所述的用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基，其特征在于，所述一级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉10g，葡萄糖15g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg。3.根据权利要求1所述的用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基，其特征在于，所述一级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉5g，葡萄糖10g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg。4.根据权利要求1所述的用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基，其特征在于，所述一级发酵液体培养基的ph为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉10g，豆粨粉5g，葡萄糖15g，蛋白胨1g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素b110mg。5.一种高海拔地区金耳原种制作的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将金耳固体母种接种至一级发酵液体培养基中，并在恒温摇床中以预设的温度和转速进行震荡培养，得到金耳一级液体菌种；s2、将步骤s1得到的金耳一级液体菌种接种至二级发酵液体培养基中，并在恒温摇床中以预设的温度和转速进行震荡培养，得到金耳二级液体菌种；s3、将步骤s2得到的金耳二级液体菌种接种至发酵罐液体培养基中，持续通入过滤的无菌空气，并在预设的温度下进行培养，得到金耳原种。6.根据权利要求5所述的高海拔地区金耳原种制作的方法，其特征在于，所述步骤s1中，每100ml的一级发酵液体培养基接种金耳固体母种3.0-5.0cm2。7.根据权利要求5所述的高海拔地区金耳原种制作的方法，其特征在于，所述步骤s1中，培养条件如下：温度22-26℃，转速140-200r/min，培养时间84-96h。8.根据权利要求5所述的高海拔地区金耳原种制作的方法，其特征在于，所述步骤s2中，金耳一级液体菌种的接种量为二级发酵液体培养基总体积的5％-15％。9.根据权利要求5所述的高海拔地区金耳原种制作的方法，其特征在于，所述步骤s2中，培养条件如下：温度22-26℃，转速200-240r/min，培养时间84-96h。10.根据权利要求5所述的高海拔地区金耳原种制作的方法，其特征在于，所述步骤s3中，金耳二级液体菌种的接种量为发酵罐液体培养基总体积的5％-10％；培养条件如下：通气量为3-5l/min，发酵罐内的温度为22-26℃，培养时间96-120h。

技术总结
本发明提供一种用于高海拔地区金耳原种制作的液体培养基，包括一级发酵液体培养基、二级发酵液体培养基和发酵罐液体培养基；一级发酵液体培养基的pH为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉5-10g，豆粨粉0-5g，葡萄糖10-15g，蛋白胨1-3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g，维生素B110mg；二级发酵液体培养基的pH为6-7，组分包括：按比例每升培养基含可溶性淀粉5-10g，豆粨粉0-5g，葡萄糖10-15g，蛋白胨1-3g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.5g；发酵罐液体培养基是在所述一级发酵液体培养基中加入重量百分比为1.5％-2.0％的木屑粉。本发明还提供一种高海拔地区金耳原种制作的方法。本发明的方法扩繁20天左右即可制得金耳原种，制作周期短，适用于高海拔地区金耳原种快速制作。适用于高海拔地区金耳原种快速制作。适用于高海拔地区金耳原种快速制作。


技术研发人员：韩宏 祁正华 冶晓燕 李正平 蒲鑫 乔冠军 王零春 司才宇 曾有韬 聂斌 张林森 陈福堂 党仁美
受保护的技术使用者：临夏回族自治州农业科学院
技术研发日：2023.03.13
技术公布日：2023/7/11