木聚糖酶突变体及其应用和重组枯草芽孢杆菌的制作方法

1.本发明属于基因工程与蛋白改造技术领域，具体涉及木聚糖酶突变体及其应用和重组枯草芽孢杆菌。


背景技术：

2.木聚糖是一种多聚五碳糖，是异质多糖，广泛存在于植物基中，例如细胞壁。木聚糖酶(endo-1,4-β-xylanxylanhydrolase ec3.2.1.8)是一类能够将木聚糖降解为低聚木糖或者木糖的复合酶系，广泛应用于饲料、食品、生物燃料等领域，显示出在工业生产中的巨大潜力。
3.木聚糖酶种类繁多，来源也非常广泛，不同来源的木聚糖酶表现出不同的特性，同一物种也可以产生不同的木聚糖酶，因此，市场上木聚糖酶的种类和特性多种多样。针对不同的应用场景往往需要具有不同的酶学特性的木聚糖酶，以往针对木聚糖酶的耐盐性、耐热性、ph适应性、耐消化特性等做了较多研究，也取得了很多成果。如：cn202010447518.5记载了最适反应温度100℃的木聚糖酶；cn201610498150.9、cn201610498168.9和cn201610497299.5等专利申请记载了耐热、耐盐、抗消化的木聚糖酶；tim belie等人采用计算方式对木聚糖酶ph适应性进行改造，获得了低ph下酶活力更佳的突变体(protein engineering,design&selection vol.22no.10pp.587
–
596,2009)。这些为木聚糖酶在饲料、食品等领域的应用提供了基础。
4.但是，在当前提倡清洁生产、高质量发展的情况下，酶制剂的应用场景也在不断拓展，除了传统应用模式外，菌酶协同的方式在发酵中已有报道，开发促进微生物发酵的酶有助于开启木聚糖酶应用的新模式。有鉴于此，特提出本技术。


技术实现要素：

5.本技术的目的之一包括提供一种木聚糖酶突变体，该突变体的酶解产物对微生物发酵具有促进作用。
6.在本技术的第一方面，提供一种木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体由具有如seq id no.2所示序列的木聚糖酶突变获得，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和/或d119e，或者还包含d121p、r122n和r122d中的一个或者多个。
7.在本技术中的一些实施例中，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和/或d119e，还包含d121p以及r122n和r122d中一个。
8.在本技术中的一些实施例中，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和d119e，还包含d121p和r122n组合或者d121p和r122d的组合。
9.在本技术的第二方面，提供一种核酸片段，所述核酸片段编码第一方面中所述的木聚糖酶突变体。
10.在本技术的第三方面，提供一种重组载体，所述重组载体包含第二方面中所述的核酸片段。
11.在本技术中的一些实施例中，所述重组载体为pbe质粒或者pks1质粒。
12.在本技术的第四方面，提供一种大肠杆菌，所述大肠杆菌包含第三方面中所述的重组载体。
13.在本技术中的一些实施例中，所述大肠杆菌为dh5α菌株。
14.在本技术的第五方面，提供一种重组的枯草芽孢杆菌，所述重组的枯草芽孢杆菌产第一方面所述的木聚糖酶突变体，或者外源表达第二方面中所述的核酸片段，或者包含第三方面中所述的重组载体。
15.在本技术中的一些实施例中，所述枯草芽孢杆菌的基因型为：δspollacδsrfacδapreδnpreδnprbδeprδmprδbprδvprδwpra。
16.在本技术中的一些实施例中，所述枯草芽孢杆菌为bs168。
17.在本技术中的一些实施例中，所述重组的枯草芽孢杆菌在所述枯草芽孢杆菌bs168的apre位点插入了与ncbi数据库中序列不同源的随机片段，所述随机片段如seq id no.14所示。
18.在本技术中的一些实施例中，所述核酸片段整合在所述枯草芽孢杆菌的npre位点和/或epr位点。
19.在本技术的第六方面，提供一种酶制剂，包含第一方面中所述的木聚糖酶突变体以及辅料。
20.在本技术中的一些实施例中，所述辅料选自氯化钠或/和淀粉。
21.在本技术的第七方面，提供酶解木聚糖的产物在微生物发酵中的应用，酶解采用的酶选用第一方面中所述的木聚糖酶突变体或者第六方面中所述的酶制剂；
22.在本技术中的一些实施例中，所述应用具有如下技术特征中的一个或者多个：
23.(1)所述木聚糖的来源包含小麦、玉米或/和大豆；
24.(2)所述微生物选自乳酸菌或/和酵母菌。
25.在本技术中的一些实施例中，所述乳酸菌为植物乳酸菌。
26.在本技术中的一些实施例中，所述酵母菌为酿酒酵母。
27.在本技术的第八方面，提供第一方面中所述的木聚糖酶突变体或者第六方面中所述的酶制剂在制备饲料或者食品中的应用；
28.在本技术中的一些实施例中，所述应用具有如下技术特征中的一个或者多个：
29.(1)制备所述饲料的原料选自玉米、豆粕和麸皮中的一种或者多种；
30.(2)制备所述饲料采用厌氧发酵的方式。
31.在本技术中的一些实施例中，厌氧发酵采用的发酵微生物选自乳酸菌或/和酵母菌。
32.在本技术中的一些实施例中，所述乳酸菌为植物乳酸菌。
33.在本技术中的一些实施例中，所述酵母菌为酿酒酵母。
34.在本技术中的一些实施例中，所述食品的种类为酱类。
35.在本技术中的一些实施例中，制备所述酱类的原料选自黄豆和淀粉中的一种或者多种。
36.在本技术中的一些实施例中，制备所述酱类采用米曲霉发酵的方式。
37.相对于传统技术，本技术的有益效果包括：
38.本技术基于枯草芽孢杆菌的木聚糖酶，引入合适的突变，从而构建得到木聚糖酶突变体，该突变体的酶解产物对微生物发酵具有促进作用。并且，本技术构建的产木聚糖酶突变体的工程菌产酶水平高，具有ph、盐分和酒精适应性得以有效提升。同时，本技术的木聚糖酶突变体适合应用于大豆、小麦、玉米等大宗植物发酵制品的生产，以及大规模(例如20吨发酵规模)的酶制剂制备。
附图说明
39.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案、更完整地理解本技术及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
40.图1为连接p43启动子和amyq分泌信号肽的表达片段的质粒图谱；
41.图2为用于随机片段插入的pks1-random质粒图谱；
42.图3为整合随机片段的宿主细胞的验证；
43.图4为木聚糖酶突变体ph适应性分析；
44.图5为木聚糖酶突变体耐盐性分析；
45.图6为木聚糖酶突变体酒精稳定性分析；
46.图7为两个位点pks1整体载体的图谱。
47.本技术提供的枯草芽孢杆菌bacillus subtilis xlb03，命名为bacillus subtilis，该菌株已于2022年09月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no:62788；该菌株于2022年09月14日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2022年09月14日检测为存活菌株。
具体实施方式
48.下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
49.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
50.术语
51.除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
52.本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列
项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本技术中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“a及/或b”包括a、b和a+b三种并列方案。又比如，“a，及/或，b，及/或，c，及/或，d”的技术方案，包括a、b、c、d中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括a、b、c、d的任意的和所有的组合，也即包括a、b、c、d中任两项或任三项的组合，还包括a、b、c、d的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
53.本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
54.本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
55.本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
56.本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
57.本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
58.本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
59.本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
60.本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
61.本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
62.本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如
±
5℃、
±
4℃、
±
3℃、
±
2℃、
±
1℃的范围内波动。
63.本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
64.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本技术的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本技术中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本技术中的描述相冲突时，以本技术为准或者适应性地根据本技术的描述进行修正。
65.本技术的第一方面
66.本技术提供一种木聚糖酶突变体，所述木聚糖酶突变体由具有如seq id no.2所示序列的木聚糖酶突变获得，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和/或d119e，或者还包含d121p、r122n和r122d中的一个或者多个。所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点例如包含：t123s；d119e；t123s和d119e；t123s和/或d119e，以及d121p；t123s和/或d119e，以及r122n；t123s和/或d119e，以及r122d；t123s和/或d119e，以及d121p和r122n；t123s和/或d119e，以及d121p和r122d。
67.可选地，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和/或d119e，还包含d121p以及r122n和r122d中一个。
68.可选地，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和d119e，还包含d121p和r122n组合或者d121p和r122d的组合。
69.本技术的第二方面
70.本技术提供一种核酸片段，所述核酸片段编码第一方面中所述的木聚糖酶突变体。
71.本技术的第三方面
72.本技术提供一种重组载体，所述重组载体包含权利要求3所述的核酸片段。
73.可选地，所述重组载体为pbe质粒或者pks1质粒。
74.本技术的第四方面
75.本技术提供一种大肠杆菌，所述大肠杆菌包含权利要求4所述的重组载体。
76.可选地，所述大肠杆菌为dh5α菌株。
77.本技术的第五方面
78.本技术提供一种重组的枯草芽孢杆菌，所述重组的枯草芽孢杆菌产第一方面中所述的木聚糖酶突变体，或者外源表达第二方面中所述的核酸片段，或者包含第三方面中所述的重组载体。
79.可选地，所述枯草芽孢杆菌的基因型为：δspollacδsrfacδapreδnpreδnprbδeprδmprδbprδvprδwpra。
80.可选地，所述枯草芽孢杆菌为bs168。
81.可选地，所述重组的枯草芽孢杆菌在所述枯草芽孢杆菌bs168的apre位点插入了与ncbi数据库中序列不同源的随机片段，所述随机片段如seq id no.14所示。
82.可选地，所述核酸片段整合在所述枯草芽孢杆菌的npre位点和/或epr位点。
83.可选地，所述枯草芽孢杆菌为gdmcc no:62788。
84.本技术的第六方面
85.本技术提供一种酶制剂，包含第一方面中所述的木聚糖酶突变体以及辅料。
86.可选地，所述辅料选自氯化钠或/和淀粉，例如同时包含氯化钠和淀粉。
87.本技术的酶制剂，可以通过向含有木聚糖酶的发酵液中添加辅料然而喷雾干燥制备而来。
88.本技术的第七方面
89.酶解木聚糖的产物在微生物发酵中的应用，其特征在于，酶解采用的酶选用第一方面中所述的木聚糖酶突变体或者第六方面中所述的酶制剂；
90.可选地，所述应用具有如下技术特征中的一个或者多个：
91.(1)所述木聚糖的来源包含小麦、玉米或/和大豆；
92.(2)所述微生物选自乳酸菌或/和酵母菌；可选地，所述乳酸菌为植物乳酸菌；可选地，所述酵母菌为酿酒酵母。
93.本技术的第八方面
94.第一方面中所述的木聚糖酶突变体或者第七方面中所述的酶制剂在制备饲料或者食品中的应用。
95.可选地，所述应用具有如下技术特征中的一个或者多个：
96.(1)制备所述饲料的原料选自玉米、豆粕和麸皮中的一种或者多种；
97.(2)制备所述饲料采用厌氧发酵的方式。
98.可选地，厌氧发酵采用的发酵微生物选自乳酸菌或/和酵母菌。
99.可选地，所述乳酸菌为植物乳酸菌。
100.可选地，所述酵母菌为酿酒酵母。
101.可选地，所述食品的种类为酱类。
102.可选地，制备所述酱类的原料选自黄豆和淀粉中的一种或者多种。
103.可选地，制备所述酱类采用米曲霉发酵的方式。
[0104][0105]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
[0106]
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
[0107]
1.木聚糖酶表达载体及其突变体构建
[0108]
1.1xyna基因的扩增
[0109]
从ncbi数据库中检索枯草芽孢杆菌bs168菌种的xyna基因的开放阅读框，为了避免信号肽的干扰，将氨基酸序列经过signalip(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？signalp-5.0)预测，分析结果前28个氨基酸为信号肽。
[0110]
bs168xyna氨基酸序列(seq id no.1)：
[0111]
mfkfkknflvglsaalmsislfsatasa(信号肽)astdywqnwtdgggivnavngsgg nysvnwsntgnfvvgkgwttgspfrtinynagvwapngngyltlygwtrsplieyyvvdswgtyrptg tykgtvksdggtyd
iytttrynapsidgdrttftqywsvrqskrptgsnatitfsnhvnawkshgmnlg snwayqvmategyqssgssnvtvw*
[0112]
bs168xyna去除信号肽剩余的氨基酸序列记作(seq id no.2)：
[0113]
astdywqnwtdgggivnavngsggnysvnwsntgnfvvgkgwttgspfrtinynagvwapngngylt
[0114]
lygwtrsplieyyvvdswgtyrptgtykgtvksdggtydiytttrynapsidgdrttftqywsvrqskr ptgsnatitfsnhvnawkshgmnlgsnwayqvmategyqssgssnvtvw*
[0115]
因此设计引物扩增29-213肽段，以bs168菌种的基因组为模板，扩增xyna基因。
[0116]
上游引物hso376(seq id no.3)：acggaggatccgctagcacagactactggcaa
[0117]
下游引物hso377(seq id no.4)：aagtctctagattaccacactgttacgttagaacttc
[0118]
xyna基因扩增体系和运行程序如下表：
[0119]
表1
[0120][0121]
经过pcr扩增，获得大小约550bp的xyna基因片段。
[0122]
1.2表达载体构建
[0123]
利用bamhi和xbai限制性内切酶位点将基因片段连接到pbe载体，pbe载体预先连接了p43启动子和amyq分泌信号肽，图谱如图1所示。
[0124]
1.2.1酶切与胶回收
[0125]
(1)将扩增获得的xyna基因片段使用宝生物pcr产物纯化试剂盒进行纯化，按试剂盒说明书操作；
[0126]
(2)纯化后的与pbe载体分别使用bamhi和xbai进行酶切，酶切体系和条件如下表，酶切结束后，使用凝胶回收试剂盒进行酶切片段回收，按试剂盒说明书操作。
[0127]
表2
[0128][0129]
1.2.2连接与转化
[0130]
将回收的载体和xyna片段进行连接，连接体系和条件如下：
[0131]
表3
[0132][0133]
将10μl连接产物加入融化的100μl dh5α感受态中，轻轻混匀；置于冰上静置30分钟后，在42℃中水浴90秒，然后立即置于冰上静置3分钟，加入1ml lb培养基；在37℃震荡孵育30分钟后，8000rpm离心1分钟，去上清，菌体用100μl无菌生理盐水重悬，涂布含有50μg/ml氨苄青霉素的lb平板；37℃倒置培养12-16小时。
[0134]
1.2.3表达载体pbe-xyl的获得
[0135]
对获得的菌落使用xyna扩增引物进行菌落pcr验证，能够扩增出550bp条带的即为正确克隆，挑取正确菌落至含有50μg/ml氨苄青霉素5ml液体lb培养基，37℃震荡培养12-16小时后，使用质粒小提试剂盒提取质粒，按试剂盒说明书操作，表达载体命名为pbe-xyl。
[0136]
1.3突变体构建
[0137]
利用引物通过扩增pbe-xyl表达载体，引入突变t123s、d119e、d121p、r122n、r122d中的一个或多个构成木聚糖酶突变体。
[0138]
t123s突变体(seq id no.5)：
[0139]
mfkfkknflvglsaalmsislfsatasa(信号肽)astdywqnwtdgggivnavngsggn ysvnwsntgnfvvgkgwttgspfrtinynagvwapngngyltlygwtrsplieyyvvdswgtyrptgt ykgtvksdggtydiytttrynapsidgdrstftqywsvrqskrptgsnatitfsnhvnawkshgmnlgs nwayqvmategyqssgssnvtvw*
[0140]
d119e突变体(seq id no.6)：
[0141]
mfkfkknflvglsaalmsislfsatasa(信号肽)astdywqnwtdgggivnavngsgg nysvnwsntgnfvvgkgwttgspfrtinynagvwapngngyltlygwtrsplieyyvvdswgtyrptg tykgtvksdggtydiytttrynapsiegdrttftqywsvrqskrptgsnatitfsnhvnawkshgmnlg snwayqvmategyqssgssnvtvw*
[0142]
d119e/d121p/r122n/t123s(4m1)突变体(seq id no.7)：
[0143]
mfkfkknflvglsaalmsislfsatasa(信号肽)astdywqnwtdgggivnavngsggn ysvnwsntgnfvvgkgwttgspfrtinynagvwapngngyltlygwtrsplieyyvvdswgtyrptgt ykgtvksdggtydiytttrynapsiegpnstftqywsvrqskrptgsnatitfsnhvnawkshgmnlgs nwayqvmategyqssgssnvtvw*
[0144]
d119e\d121p\r122d\t123s(4m2)突变体(seq id no.8)：
[0145]
mfkfkknflvglsaalmsislfsatasa(信号肽)astdywqnwtdgggivnavngsggn ysvnwsntgnfvvgkgwttgspfrtinynagvwapngngyltlygwtrsplieyyvvdswgtyrptgt ykgtvksdggtydiytttrynapsiegpdstftqywsvrqskrptgsnatitfsnhvnawkshgmnlgs nwayqvmategyqssgssnvtvw*
[0146]
引物列表如下：
[0147]
表4
[0148][0149]
通过pcr方法将引物中设计的突变位点引入表达载体，pcr体系和程序如下：
[0150]
表5
[0151][0152]
pcr产物经过凝胶回收后使用t4pnk连接磷酸基团，处理方法如下：
[0153]
表6
[0154][0155]
胶回收产物经过t4pnk处理后，使用pcr纯化试剂盒进行纯化，操作按说明书进行。连接、转化和质粒的获得操作方法与1.2相同。
[0156]
本部分获得5种表达载体：pbe-xyl、pbe-xyl-t123s、pbe-xyl-d119e、pbe-xyl-4m1、pbe-xyl-4m2。
[0157]
2.木聚糖酶表达菌种的构建
[0158]
2.1随机片段标记底盘细胞
[0159]
以常用枯草芽孢杆菌bs168为底盘细胞，按照文献liu x,et al.microb cell fact.2018oct 22；17(1):163中公开的方法，敲除产孢基因和主要蛋白酶基因，获得基因型为δspollacδsrfacδapreδnpreδnprbδeprδmprδbprδvprδwpra的底盘细胞，命名为bs168δ10。为了区分菌种，利用pks1无痕编辑方法在apre位点插入一段与ncbi数据库中序列不同源的随机片段(即不存在于ncbi数据库中)，对底盘细胞进行标记。
[0160]
随机片段(seq id no.14)：
[0161]
tggccgcatttgcatctggggtggtttgtgggctgcgaagtcggttatatggtctgacacgttatgcgctgtgagacggctaacccgtagcacgtatcagtaagctcgcc
[0162]
ctacgtcatt
[0163]
在ncbi数据库中通过megablast和blastn均未找到同源序列。
[0164]
2.1.1标记质粒的获得
[0165]
利用引物拼接方法拼接获得这个随机片段，使用引物hso392与hso393扩增pks1质
粒获得载体片段，使用引物hso405与hso406扩增bs168δ10底盘细胞基因组获得apre左同源臂片段，使用引物hso407与hso408扩增bs168δ10底盘细胞基因组获得apre右同源臂片段，pcr方法同1.1中所述。
[0166]
表7
[0167][0168]
使用无缝连接试剂盒对获得的载体、左右同源臂、随机片段进行连接，并转化dh5α感受态细胞，转化方法和质粒提取方法与1.1相同，所不同的是涂布含有100μg/ml红霉素的lb平板，30℃下培养24-36小时，然后用含有相同抗生素的液体培养基培养并提取质粒。获得用于随机片段插入的pks1-random质粒，图谱如图2。
[0169]
2.1.2底盘细胞标记
[0170]
将pks1转化bs168δ10感受态细胞，
[0171]
感受态的制备：将bs168δ10菌株在lb培养基中37℃过夜培养；然后转接到含有0.5m山梨醇的lb培养基中继续培养至od600在0.7左右，放在冰水混合浴上孵育10min，然后5000rpm，10min，4℃收集菌体。菌体用em(0.5m山梨醇+0.5m甘露醇+10％甘油)洗涤3次，每次重悬后冰上静置10min再用5000rpm，10min，4℃收集；洗涤后用em进行重悬。分装80μl每支，用液氮速冻后置于超低温冰箱。
[0172]
枯草芽孢杆菌的电转化：每支感受态加入500ng质粒；静置10min，随后加入预冷的1mm电转杯中进行电击处理，电压为2010v，电转效率在1900-1960v；电转后用复苏培养液重悬置于2ml离心管中，孵育三小时涂于含有50ng/μl卡那霉素的平板上，30℃培养1-2天即可进行验证。
[0173]
随机片段的整合：将转化了pks1-random质粒的菌落在lb液体培养基中30℃培养24小时，然后稀释涂布到含有50ng/μl卡那霉素的lb平板，37℃升温培养12小时后，将长出的菌落接种到lb液体培养基中30℃培养36小时后，稀释涂布lb平板。37℃培养12小时后，将长出的菌落分别点至lb平板和含有50ng/μl卡那霉素的lb平板。37℃培养12小时后，挑选不能在含有抗生素平板生长的菌落即为正确克隆。
[0174]
随机片段的验证：采用pcr方法对获得的正确菌落进行验证，验证引物hso425和hso427位于整合同源臂外侧，hso425位于随机片段中，hso425和hso427为上游引物，hso426
为下游引物。正确的菌落用hso425和hso426、hso427和hso426引物pcr均能扩增获得dna片段，大小分别为671bp和1236bp；错误菌落因无随机片段，用hso425和hso427引物pcr无法获得dna片段，用hso427和hso426会获得较短的dna片段，大小为1076bp。经过验证，获得了整合随机片段的宿主细胞，命名为bs168δ10ram。
[0175]
表8
[0176][0177][0178]
结果见图3中，
[0179]
泳道1：正确菌落hso425+hso426扩增结果，
[0180]
泳道2：阴性对照，无抗性的错误菌落hso425+hso426扩增结果，
[0181]
泳道3：阴性对照，升温培养菌落hso425+hso426扩增结果，
[0182]
泳道4：阴性对照，宿主hso425+hso426扩增结果，
[0183]
泳道5：正确菌落hso427+hso426扩增结果，
[0184]
泳道6：阴性对照，无抗性的错误菌落hso427+hso426扩增结果，
[0185]
泳道7：阴性对照，升温培养菌落hso427+hso426扩增结果，
[0186]
泳道8：阴性对照，宿主hso427+hso426扩增结果。
[0187]
2.2表达菌种的构建与酶活测试
[0188]
2.2.1木聚糖酶表达菌种的构建
[0189]
将1.3中获得的5种不同xyna表达载体转化到bs168δ10ram，感受态制备和转化方法与前述中相同，转化后的平板在37℃培养12-24小时后，长出的菌落即为xyna表达菌种。
[0190]
2.2.2木聚糖酶酶活测定
[0191]
为了进一步表征木聚糖酶使用效果，本发明采用初步处理小麦做底物，具体以过60目筛后的小麦粉为底物，取1g小麦粉加入100ml缓冲液和0.03g纤维素酶(40000u/g)，50℃水浴酶解小麦粉30min；然后沸水浴5min将纤维素酶灭活，从悬浊液中离心取上清，加入不同来源木聚糖酶进行酶解，检测木聚糖酶活力。木聚糖酶活力定义为：在37℃、ph7.0的条件下，每小时从预处理小麦底物中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位u。
[0192]
对5种xyna表达菌种进行产酶分析，挑取表达菌种单菌落接种至含有100ml lb培养基的锥形瓶中，37℃震荡培养72小时后，检测酶活水平。结果见表9。
[0193]
2.2.3小麦酶解产物协同发酵测试
[0194]
测试木聚糖酶降解小麦木聚糖的产物对乳酸菌和酵母菌发酵的影响，测试方法如下：
[0195]
浓缩酶液的获得：适量的发酵液离心10分钟，转速12000rpm。取上清液使用0.22μm滤膜进行抽滤，抽滤清液使用5kd超滤膜进行超滤浓缩，浓缩5-10倍后，测定酶活，使用50mm ph7.2磷酸盐缓冲液调整酶活至20000u/ml。
[0196]
小麦酶解产物的制备：取10g小麦加入100ml水，加入0.3g纤维素酶(40000u/g和
1ml不同木聚糖酶的浓缩酶液，50℃水浴酶解小麦粉90min后，沸水浴5min进行灭酶，冷却后，离心取上清备用。
[0197]
测试菌种：植物乳杆菌zf632，酿酒酵母zb431
[0198]
培养基的配制：植物乳杆菌zf632使用mrs培养基(环凯027315)，实验组加入10％小麦酶解产物，对照组不加。酿酒酵母zb431使用ypd培养基，含10g/l酵母抽提物，20g/l蛋白胨，20g/l葡萄糖，实验组加入10％小麦酶解产物，对照组不加。
[0199]
协同发酵测试：
[0200]
植物乳杆菌zf632在mrs培养基培养48小时作为种子，以5％接种量分别接种到含有不同小麦酶解产物的mrs培养基中，以接种到不含小麦水解产物的mrs培养基作为对照，37℃静置培养3天后，过滤测定菌体湿重。
[0201]
酿酒酵母zb431在ypd培养基中培养12小时，以5％接种量分别接种到含有不同小麦酶解产物的ypd培养基中，以接种到不含小麦水解产物的ypd培养基作为对照，30℃震荡培养24小时后，过滤测定菌体湿重。
[0202]
协同发酵效果＝100％*(实验组湿重-对照组湿重)/对照组湿重
[0203]
结果见表9。
[0204]
表9
[0205][0206][0207]
突变体除了产酶水平差异外，酶解小麦产物对于乳酸菌和酵母菌也有不同程度的促进生长作用，综合产酶水平与协同发酵效果xyl-4m1突变体更优，即突变位点d119e\d121p\r122d\t123s，能够提升菌种产酶水平及酶解植物基的生物活性。
[0208]
2.3木聚糖酶突变体酶学特性
[0209]
xyl-4m1突变体对于微生物协同发酵具有更佳效果，对xyl-4m1酶学特性进行进一步分析。
[0210]
2.3.1ph适应性分析
[0211]
微生物发酵过程中ph大多呈酸性，更佳的低ph适应性对于突变体的作用更明显。测定xyl-4m1突变体和野生型在ph3.0、ph4.0、ph5.0、ph6.0、ph7.0、ph8.0、ph9.0条件下测定酶活，以最高酶活定义为100％，计算其他ph下的酶活保留率。ph3.0-6.0使用柠檬酸缓冲液，ph7.0-9.0使用tris-hcl缓冲液。
[0212]
测定xyl-4m1突变体和野生型在不同ph条件下的稳定性，将酶在ph3.0、ph4.0、ph5.0、ph6.0、ph7.0、ph8.0、ph9.0条件下处理2小时后，测定酶活。以最高酶活定义为100％，计算其他ph下的酶活保留率。
[0213]
结果见图4和图5。xyl-4m1突变体和野生型最适ph为6.0，但是突变体xyl-4m1更适合在酸性环境中使用，在ph5.0比酶活提升120％，在低ph下也更加稳定ph3.0环境下处理2小时，仍能保持40％酶活，ph5.0保持60％酶活，更适合在到饲料、物料等发酵偏酸的环境中
应用。
[0214]
2.3.2耐盐性分析
[0215]
测定xyl-4m1突变体和野生型在不同盐分下的催化特性和稳定性，测定酶在含5％、10％、15％、20％、25％(wt％)nacl浓度下测定酶活，定义最佳酶活为100％，计算比酶活。
[0216]
同时测定酶在不同nacl浓度下的稳定性，将酶在5％、10％、15％、20％、25％nacl浓度溶液中37℃处理2小时。定义最佳酶活为100％，计算比酶活。
[0217]
结果见图6和图7。
[0218]
xyl-4m1突变体和野生型在5％nacl下具有最佳酶活，但是在25％盐分下，4m1突变体仍有93％比酶活，相比野生型提升29％。
[0219]
2.3.3乙醇耐受性分析
[0220]
测定xyl-4m1突变体和野生型在不同酒精下的催化特性和稳定性，测定酶在含2％、4％、6％、8％、10％(v/v)酒精下测定酶活，定义最佳酶活为100％，计算比酶活。
[0221]
同时测定酶在不同酒精浓度下的稳定性，将含2％、4％、6％、8％、10％酒精溶液中37℃处理2小时。定义最佳酶活为100％，计算比酶活。
[0222]
结果见图6。
[0223]
xyl-4m1突变体相比野生型在6％酒精度下比酶活提升160％，在4％酒精浓度下处理2小时xyl-4m1突变体相比野生型比酶活提升116％。
[0224]
2.4饲料发酵协同效果
[0225]
小麦的木聚糖酶解产物对于乳酸菌和酵母菌的生长有一定促进作用，同时不同突变体也表现的效果也存在差异，其中xyl-4m1突变体更优。测试在固态发酵饲料中，xyl-4m1突变体和野生型的效果。
[0226]
以45wt％玉米、10wt％豆粕、45wt％麸皮为原料，加入5％植物乳杆菌zf632、酿酒酵母zb431复合菌剂，空白组不加酶，对照组加入0.25％纤维素酶和0.25％野生型木聚糖酶，实验组加入0.25％纤维素酶和0.25％xyl-4m1突变体木聚糖酶，厌氧发酵7天后测定干物质和粗蛋白含量。
[0227]
表10
[0228]
实验组别干物质(％)粗蛋白(％)空白组52.7816.19对照组53.0916.37实验组52.8417.25
[0229]
野生型木聚糖酶对于发酵饲料的干物质和粗蛋白均有一定提升，但是幅度不大；xyl-4m1突变体木聚糖酶则对粗蛋白提升明显，约6.5％，说明突变体xyl-4m1在饲料领域具有有益的应用效果。
[0230]
2.5酱类曲料发酵协同效果
[0231]
除了饲料领域的应用外，提升酶解植物基的生物活性的木聚糖酶在食品领域也有应用场景，如采用大豆小麦作为原材料的酱类曲料发酵中。
[0232]
将2000g黄豆浸泡8-10小时后，使用高压蒸汽灭菌锅灭菌，灭菌条件：121℃，15min。冷却后加入900g小麦粉，混合均匀。对照组分别加入100ml酶液(含10ml xyl酶液+1g
商品纤维素酶40000u/g)，实验组加入100ml酶液(含10ml xyl-4m1酶液+1g商品纤维素酶40000u/g)，空白组加入100ml无菌水。按0.5
‰
接种量接入沪酿3.042米曲霉菌种，进行制曲。制曲时间48小时，温度30℃，24小时翻曲一次。制曲结束后，测定成曲中性蛋白酶和酸性蛋白酶活水平。
[0233]
表11
[0234][0235]
制曲是酱类产品生产过程中非常关键的环节，在这个阶段，米曲霉对原材料初步降解，并产生丰富的酶系，为发酵阶段原材料进一步降解形成风味物质和其他有益微生物的代谢提供基础。发酵阶段木聚糖酶的加入对曲霉产酶有明显促进作用，突变体xyl-4m1相比野生型对米曲霉产酶的促进效果更明显，尤其是在酱醪体系更为重要的酸性蛋白酶，突变体xyl-4m1相比空白组提升22％，相比实验组也提升10％，说明突变体xyl-4m1具有有益的应用效果。
[0236]
2.6整合型表达菌种的构建
[0237]
将综合效果最佳的突变体采用pks1系统整合到bs168δ10ram基因组上，整合位点npre、epr两个拷贝，整合在npre位点的采用npre启动子和信号肽，epr位点则沿用表达质粒的启动子和信号肽，构建得到重组的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)xlb03，已于2022年9月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no:62788。pks1整体载体的构建方法、两个拷贝的整合过程于2.1中所述随机片段的整合过程一致，两个位点pks1整体载体的图谱如图7。
[0238]
引物列表：
[0239]
表12
[0240]
[0241]
3.酶制剂的获得
[0242]
3.1发酵
[0243]
3.1.1 500ml种子瓶培养
[0244]
lb培养基(wt％)：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，nacl 1％，泡敌0.5
‰
，自然ph7.0-7.3。
[0245]
用灭菌枪头接种lb平板上枯草芽孢杆菌的单菌落到三角瓶中，37℃220rpm恒温振荡培养12h。
[0246]
3.1.2 1t种子罐培养
[0247]
lb培养基500l(wt％)：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，nacl1％，泡敌0.5
‰
。
[0248]
灭菌条件：121℃蒸汽灭菌，灭菌保温时间40min，冷却后降温至37℃。
[0249]
接种：将1.2l培养好的摇瓶种子液接入1t种子罐中。
[0250]
培养：37℃，通气量36m3/h，保持搅拌，培养10-14小时。
[0251]
3.1.3 20t发酵罐培养
[0252]
发酵培养基(wt％)：葡萄糖1％、酵母粉1％、玉米浆6％、k2hpo40.2％、消泡剂0.1％，初始配料9t，121℃蒸汽灭菌，灭菌保温时间40min，冷却后降温至37℃。
[0253]
葡萄糖浆作为补料，2t糖浆管道输送到补料罐，121℃灭菌保温20min。补料罐夹套保温55-60℃防止葡萄糖结晶。
[0254]
发酵罐培养：从1t种子罐中移种500l种子液到20t发酵罐中，480-1050m3/h，转速25-50hz，维持do≥10％。过程用氨水调节ph，控制ph在7.0-8.0。每隔4小时测定葡萄糖，残糖维持10g/l。
[0255]
发酵至50小时停止补糖，测定酶活和葡萄糖，待糖耗尽后停止发酵。
[0256]
3.2后处理工艺
[0257]
停罐时设定罐温15℃，发酵液后处理流程为：离心过滤
→
微滤
→
超滤浓缩
→
微滤除菌
→
喷雾干燥。完整工艺处理后即得到液态酶制剂。
[0258]
按放罐体积添加2％(wt％)珍珠岩搅拌均匀，经三足离心机、蝶式离心机进行固液分离。
[0259]
离心后的清液经陶瓷膜进行微滤，微滤清液采用超滤浓缩减少发酵液体积，滤膜使用5000分子量规格，发酵液体积浓缩倍数4-5倍。
[0260]
浓缩后的澄清发酵液再经过0.2μm孔径陶瓷膜过滤除菌，除菌后的酶液加入8wt％氯化钠、5wt％淀粉进行喷雾干燥。
[0261]
根据上述实施例可知：4m1突变体相比野生型产酶水平提升16％，在ph5.0比酶活提升120％，在低ph下也更加稳定：ph3.0环境下处理2小时，仍能保持40％酶活，ph5.0保持60％酶活。在25％盐分下，4m1突变体仍有93％比酶活，相比野生型提升29％；4m1突变体相比野生型在6％酒精度下比酶活提升160％，在4％酒精浓度下处理2小时4m1突变体相比野生型比酶活提升116％。4m1突变体酶解小麦水解液均能提升乳酸菌和酵母菌发酵密度，相比野生型效果提升78％和100％。4m1突变体在玉米、豆粕、小麦混合饲料的菌酶协同发酵中提升6.5％，而对照组仅提升1％。4m1突变体应用于酱类曲料发酵中，成曲中性、酸性蛋白酶活提升17％、22％，而野生型仅提升8％，10％。
[0262]
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描
述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
[0263]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本技术的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

技术特征：
1.木聚糖酶突变体，其特征在于，所述木聚糖酶突变体由具有如seq id no.2所示序列的木聚糖酶突变获得，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和/或d119e，或者还包含d121p、r122n和r122d中的一个或者多个。2.根据权利要求1所述的木聚糖酶突变体，其特征在于，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和/或d119e，还包含d121p以及r122n和r122d中一个；可选地，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含t123s和d119e，还包含d121p和r122n组合或者d121p和r122d的组合。3.核酸片段，其特征在于，所述核酸片段编码权利要求1或者2所述的木聚糖酶突变体。4.重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求3所述的核酸片段；可选地，所述重组载体为pbe质粒或者pks1质粒。5.大肠杆菌，其特征在于，所述大肠杆菌包含权利要求4所述的重组载体；可选地，所述大肠杆菌为dh5α菌株。6.重组的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组的枯草芽孢杆菌产权利要求1或者2所述的木聚糖酶突变体，或者外源表达权利要求3所述的核酸片段，或者包含权利要求4所述的重组载体。7.根据权利要求6所述的重组的枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的基因型为：δspollacδsrfacδapreδnpreδnprbδeprδmprδbprδvprδwpra；可选地，所述枯草芽孢杆菌为bs168；可选地，所述重组的枯草芽孢杆菌在所述枯草芽孢杆菌bs168的apre位点插入了与ncbi数据库中序列不同源的随机片段，所述随机片段如seq id no.14所示；可选地，所述核酸片段整合在所述枯草芽孢杆菌的npre位点和/或epr位点。8.一种酶制剂，其特征在于，包含权利要求1或者2所述的木聚糖酶突变体以及辅料；可选地，所述辅料选自氯化钠或/和淀粉。9.酶解木聚糖的产物在微生物发酵中的应用，其特征在于，酶解采用的酶选用权利要求1或者2所述的木聚糖酶突变体或者权利要求8所述的酶制剂；可选地，所述应用具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)所述木聚糖的来源包含小麦、玉米或/和大豆；(2)所述微生物选自乳酸菌或/和酵母菌；可选地，所述乳酸菌为植物乳酸菌；可选地，所述酵母菌为酿酒酵母。10.权利要求1或者2所述的木聚糖酶突变体或者权利要求8所述的酶制剂在制备饲料或者食品中的应用；可选地，所述应用具有如下技术特征中的一个或者多个：(1)制备所述饲料的原料选自玉米、豆粕和麸皮中的一种或者多种；(2)制备所述饲料采用厌氧发酵的方式；可选地，厌氧发酵采用的发酵微生物选自乳酸菌或/和酵母菌；可选地，所述乳酸菌为植物乳酸菌；可选地，所述酵母菌为酿酒酵母；可选地，所述食品的种类为酱类；可选地，制备所述酱类的原料选自黄豆和淀粉中的一种或者多种；可选地，制备所述酱类采用米曲霉发酵的方式。

技术总结
本发明涉及一种木聚糖酶突变体及其应用和重组枯草芽孢杆菌，所述木聚糖酶突变体由具有如SEQ IDNo.2所示序列的木聚糖酶突变获得，所述木聚糖酶突变体的氨基酸突变位点包含T123S和/或D119E，或者还包含D121P、R122N和R122D中的一个或者多个。本申请基于枯草芽孢杆菌的木聚糖酶，引入合适的突变，从而构建得到木聚糖酶突变体，该突变体的酶解产物对微生物发酵具有促进作用。并且，本申请构建的产木聚糖酶突变体的工程菌产酶水平高，具有pH、盐分和酒精适应性得以有效提升。同时，本申请的木聚糖酶突变体适合应用于大豆、小麦、玉米等大宗植物发酵制品的生产，以及大规模的酶制剂制备。制备。制备。


技术研发人员：侯莎 童星 万吉林 谢景毅 黄博文
受保护的技术使用者：天典生物科技有限公司
技术研发日：2022.11.22
技术公布日：2023/7/11