利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法与流程

1.本发明属于生物技术组织培养领域，具体涉及一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法。


背景技术：

2.自然界丰富的植物资源蕴涵着数量可观的具有显著药理活性的次生代谢产物，除了利用植物材料通过提取分离的方法，以及采用化学合成方法获得这些化合物以外，利用生物技术定向生产高活性次生代谢产物也是解决中药资源短缺的有效方法之一。
3.细叶十大功劳(mahonia fortunei(lindl.)fedde)为小檗科十大功劳属植物，又名狭叶十大功劳、黄天竹、土黄柏、猫儿刺、土黄连、八角刺、刺黄柏、猫儿头、刺黄芩、功劳木，十大功劳、山黄芩、西风竹、刺黄连等，是中药功劳木的主要基源植物之一。细叶十大功劳的根、茎、叶中含有小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等多种异喹啉型生物碱，具有抑菌、降压、降血脂、降血糖等药理作用。近年来的文献报道了这些生物碱在治疗细菌和病毒感染、恶性肿瘤、糖尿病、心血管疾病、脑缺血性损伤、精神疾病、阿尔茨海默病(alzheimer disease)、骨质疏松等多方面的临床应用，显示出该类生物碱广泛的临床应用及开发价值。
4.然而小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱在细叶十大功劳及其它药用植物中的含量较低，尤其是药根碱及其生物合成途径中生成的多个中间体化合物(多为生物碱类)含量更低，且针对这些化合物目前也缺乏成熟的化学合成方法，常用的以黄连为药材采用提取方法制备这些生物碱的成本也很高，限制了上述生物碱类化合物的进一步研究及开发。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，并提供一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，能够实现细叶十大功劳生物合成途径中多种难以采用化学合成获得的生物碱的有效富集，极大地降低了小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其生物合成途径中各生物碱产业化生产的成本。
6.本发明所采用的具体技术方案如下：
7.一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其以细叶十大功劳植株部位作为外植体，将外植体进行消毒后表面贴于添加蔗糖、琼脂、2,4-对氯苯氧乙酸和6-糖基氨基嘌呤的ms培养基上，先避光密闭培养后再交替采用光照培养和黑暗培养，培养到外植体边缘产生愈伤组织至外植体完全愈伤化但尚未褐化期间的任意时刻终止，采集培养得到的含愈伤组织的外植体或者愈伤组织并从中提取小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其他生物碱。
8.作为优选，培养外植体所用的每升培养基中，含有2.37-9.58g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、0.25-1.5mg 2，4-对氯苯氧乙酸、0.25-1.5mg 6-糖基氨基嘌呤，且培养基的ph调至5.8，灭菌后使用。
9.作为优选，所述外植体采用细叶十大功劳的茎、叶或根。
10.作为优选，所述外植体优选采用细叶十大功劳的叶部分。
11.作为优选，所述外植体进一步优选采用细叶十大功劳幼嫩的叶片。
12.作为优选，所述消毒过程为：将所述外植体先用蒸馏水冲洗5～10分钟，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤3～4次、75％酒精洗涤20～30秒、1％～10％次氯酸钠溶液漂洗3～8分钟，再用无菌水洗涤3～4次。
13.作为优选，所述外植体消毒后修剪后剪成方片状，然后将其下表面贴于培养基表面进行培养。
14.作为优选，所述片状外植体的大小为0.5cm2。
15.作为优选，所述避光密闭培养时间为3～6天。
16.作为优选，所述光照培养和黑暗培养各自的培养时长为12小时。
17.本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
18.本发明提供的方法能够实现细叶十大功劳生产异喹啉类生物碱以及生物合成途径中多种难以采用化学合成获得的生物碱的有效富集，愈伤组织中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀的单一或任意组合总含量不低于原外植体，上述生物碱生物合成途径中的多个其它生物碱的含量也显著增加不低于原叶片相对应生物碱含量，为细叶十大功劳小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱及其生物合成途径中各生物碱产业化生产提供了有益方法。
附图说明
19.图1为细叶十大功劳外植体进行不同时期组织培养得到的愈伤组织hplc分析色谱图，其中图1(a)为细叶十大功劳原叶hplc分析色谱图，图1(b)～(e)分别为实施例1～3和对比例1中培养得到愈伤组织的hplc分析色谱图；
20.图2为细叶十大功劳外植体进行不同时期组织培养得到的愈伤组织的培养图，其中图2(a)为细叶十大功劳原叶培养图，图2(b)～(e)分别为实施例1～3和对比例1中培养愈伤组织的培养图。
具体实施方式
21.下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
22.本发明提供了一种利用细叶十大功劳高效生产小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其生物合成途径中各生物碱的方法，其实施方法和步骤为：
23.首先将2.37-9.58g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、0.25-1.5mg 2.4-d(2，4-对氯苯氧乙酸)、0.25-1.5mg kt(6-糖基氨基嘌呤)溶于蒸馏水，调ph至5.8，定容为1l，灭菌后备用。
24.然后以细叶十大功劳植株部位作为外植体开展组织培养，可以采用茎、叶、根等部位；优选细叶十大功劳的叶作为外植体，进一步优选幼嫩的细叶十大功劳叶片作为外植体开展组织培养。
25.将上述外植体先用蒸馏水冲洗5-10分钟，然后于超净工作台将其转移至离心管
内，依次采用无菌水摇晃洗涤3-4次、75％酒精洗涤20-30秒、1％-10％次氯酸钠漂洗3-8分钟，再用无菌水洗涤3-4次，备用。
26.消毒后的外植体，修剪后剪成方片状(大小在0.5cm2左右)，使其下表面贴于培养基上。先遮光密闭培养3-6d，再转换为交替采用光照培养12小时和黑暗培养12小时的培养模式，直到外植体边缘产生愈伤组织至完全愈伤化期间任一时期终止，但需保证终止时外植体尚未褐化。
27.收集含部分愈伤组织的外植体或者愈伤组织，采用高效液相色谱(hplc)法测定其中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其生物合成途径中各生物碱的含量。结果显示，愈伤组织中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀的单一或任意组合总含量不低于原叶片的1.01倍；细叶十大功劳生物碱生合成途径中的多个其它生物碱的含量也显著增加，增加值不低于原叶片相对应生物碱含量的1.01倍。
28.因此，经过上述培养后的含分愈伤组织的外植体或者愈伤组织可用于提取小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其生物合成途径中各种生物碱。该方法能够实现细叶十大功劳生物合成途径中多种难以采用化学合成获得的多种生物碱的有效富集，为十大功劳小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其生物合成途径中各生物碱产业化生产提供了有益方法
29.下面通过若干实施例来进一步展示本发明的具体实现以及技术效果。
30.实施例1
31.本实施例提供一种利用细叶十大功劳嫩叶部分生产异喹啉类生物碱及其生物合成途径中多种生物碱的方法，具体如下：
32.(1)将5.0g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、1.5mg 2,4-对氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.25mg 6-糖基氨基嘌呤(kt)溶于蒸馏水中，调节ph至5.8后定容至1l，灭菌备用，得到组织培养基。
33.(2)选取细叶十大功劳颜色泛红、质地柔软的嫩叶部分，作为外植体开展组织培养研究。
34.(3)将上述外植体先用蒸馏水冲洗4次，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤3次、75％酒精洗涤20秒、3％浓度的次氯酸钠溶液漂洗3分钟，再用无菌水洗涤4次，完成消毒。
35.(4)将上述完成消毒后的外植体修剪成0.5cm2大小片状外植体，表面贴于上述组织培养基上，先置于24℃环境避光密闭培养3天，然后采用光照12小时和黑暗12小时交替培养至10天，直至外植体完全愈伤化，但未褐化。收集愈伤组织，干燥备用。培养10天的叶形态如图2(b)所示。
36.采用高效液相色谱(hplc)法测定所得愈伤组织中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱及其生物合成途径中各生物碱的含量。如图1(b)所示，与细叶十大功劳原叶(图1(a))相比，本实施例培养的愈伤组织中非洲防己碱含量增加8倍、药根碱含量增加400倍、巴马汀含量增加80倍、小檗碱含量降低1.5倍。
37.实施例2
38.本实施例提供一种利用细叶十大功劳嫩叶部分生产异喹啉类生物碱及其生物合成途径中多种生物碱的方法，具体如下：
39.(1)将4.74g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、0.25mg 2,4-对氯苯氧乙酸(2,4-d)、1.5mg 6-糖基氨基嘌呤(kt)溶于蒸馏水中，调节ph至5.8后定容至1l，灭菌备用，得到组织培养基。
40.(2)选取细叶十大功劳颜色泛红、质地柔软的嫩叶部分，作为外植体开展组织培养研究。
41.(3)将上述外植体先用蒸馏水冲洗4次，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤3次、75％酒精洗涤20秒、3％浓度的次氯酸钠溶液漂洗3分钟，再用无菌水洗涤4次，完成消毒。
42.(4)将上述完成消毒后的外植体修剪成0.5cm2大小片状外植体，表面贴于上述组织培养基上，先置于24℃环境避光密闭培养3天，然后采用光照12小时和黑暗12小时交替培养至20天，直至外植体完全愈伤化，但未褐化。收集愈伤组织，干燥备用。培养10天的叶形态如图2(c)所示，叶边缘出现愈伤化。
43.采用高效液相色谱(hplc)法测定所得愈伤组织中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱及其生物合成途径中各生物碱的含量。如图1(c)所示，与细叶十大功劳原叶(图1(a))相比，本实施例培养的愈伤组织中非洲防己碱含量增加20倍、药根碱含量增加200倍、巴马汀含量增加20倍、小檗碱增加2倍，以及细叶十大功劳中生物碱生物合成途径中的其它生物碱含量均增加1.01倍至100倍不等。
44.实施例3
45.本实施例提供一种利用细叶十大功劳嫩叶部分生产异喹啉类生物碱及其生物合成途径中多种生物碱的方法，具体如下：
46.(1)将2.37g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、0.25mg 2,4-对氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.25mg 6-糖基氨基嘌呤(kt)溶于蒸馏水中，调节ph至5.8后定容至1l，灭菌备用，得到组织培养基。
47.(2)选取细叶十大功劳颜色泛红、质地柔软的嫩叶部分，作为外植体开展组织培养研究。
48.(3)将上述外植体先用蒸馏水冲洗3次，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤3次、75％酒精洗涤20秒、1％浓度的次氯酸钠溶液漂洗3分钟，再用无菌水洗涤3次，完成消毒。
49.(4)将上述完成消毒后的外植体修剪成0.5cm2大小片状外植体，表面贴于上述组织培养基上，先置于24℃环境避光密闭培养4天，然后采用光照12小时和黑暗12小时交替培养至30天，直至外植体完全愈伤化，但未褐化。收集愈伤组织，干燥备用。培养10天的叶形态如图2(d)所示，叶边缘完全愈伤化。
50.采用高效液相色谱(hplc)法测定所得愈伤组织中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱及其生物合成途径中各生物碱的含量。如图1(d)所示，与细叶十大功劳原叶(图1(a))相比，本实施例培养的愈伤组织中非洲防己碱含量增加15倍、药根碱含量增加1100倍、巴马汀含量增加15倍、小檗碱增加1.1倍，细叶十大功劳中生物碱生物合成途径中的其它生物碱含量均增加1.01倍至100倍不等。
51.实施例4
52.本实施例提供一种利用细叶十大功劳嫩叶部分生产异喹啉类生物碱及其生物合
成途径中多种生物碱的方法，具体如下：
53.(1)将4.74g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、1.5mg 2,4-对氯苯氧乙酸(2,4-d)、1.5mg 6-糖基氨基嘌呤(kt)溶于蒸馏水中，调节ph至5.8后定容至1l，灭菌备用，得到组织培养基。
54.(2)选取细叶十大功劳颜色泛红、质地柔软的嫩叶部分，作为外植体开展组织培养研究。
55.(3)将上述外植体先用蒸馏水冲洗4次，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤4次、75％酒精洗涤20秒、10％浓度的次氯酸钠溶液漂洗3分钟，再用无菌水洗涤4次，完成消毒。
56.(4)将上述完成消毒后的外植体修剪成0.5cm2大小片状外植体，表面贴于上述组织培养基上，先置于24℃环境避光密闭培养6天，然后采用光照12小时和黑暗12小时交替培养至35天，直至外植体完全愈伤化，但未褐化。收集愈伤组织，干燥备用。
57.采用高效液相色谱(hplc)法测定所得愈伤组织中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱及其生物合成途径中各生物碱的含量。与细叶十大功劳原叶(图1(a))相比，本实施例培养的愈伤组织中非洲防己碱含量增加50倍、药根碱含量增加2000倍、巴马汀含量增加45倍、小檗碱增加20倍，细叶十大功劳中生物碱生物合成途径中的其它生物碱含量均增加1.01倍至100倍不等。
58.实施例5
59.本实施例提供一种利用细叶十大功劳须根部分生产异喹啉类生物碱及其生物合成途径中多种生物碱的方法，具体如下：
60.(1)将9.48g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、0.5mg 2,4-对氯苯氧乙酸(2,4-d)、0.5mg 6-糖基氨基嘌呤(kt)溶于蒸馏水中，调节ph至5.8后定容至1l，灭菌备用，得到组织培养基。
61.(2)选取细叶十大功劳的须根部分，作为外植体开展组织培养研究。
62.(3)将上述外植体先用蒸馏水冲洗3次，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤3次、75％酒精洗涤20秒、5％浓度的次氯酸钠溶液漂洗3分钟，再用无菌水洗涤3次，完成消毒。
63.(4)将上述完成消毒后的外植体修剪成0.5cm2大小片状外植体，表面贴于上述组织培养基上，先置于24℃环境避光密闭培养5天，然后采用光照12小时和黑暗12小时交替培养至29天，直至外植体完全愈伤化，但未褐化。收集愈伤组织，干燥备用。
64.采用高效液相色谱(hplc)法测定所得愈伤组织中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱及其生物合成途径中各生物碱的含量。结果显示与细叶十大功劳原须根相比，愈伤组织中非洲防己碱含量增加5倍、药根碱含量增加100倍、巴马汀含量增加6倍、小檗碱增加1.3倍，以及细叶十大功劳中生物碱生物合成途径中的其它生物碱含量均增加1.01倍至100倍不等。
65.对比例1
66.本对比例提供一种利用褐化细叶十大功劳生产异喹啉类生物碱及其生物合成途径中多种生物碱的方法，具体如下：
67.(1)将6.0g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、0.5mg 2,4-对氯苯氧乙酸(2,4-d)、
0.25mg 6-糖基氨基嘌呤(kt)溶于蒸馏水中，调节ph至5.8后定容至1l，灭菌备用，得到组织培养基。
68.(2)选取细叶十大功劳的嫩叶部分，作为外植体开展组织培养研究。
69.(3)将上述外植体先用蒸馏水冲洗4次，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤3次、75％酒精洗涤20秒、3％浓度的次氯酸钠溶液漂洗3分钟，再用无菌水洗涤4次，完成消毒。
70.(4)将上述完成消毒后的外植体修剪成0.5cm2大小片状外植体，表面贴于上述组织培养基上，先置于24℃环境避光密闭培养3天，然后采用光照12小时和黑暗12小时交替培养至100天，直至外植体愈伤组织褐化。收集愈伤组织，干燥备用。培养100天的叶形态如图2(e)所示，愈伤组织褐化。
71.采用高效液相色谱(hplc)法测定所得愈伤组织中小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀等异喹啉类生物碱及其生物合成途径中各生物碱的含量。如图1(e)所示，结果显示与细叶十大功劳原叶相比，本对比例培养的褐化后的愈伤组织中非洲防己碱含量增加7倍、药根碱含量增加85倍、巴马汀含量增加60倍、小檗碱含量降低2.0倍。
72.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，以细叶十大功劳植株部位作为外植体，将外植体进行消毒后表面贴于添加蔗糖、琼脂、2,4-对氯苯氧乙酸和6-糖基氨基嘌呤的ms培养基上，先避光密闭培养后再交替采用光照培养和黑暗培养，培养到外植体边缘产生愈伤组织至外植体完全愈伤化但尚未褐化期间的任意时刻终止，采集培养得到的含愈伤组织的外植体或者愈伤组织并从中提取小檗碱、药根碱、非洲防己碱、巴马汀及其他生物碱。2.根据权利要求1所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，培养外植体所用的每升培养基中，含有2.37-9.58g ms培养基、30g蔗糖、10g琼脂、0.25-1.5mg 2，4-对氯苯氧乙酸、0.25-1.5mg6-糖基氨基嘌呤，且培养基的ph调至5.8，灭菌后使用。3.根据权利要求1所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述外植体采用细叶十大功劳的茎、叶或根。4.根据权利要求3所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述外植体优选采用细叶十大功劳的叶部分。5.根据权利要求4所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述外植体进一步优选采用细叶十大功劳幼嫩的叶片。6.根据权利要求1所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述消毒过程为：将所述外植体先用蒸馏水冲洗5～10分钟，然后于超净工作台将其转移至离心管内，依次采用无菌水摇晃洗涤3～4次、75％酒精洗涤20～30秒、1％～10％次氯酸钠溶液漂洗3～8分钟，再用无菌水洗涤3～4次。7.根据权利要求1所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述外植体消毒后修剪后剪成方片状，然后将其下表面贴于培养基表面进行培养。8.根据权利要求7所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述片状外植体的大小为0.5cm2。9.根据权利要求1所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述避光密闭培养时间为3～6天。10.根据权利要求9所述的一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，其特征在于，所述光照培养和黑暗培养各自的培养时长为12小时。

技术总结
本发明公开了一种利用细叶十大功劳高效生产多种天然生物碱类化合物的方法，属于生物技术组织培养领域。本发明以小檗科十大功劳属植物细叶十大功劳(Mahonia fortunei(Lindl.)Fedde)植株，尤其是幼嫩的叶片作为外植体开展组织培养研究，直至外植体边缘产生愈伤组织或完全愈伤化，但未褐化时终止。收集培养得到的愈伤组织，采用高效液相色谱(HPLC)法测定所得愈伤组织中各生物碱的含量，结果显示非洲防己碱、药根碱、巴马汀、小檗碱及其生物合成途径中多种生物碱的含量(干重百分比)相比原外植体有显著增加，能够实现细叶十大功劳生物合成途径中多种难以采用化学合成获得的微量生物碱的有效富集，为产业化生产提供了有益方法。为产业化生产提供了有益方法。为产业化生产提供了有益方法。


技术研发人员：蒋嘉俊 杨丙贤 张琳 张梦 陈瑶 田旭 钟卓珩 付红伟
受保护的技术使用者：红河创新技术研究院有限责任公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/11