抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用的制作方法

抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用
技术领域
1.本发明涉及猪星状病毒检测技术领域，更具体地说，涉及一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体及其引物、制备方法和应用。


背景技术：

2.猪星状病毒pastv首次由bridger通过电镜在3周龄的乳猪腹泻粪样中观察到，pastv感染猪后可引起腹泻、呕吐、脱水和生长迟缓等临床症状，pastv常与冠状病毒、嵌杯状病毒、轮状病毒及其他肠道病毒混合感染造成猪急性胃肠炎。有学者认为pastv是引起近年来仔猪病毒性腹泻疫情的主要病原之一，对断奶前仔猪侵害尤为严重，给养猪业带来了巨大影响。
3.星状病毒无囊膜，为单股、正链rna病毒，基因组全长6.4
–
7.8kb，病毒颗粒直径大约是28
–
30nm。星状病毒由5’和3’非翻译区(untranslated region，utr)、三个开放阅读框open reading frames(orf1a、orf1b、orf2)和poly(a)组成。orf1a和orf1b位于基因组的5’端，在orf1a/b的交界处有一个七核苷酸(aaaaaac)的核糖体框架移位信号(rfs)，序列高度保守。整个orf1编码非结构蛋白nsp1a和nsp1ab，它们通过蛋白水解加工成较小的蛋白，包括rna依赖性rna聚合酶，丝氨酸蛋白酶，病毒基因组相关蛋白(vpg)和其他几种功能未知的蛋白质。orf2编码结构蛋白(衣壳蛋白cp)。在所有星状病毒中，衣壳蛋白的n末端比c末端更加保守，因为所有星状病毒的衣壳蛋白均在n端包含一个富含碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)区域，该区域被认为与病毒内部的基因组rna相互作用。
4.星状病毒具有基因多型性与变异性,可以发生基因重组,使其具有不俗的适应宿主能力和跨种间传播能力,具有潜在的人畜共患风险。orf1a区域内可以发生基因重组，除此之外，orf1b和orf2的重叠区是发生同源重组的高频区域，该区域内含有一个相对稳定的发夹结构，重组主要发生在这个发夹结构区域。
5.jonassen等人研究发现人、猫星状病毒和pastv遗传距离最相近，提示星状病毒在进化过程中存在种间交叉传播，有可能是猪传给猫、猫再传给人或者通过中间宿主进行传播。ulloa等人发现，来自住在同一栋房子的人及猪腹泻样品中人星状病毒和pastv部分基因出现重组，认为星状病毒可能存在种间交叉传播。星状病毒的多宿主性、基因差异性及其重组现象和跨种间传播及适应新宿主的能力，使得星状病毒成为潜在的新兴人畜共患病原，因此，对猪星状病毒的及时检测发现并控制具有重要的公共卫生价值。
6.目前已发现的猪星状病毒基因型共有5种(poastv1-5)，序列分析表明五种基因型之间差异很大，基因组彼此间同源性只有40％左右，这也反映出poastv间巨大的遗传差异，这也导致对这五种猪星状病毒的检测方法的差异性非常大，相互之间的借鉴意义很小。
7.在猪星状病毒的抗体检测方面，针对猪星状病毒1型的检测研究较多，例如《猪星状病毒1型衣壳蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备》(中国预防兽医学报，王蔚怡等，2021.4)公开了一种猪星状病毒1型多克隆抗体的制备方法，该方法根据pastv-gx1株cap蛋
白cs(aa420-aa669)基因序列设计引物，pcr扩增该片段(cs)后克隆于pet-32a(+)原核表达载体，构建重组表达质粒pet32a-cs，将其转化e.coli bl21感受态细胞，经终浓度1mmol/l的iptg在37℃诱导6h后经sds-page检测表达产物，结果显示在大约47ku处出现目的蛋白，且该蛋白以可溶性形式表达。将重组cs蛋白经ni柱纯化后乳化，按100μg/只免疫6周龄balb/c小鼠，三免后5d采血分离血清，经western blot和间接免疫荧光检测结果显示，获得的cap蛋白高变区多克隆抗体可特异性识别pastv-gx1感染的pk15细胞表达的病毒蛋白。
8.但是，对其他型的猪星状病毒的抗体检测还未见报道，特别是对猪星状病毒5型的检测，难度更大一些，这主要是跟猪星状病毒5型的结构有关系。
9.2011年在加拿大养猪场成年猪盲肠内粪便标本中发现一种新型pastv，这种pastv无法用病毒通用引物检测，因为这株病毒并没有在多种病毒内均存在的高度保守的s2m茎环结构。对毒株进行系统发育分析，发现其在哺乳动物病毒科中形成了一个独特的谱系，这株pastv与经典型的poastv-1仅有25％-30％的氨基酸同源性，且与其他三种pastv基因型均存在一定的遗传距离，于是将其命名为pastv-5。
10.中国国内第一株pastv-5(kp747574)序列是2015年在健康家养仔猪中检测到的，且中国最早发现的三株poastv-5并不分布在同一进化枝上，呈现较为复杂的分布，poastv-5的遗传性多样且复杂。因此，如何开发一种与pastv5血清特异性结合效果好且效价较高的酶标抗体具有重要的意义。


技术实现要素：

11.为了提高抗体与pastv5血清特异性结合效果，本技术提供一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体及其引物、制备方法和应用。
12.一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体制备用pcr引物，所述引物的核苷酸序列如下：
13.p1:5
’‑
ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt-3’；
14.p2:5
’‑
aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg-3’。
15.一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体，由保藏编号为cctcc n0:c2022393的杂交瘤细胞株产生。
16.一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株，保藏编号为cctcc n0:c2022393。
17.一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：
18.1)采用pet32a-pastv5-cap-1融合蛋白对小鼠进行免疫；
19.2)取步骤1)中免疫小鼠的脾细胞与sp2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；
20.3)对步骤2)制得的杂交瘤细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；
21.4)对步骤3)筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，筛选得到所述单克隆抗体细胞株。
22.步骤3)中采用间接elisa方法筛选。
23.上述pet32a-pastv5-cap-1融合蛋白利用上述引物扩增、克隆、重组、融合、纯化得到。
1/bl21(de3)菌体裂解物；
43.图3是实施例4中westen blot鉴定融合蛋白在大肠杆菌中的表达。其中，泳道m为蛋白质分子质量标准，泳道1为pet32a-bl21(de3)空载对照，泳道2为pet32a-pastv5-cap-1/bl21(de3)菌体裂解物；
44.图4是实施例5中分析融合蛋白的表达形式的考马斯亮蓝染色图。其中，泳道m为蛋白质分子质量标准，泳道1为pet32a-bl21(de3)空载对照，泳道2为沉淀，泳道3为上清,泳道4为全菌。
45.图5是实施例5中westen blot分析融合蛋白的表达形式。其中，泳道m为蛋白质分子质量标准，泳道1为pet32a-bl21(de3)空载对照，泳道2为沉淀，泳道3为上清。
46.图6是实施例5中sds-page分析纯化前后的融合蛋白。其中，泳道m为蛋白质分子质量标准，泳道1为pet32a-bl21(de3)空载对照，泳道2为纯化前融合蛋白，泳道3为纯化后融合蛋白。
47.图7是实施例6中sds-page分析纯化前后的融合蛋白。其中，泳道m为蛋白质分子质量标准，泳道1为pet32a-bl21(de3)空载对照，泳道2为纯化前融合蛋白，泳道3为纯化后融合蛋白。
48.图8是实施例6中间接免疫荧光方法对单克隆抗体进行鉴定结果。其中，b为蓝色荧光为核，a为绿色荧光为pastv5 cap蛋白。
49.图9是实施例6中间接免疫荧光方法对单克隆抗体进行鉴定结果。其中，b为蓝色荧光为核，a为绿色荧光为pastv5 cap蛋白。
50.图10是实施例6中间接免疫荧光方法交叉试验验证单克隆抗体的特异性。其中，b为蓝色荧光，a为绿色荧光。
51.图11是实施例6中westen blot方法验证单克隆抗体的特异性。
52.图12、图13是实施例1中pastv5 cap蛋白的抗原性、亲水性分析及胞内、胞外分布预测，经预测，均为胞外区，无跨膜螺旋区。
具体实施方式
53.以下结合具体实施方式对本技术作进一步详细说明。
54.pastv5 cap蛋白是唯一的结构蛋白，决定病毒毒力、细胞嗜性和致病性的主要因素；作为星状病毒唯一的结构蛋白，cap蛋白免疫原性较好，且n端保守性较高，可作为血清学检测的靶区域。
55.实施例1(pastv5-cap-1基因的pcr扩增)
56.从ncbi中获取pastv5-cap-1的基因序列，根据表达用质粒pet32a和基因序列分析，选取bamhi和hindiii为酶切位点，设计引物序列如下：
57.p1:5
’‑
ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt-3’；
58.p2:5
’‑
aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg-3’；
59.以河南省内2021年冬春季节2月龄内仔猪粪便为模板，利用上述引物进行pcr扩增，pcr反应体系为：
60.primer star 25ul、dna模板(cdna)2ul、上游引物(10μmol/l)1ul、下游引物(10μmol/l)1ul、双蒸水21ul。总体积为50ul。
61.pcr反应程序为：98℃5min、98℃30s、61.6℃30s、72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。
62.反应完成后进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶回收试剂盒回收pcr产物，获得501bp大小的条带，结果如图1所示。
63.图1为pastv5 cap蛋白421-921bp片段的pcr扩增电泳图。其中，第一泳道为dna标准2k plusⅱmaker,第2泳道为阴性对照，第3泳道为pastv5 cap蛋白421-921bp片段。表明成功获得了大小正确的片段。
64.实施例2(重组表达载体和表达菌株的构建)
65.将实施例1扩增获得的pastv5-cap-1基因和质粒pet32a分别进行双酶切，凝胶回收，连接、转化后涂布lb/amp平板，37℃温箱中倒置培养。挑取lb/amp平板上的单克隆，摇菌后利用通用引物进行菌液pcr鉴定，获得阳性克隆pet32a-pastv5-cap-1；
66.其中，通用引物序列如下：
67.p1：5
’‑
cgaacgccagcacatggaca-3’；
68.p2：5
’‑
tgctagttattgctcagcgg-3’；
69.pcr反应体系为：
70.rtaq 12.5ul、dna模板(菌液)2ul、上游引物(10μmol/l)0.5ul、下游引物(10μmol/l)0.5ul、双蒸水9.5ul。总体积为25ul。
71.pcr反应程序为94℃5min，94℃30s，61.6℃30s，72℃1min，共35个循环；最后72℃延伸5min。
72.阳性克隆pet32a-pastv5-cap-1经扩大培养，提取质粒pet32a-pastv5-cap-1，菌液pcr鉴定后进行测序。
73.将测序正确的阳性质粒pet32a-pastv5-cap-1转化大肠杆菌感受态bl21(de3)，并进行pcr鉴定，获得重组表达菌株pet32a-pastv5-cap-1/bl21(de3)。
74.实施例3(融合蛋白的诱导表达)
75.利用终浓度为100mmol/l的iptg在37℃、220rpm条件下对重组表达菌株pet32a-pastv5-cap-1/bl21(de3)经诱导获得约38kd的融合蛋白，大小符合预期；空载没有获得蛋白条带，结果如图3所示。
76.实施例4(western blot验证)
77.为了进一步验证融合蛋白表达，对融合蛋白进行针对表达标签的his的western blot鉴定。
78.诱导表达后，收集菌体，煮样后进行sds-page，同时设置空载对照组。利用pvdf膜转膜75min后抗体孵育：取出pvdf膜，再使用5％脱脂奶37℃封闭2h；取出pvdf膜，使用5％脱脂奶稀释的鼠源his标签单抗隆抗体(1:5000稀释)，4℃摇床孵育过夜，采用pbst洗膜4次，每次清洗5min；显影、曝光。结果如图4所示，表明所表达的蛋白为目的蛋白。
79.实施例5(融合蛋白表达形式鉴定和蛋白纯化)
80.诱导表达后收集菌体，加入pbs重悬，超声裂解菌体，并分离上清和沉淀，sds-page、western blot分析表达形式。经验证表达产物为包涵体表达，结果如图5所示，因此进行包涵体纯化。
81.蛋白诱导表达后，采用超声破碎，在4℃、12000g离心力的条件下离心10min；弃上
清，将沉淀重悬于tris buffer中，离心并弃上清，重复两次，直至包涵体沉淀呈洁净的乳白色。弃上清，加入浓度为8mol/l尿素变性液，4℃摇床过夜，使包涵体溶解。在4℃、12000g离心力条件下离心30min，将上清倒入煮好的透析袋中，夹子验漏，然后将透析袋置于含1l浓度为6mol/l的尿素复性液的量筒中，在4℃条件下利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h。然后更换浓度为4mol/l的尿素复性液。在4℃条件下利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h。然后更换浓度为2mol/l的尿素复性液，在4℃条件下利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h；然后更换浓度为0mol/l尿素复性液，在4℃条件下利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h。然后更换tris buffer，在4℃条件下，利用磁力搅拌器在400rpm转速下搅拌6h。
82.取适量透析后蛋白，加入5
×
蛋白电泳sds buffer煮样，sds-page分析，结果如图6所示，得到了纯度较高的融合蛋白。
83.实施例6(杂交瘤细胞株2a11单克隆抗体的制备)
84.6.1动物免疫
85.1)第一次免疫：将上述纯化的pet32a-pastv5-cap-1蛋白作为抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，按照25μg/只对小鼠进行皮下注射，小鼠为6周龄bala/c雌性小鼠。
86.2)第二次免疫：与第一次免疫间隔14天后，将纯化的pet32a-pastv5-cap-1蛋白作为抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，按照25μg/只对雌性小鼠进行皮下注射。
87.3)第三次免疫：与第二次免疫间隔14天后，将纯化的pet32a-pastv5-cap-1蛋白作为抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化后，按照25μg/只对雌性小鼠进行皮下注射。
88.4)间隔7天后，按照25μg/只腹腔注射上述纯化的蛋白。
89.5)3天后准备细胞融合。
90.6.2细胞融合
91.6.2.1sp2/0细胞的培养：
92.融合前一周，取冻存的sp2/0细胞在37℃水浴锅中快速融化，以600rpm/min转速离心10min，弃上清，将细胞用含10％胎牛血清的dmem培养基重悬后转移至t75培养瓶中，于5％ co2、37℃培养箱中培养，待细胞长至90％时，吹散细胞，以600rpm/min转速离心10min，扩大培养至2个t75培养瓶中，待细胞长至饱满透亮状态后，更换新的培养基，准备融合。
93.6.2.2饲养层细胞的制备：
94.融合前一天，取两只健康无免疫的bala/c小鼠，在无菌台中摘眼球采血得到阴性对照血，处死后将其浸泡在75％酒精中，紫外照射等待15min。
95.预先在泡沫板上包一层保鲜膜，将小鼠取出，用10ml注射器针头固定好小鼠四肢。用弯头镊子夹起小鼠腹白线位置处皮肤向上提，用眼科剪剪开一个小口，用镊子剥开腹部皮肤，使皮肤与腹膜分离，暴露腹膜，用酒精棉球消毒腹膜表面。在平皿中倒入30ml hat培养基，取10ml注射器针管，安装好后吸取hat培养基。
96.用镊子轻轻提起腹膜，注射器将培养基缓慢推进腹腔，再吸出腹腔中液体。不可吸到腹腔中器官黏膜及脂肪组织。冲洗小鼠腹腔液体后，1000rpm离心10min。
97.弃上清，用hat培养基重悬细胞，将细胞铺于10个96孔板中培养，按照100μl/孔设置，放于培养箱(37℃、5％co2)中过夜培养。
98.6.2.3免疫鼠脾细胞的制备：
99.加强免疫3天后，取实验小鼠，在无菌台中摘眼球采血得到阳性血，处死后将其浸
泡在75％酒精中，紫外照射等待30min。
100.预先在泡沫板上包一层保鲜膜，将小鼠取出，用10ml注射器针头固定好小鼠四肢。用弯头镊子夹起小鼠腹白线位置处皮肤向上提，用眼科剪剪开皮肤及腹膜。小鼠脾脏的位置大致在小鼠左上测靠近背部，找到脾脏并钝性分离。
101.将脾脏放入含有无血清dmem的培养皿中进行清洗，并剥离脾脏上面的结缔组织。取单细胞筛放于含有无血清dmem的培养皿中，用10ml注射器的活塞将脾脏经细胞筛研磨为单个分散细胞。将研磨后的脾细胞液转至50ml离心管中以1000rpm的转速离心10min。弃上清，用dmem清洗细胞2次，待用。
102.6.2.4细胞融合
103.取两瓶(t75)生长状态良好的sp2/0细胞，吹散细胞，于50ml无菌离心管中1000rpm/min离心10min，弃去上清，用无血清dmem培养基再次清洗细胞，重复离心两次，弃去上清。
104.将单个分散的脾细胞移至含有sp2/0细胞的50ml离心管中，以1000rpm/min转速离心10min，弃上清。轻弹离心管底部，使脾细胞和sp2/0细胞混合均匀，然后将离心管放置于盛有37℃水的200ml烧杯中。
105.将1ml融合剂peg1420在37℃水浴锅中预热，然后按照1s/滴的速度滴加至脾细胞和sp2/0细胞的混合物中，边滴加边旋转离心管，使融合剂与细胞混合物混匀。滴加完毕后静置90s，然后滴加无血清dmem培养基终止融合。第1min内匀速滴加1ml，第2min内匀速滴加2ml，第3min内匀速滴加3ml，在10min内滴加至30ml。融合后的混合液1000rpm/min离心10min，弃上清，沉淀用300ml含有饲养层细胞的hat选择培养基重悬，混匀，铺至培养有饲养层细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul。放置于37℃、5％co2的细胞培养箱中培养。
106.融合3天后，观察细胞生长状态，当细胞出现明显的细胞团，且没有融合的细胞大量死亡时，用ht培养基进行半量换液。当细胞长至孔内1/10时进行第二次半量换液，隔天使用间接elisa方法检测细胞上清效价。
107.6.3阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆
108.将pet32a-pastv5-cap-1蛋白和pet32a空载体诱导产物分别用碳酸盐溶液稀释至2μg/ml，铺于96孔酶标板中，每孔100μl，在37℃下包被2h。弃去包被液，经pbst清洗后拍干酶标板，每孔加入150μl 5％bsa封闭液，于37℃温箱中封闭1h。然后弃去封闭液，用pbst清洗后将板子拍干，小鼠血清用pbs分别按照1/100、1/1000、1/10000、1/100000、1/500000、1/1000000的比例进行稀释，同时设阴性小鼠血清对照，每孔100μl，37℃反应1h。弃去1抗，pbst清洗1次，拍干酶标板，加入1/100002％脱脂奶稀释的hrp-山羊抗鼠igg二抗，每孔100μl，37℃反应1h。弃去二抗，清洗4次，拍干酶标板，每孔加入100μl tmb单组份显色液进行显色，显色10min。每孔加入50μl 2m h2so4终止显色。
109.采用酶标仪波长为450nm测定各孔od值。
110.将筛选到效价较高(可根据实际情况设定筛选效价标准)的细胞孔补液，次日进行复检。选择效价较高的杂交瘤细胞株进行亚克隆。
111.亚克隆前取两只空白小鼠，用预冷的ht培养基制备饲养层细胞，按每株细胞株20ml准备培养基。以有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆，亚克隆后都利用elisa试验对单克隆孔进行检测，对检测效价高的细胞孔进行再次亚克隆，筛选稳定分泌的单克隆扩大培养，
最终获得一株稳定分泌的单克隆抗体细胞株，命名为2a11。
112.该单克隆抗体细胞株的保藏信息如下：
113.保藏人:河南农业大学
114.保藏日:2022.12.24
115.培养物名称(分类命名):杂交瘤细胞株pastv5-cap-1-2a11
116.保藏编号：cctcc n0:c2022393;保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学中国典型培养物微生物保藏中心。
117.6.4western blot方法对单克隆抗体进行鉴定
118.取纯化后的蛋白液，加入5
×
sds loading buffer，混匀煮沸10min。取10μl样品经12.5％聚丙烯酰胺凝胶进行sds-page电泳。电泳结束后进行转膜，将滤纸、pvdf膜、凝胶、滤纸依次铺平放好，轻微碾压避免气泡产生，360ma转膜70min。
119.将pvdf膜于5％脱脂奶中室温孵育1h，弃去封闭液，将pvdf膜浸泡在筛选到的阳性单克隆抗体上清中，室温下以40rpm摇床孵育1h。弃去一抗，采用tbst清洗4次，每次清洗5min。
120.然后将pvdf膜浸泡在含有商品化hrp-山羊抗鼠igg(1:5000)的2％脱脂奶粉中，室温下以40rpm摇床孵育1h。采用tbst清洗4次，每次清洗5min。滴加ecl显色试剂显色，使用显影仪器进行显影。结果如图7所示，所制单克隆抗体能够特异性识别pastv5 cap蛋白。
121.6.5间接免疫荧光方法对单克隆抗体进行鉴定
122.于6孔板中培养pk细胞，待生长至70％时，弃去细胞培养液，用高压无菌的pbs清洗细胞两遍。将pastv5接种于pk细胞上，置于5％co2、37℃培养箱吸附2h。每隔30min轻轻摇晃一次，经高压无菌的pbs洗两遍，洗去未吸附的病毒粒子。然后补加10mldmem于温箱中培养，72h后，按照如下步骤进行间接免疫荧光试验：
123.(1)固定：用pbst轻轻洗涤细胞2遍，每孔加入1ml4％pfa(多聚甲醛)于室温固定30min。
124.(2)破膜：弃pfa，用pbst洗涤1次，然后加入300μl含0.1％ triton x-100的pbs溶液，室温孵育15min。
125.(3)封闭：弃液，采用pbst洗涤1次，然后加入300μl含5％ bsa的pbst溶液封闭细胞，室温孵育1h。
126.(4)一抗：弃封闭液，用pbst洗涤细胞4次后，加入300μl筛选出的识别pastv5蛋白的细胞株上清，室温孵育1h。
127.(5)二抗：弃一抗，用pbst洗涤细胞4次后，加入300μlfitc-山羊抗小鼠igg抗体(1/500倍稀释)，室温避光孵育1h。
128.(6)染核：弃二抗，pbst洗涤细胞4次后，滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole，dapi)室温染色细胞核10min，弃去dapi，用pbst清洗3次。
129.(7)观察结果：用荧光显微镜观察染色细胞，蓝色荧光为核，绿色荧光为pastv蛋白。结果如图8所示，可对pastv5进行检测。
130.6.6交叉试验验证单克隆抗体的特异性
131.将pastv5在pk细胞中以dmem培养基(添加4μg/ml胰蛋白酶)培养，将塞内卡病毒a(seneca virus a,sva)在pk细胞中用含10％血清dmem培养。分别用pastv5和sva感染单层的pk细胞，病毒吸附2h后，弃去培养基，加入维持液，观察细胞的生长情况。同时设未感染组作为对照。
132.待细胞开始病变时，弃去上清，收集细胞，用细胞裂解液裂解，加入5
×
sds loading buffer，进行sds-page电泳，经转膜，封闭后使用上述制备的单克隆抗体作为一抗进行wb试验，验证单克隆抗体是否能够识别pastv5和sva。结果如图10所示，单克隆抗体2a11对pastv5反应较强，不能与sva发生反应。
133.设置同样的试验孔，当细胞开始病变时，加入4％ pfa进行固定，用上述制备的单克隆抗体作为一抗做间接免疫荧光试验，验证单克隆抗体与pastv5和sva是否存在交叉反应。结果如图9所示，感染pastv5的细胞产生明显的荧光，而sva感染的细胞没有反应，说明单克隆抗体特异性较强。
134.实施例7(应用)
135.将上述得到的杂交瘤细胞株利用培养基培养，使其分泌抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体，然后纯化分离。培养基可以采用现有的培养基，也可以采用上述饲养细胞制备培养基。
136.在其他实施例中，也可以采用小鼠腹水生产方法进行生产制备：提前一周向小鼠腹腔注射腹水诱导剂，之后向小鼠腹腔内注射对数生长期的上述杂交瘤细胞株，在小鼠腹腔内进行诱生增殖，7-15天时抽取腹水，对腹水进行离心分离、纯化，即得。
137.在具体使用时，可以将单克隆抗体制备成检测试剂盒，本发明优选的，制备成猪星状病毒五型pastv5间接elisa检测试剂盒，方法可以参考现有技术中的方法。
138.实验例
139.对实施例1中的pastv5 cap蛋白的抗原性、亲水性分析及胞内、胞外分布进行预测，结果如图12和图13所示，可以看出，均为胞外区，无跨膜螺旋区。
140.本发明通过制备猪星状病毒五型pastv5 cap蛋白的融合蛋白，并对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白，并通过蛋白质印迹(wb)方法鉴定原核表达的cap蛋白的免疫原性；将纯化的pastv5蛋白免疫小鼠，取其脾细胞与sp2/0细胞进行融合，通过间接酶联免疫吸附试验(elisa)筛选阳性杂交瘤细胞株，并通过wb和间接免疫荧光试验(ifa)鉴定单克隆抗体与pastv5蛋白的反应性；通过对不同代次杂交瘤细胞株的抗体效价进行测定，分析细胞株所分泌抗体的稳定性。
141.本试验表达纯化的pastv5 cap蛋白能与pastv5阳性血清反应，具有良好的免疫原性；将纯化好的蛋白免疫小鼠，筛选单克隆抗体，杂交瘤细胞株能够稳定的分泌抗体，结果显示，本发明制备的单克隆抗体能特异性识别猪星状病毒5型cap蛋白上的n端区域(aa141-307)。本发明制备的单克隆抗体elisa效价可达到50万倍以上，并可应用于elisa、wb、ifa中对pastv5的检测。

技术特征：
1.一种抗猪星状病毒五型pastv5抗原制备用pcr引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：p1:5
’‑
ggatccgggtctggcaatcttgagattgaaggt-3’；p2:5
’‑
aagcttaggattcatgttccaatttgtaaactgccatgtggcgcg-3’。2.一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株，其特征在于，保藏编号为cctcc n0:c2022393。3.一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为cctcc n0:c2022393的杂交瘤细胞株产生。4.一种抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，利用保藏编号为cctcc n0:c2022393的杂交瘤细胞株分泌产生抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体。5.根据权利要求4所述的抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，将所述杂交瘤细胞株培养，分泌抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体，纯化分离，即得。6.根据权利要求4所述的抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体的制备方法，其特征在于，利用所述杂交瘤细胞株在小鼠腹腔内进行诱生增殖，对腹水进行分离、纯化，制得所述抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体。7.一种如权利要求3所述的抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体的在检测猪星状病毒五型方面的应用。8.根据权利要求7所述的抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体的在检测猪星状病毒五型方面的应用，其特征在于，所述应用为elisa检测、wb检测或ifa检测。9.根据权利要求8所述的抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体的在检测猪星状病毒五型方面的应用，其特征在于，所述在elisa检测方面的应用是制备猪星状病毒五型pastv5间接elisa检测试剂盒，该试剂盒包含所述的抗猪星状病毒五型pastv5单克隆抗体。

技术总结
本申请涉及一种抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体、引物、杂交瘤细胞株、制备、应用，属于猪星状病毒检测技术领域。本发明的抗猪星状病毒五型PAstV5单克隆抗体制备用杂交瘤细胞株的制备方法包括如下步骤：1)采用pET32a-PAstV5-Cap-1融合蛋白对小鼠进行免疫；2)取步骤1)中免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合制备杂交瘤细胞；3)对步骤2)制得的杂交瘤细胞进行筛选，得到阳性杂交瘤细胞；4)对步骤3)筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行亚克隆，筛选即得。该细胞株能够稳定的分泌抗体，制得的PAstV5单克隆抗体ELISA效价可达到50万倍以上，并可应用于ELISA、WB、IFA中对PAstV5的检测。测。测。


技术研发人员：万博 张改平 郭娟娟 张雨杭 何文瑞 韩世充 王亚楠 李华玮 王攀 钟函 任豪杰 柳顺达 付云龙
受保护的技术使用者：河南格悦检测技术有限公司
技术研发日：2023.01.20
技术公布日：2023/7/11