年轻且无损伤的人血清白蛋白延长人类寿命的制作方法

1.本发明涉及生物医学领域，特别地涉及年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)在延长人类寿命中的用途。


背景技术：

2.长寿是人类永恒的追求。狂热追求永生的故事贯穿整个人类历史。具有讽刺意味的是，长生不老药从未被发现，而衰老却在继续。了解衰老的机制对于实现长寿梦想至关重要，但衰老的复杂性和系统性使得人们这一过程知之甚少。


技术实现要素：

3.本发明部分地基于如下令人惊讶的发现，即与盐水治疗组相比，在自然衰老小鼠模型中施用年轻且无损伤的重组小鼠血清白蛋白(rmsa)显著延长了寿命，增加了骨骼肌强度和认知能力。
4.本发明一方面提供了一种年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂，其中它表现出以下至少一种、优选全部性质：与从年轻人类个体获得的内源性hsa制剂相比，(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。
5.本发明另一方面提供了一种延长受试者寿命和/或抗衰老的方法，包括向受试者施用有效量的年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂的步骤，其中该制剂表现出以下至少一种、优选全部性质：与从所述受试者获得的内源性hsa制剂相比，(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。
附图说明
6.图1.rmsa治疗延长小鼠寿命
7.(a和b)用rmsa或盐水治疗的6m组中雌性(a)和雄性(b)小鼠的存活曲线。(c)用rmsa或盐水治疗的小鼠的代表性图像。
8.(d和e)用rmsa或盐水治疗的3m组中雌性(d)和雄性(e)小鼠的存活曲线。(f和g)用rmsa或盐水治疗的18m组中雌性(f)和雄性(g)小鼠的存活曲线。6m、3m和18m组(a-g)中的小鼠每3周用20mg/小鼠的rmsa或等容盐水治疗。(h和i)每3周用1.5mg的rmsa/g体重或等容盐水治疗的12m组中雌性(h)和雄性(i)小鼠的存活曲线。显示了中位生存期(以月计，m)和百分比增加。通过对数秩(mantel-cox)检验计算p值。n是用于每次分析的小鼠数量。
9.图2.rmsa对小鼠骨骼肌功能的影响
10.(a和b)12m组中用体重调整剂量的rmsa或盐水治疗的雌性(a)和雄性(b)小鼠的握力。(c)腓肠肌甲苯胺蓝染色。比例尺，50μm。(d-g)(c)中数据的统计结果。盐水治疗的小鼠；rsma治疗的小鼠，雌性，n＝4；雄性，n＝6。肌纤维的平均尺寸＝横截面积/纤维数量。(h)小
鼠mhc1(绿色)和4
′
,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)(蓝色)的免疫荧光染色。比例尺，50μm。(i和j)通过使用image j测定(h)中mhc1上的荧光强度。每3周用1.5mg rmsa/g体重或等容盐水治疗小鼠8个月。所有图表均表示平均值与sem，p值通过双尾t检验计算。n是用于每次分析的小鼠数量。
11.图3.rmsa对小鼠认知能力的影响
12.(a和c)12m组中雄性小鼠的主要逃逸率(a)和主要逃逸时间(c)的测量。(b)(a)的平均值。(d)(c)的平均值。(e)12m小鼠皮层中p-tau的代表性图像。比例尺，50μm。(f-h)基于(e)中数据的雄性和雌性小鼠皮层中p-au水平的统计结果。每3周用1.5mg/g体重的rmsa或等容盐水治疗小鼠8个月。所有图表均表示平均值与sem，p值通过双尾t检验计算。n是用于每次分析的小鼠数量。
13.图4.rmsa治疗改善了与衰老相关的四个参数
14.(a-d)1.5月龄、12月龄和28月龄小鼠血清样品中rmsa和内源性白蛋白的游离巯基(a)、羰基(b)、age(c)和hcy(d)水平。(e-h)12m组中用体重调整剂量的rmsa或等容盐水治疗的小鼠内源性白蛋白的游离巯基(e)、羰基(f)、age(g)和hcy(h)水平。(i-l)1.5月龄、12月龄和20月龄小鼠血清样品中rmsa和内源性白蛋白的游离巯基(i)、羰基(j)、age(k)和hcy(l)水平。所有图表均表示平均值与sem，p值通过双尾t检验计算。n是用于每次分析的小鼠数量。
15.图5.rmsa注射后21天，白蛋白的表达和蛋白水平可恢复正常。
16.(a)每只小鼠(n＝3)注射20mg的rmsa后，通过qrt-pcr测定肝脏中白蛋白基因的动态表达水平。(b)每只小鼠(n＝3)注射50mg的rmsa后，通过qrt-pcr测定肝脏中白蛋白基因的动态表达水平。(c)每只小鼠(n＝3)注射20或50mg的rmsa后1天(左上)和2-21天(右上)内血清白蛋白的动态蛋白水平。表(底部)显示了平均定量值。所有图表均表示平均值与sem。
17.图6.rmsa注射对总蛋白水平和白蛋白/球蛋白比率的影响
18.每只小鼠(n＝3)注射20或50mg的rmsa后1天(左上)和2-21天(右上)内的动态总蛋白水平(a)、总球蛋白水平(b)和白蛋白/球蛋白比率(c)。表(底部)显示了平均定量值。所有图表均表示平均值与sem。
19.图7.rmsa注射对主要血液生化参数的影响
20.主要血液生化参数的动态变化(以折线图显示.glu，谷氨酰胺；bun，血尿素氮；cho，胆固醇；tg，甘油三酯；ldh，乳酸脱氢酶；alt，丙氨酸转氨酶；ast，天冬氨酸转氨酶；alp，碱性磷酸酶；ggt，γ-谷氨酰转肽酶)。表(底部)显示了平均定量值。所有图表均表示平均值与sem。
21.图8.年轻且无损伤的rmsa治疗小鼠表现出更健康的外观
22.注射rmsa或盐水的老年雌性小鼠的代表性图像。后凸(kyphosis)如箭头所示。
23.图9.rmsa注射对体重的影响
24.每3周用20mg rmsa/小鼠或等容盐水治疗的(a)6m、(b)3m和(c)18m组中的雌性和雄性小鼠的体重。(d)每3周用1.5mg rmsa/g体重或等容盐水治疗的12m组中雌性和雄性小鼠的体重。所有图表均表示平均值与sem。
25.图10.巴恩斯迷宫测试中的代表性运动轨迹
26.(a)12m组中用盐水治疗的雄性小鼠的代表性运动轨迹。
27.(b)12m组中用1.5mg rmsa/g体重治疗的雄性小鼠的代表性运动轨迹。
28.图11.rmsa的完整蛋白质质谱
29.通过q-tof质谱法验证了rmsa的分子量。
30.图12.年轻且无损伤的rhsa与血液来源内源性hsa之间四个参数的比较。
31.(a-d)年轻且无损伤的rhsa和血液来源内源性hsa的游离巯基(a)、羰基(b)、age(c)和hcy(d)水平。所有图表均表示平均值与sem，p值通过双尾t检验计算。
具体实施方式
32.本文使用的术语“a”、“an”和“the”意指“一个和多于一个”或“至少一个”，除非上下文明确表示单数含义。
33.本文使用的术语“和/或”旨在包括一个或更多个所列项目的任何和所有可能组合。
34.本文使用的术语“comprises”和“comprising”(包括)旨在表示元件、组份、特征、步骤等的存在，但不排除任何其他元件、组份、特征、步骤等的存在。在本发明中，当提到产品包括某些组份时，应当理解，它还列举了仅由这些组份组成的产品。
35.术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药物载体、缓冲剂和赋形剂，包括缓冲盐水溶液、水和乳剂(如油/水或水/油乳液)，以及各种类型的润湿剂和/或佐剂。合适的药物载体及其制剂描述于remington's pharmaceutical sciences(mack publishing co.,easton,19
th ed.,1995)。优选的药物载体取决于活性成分剂的预期施用模式。
36.在本发明中，除非另有规定，否则序列取向为5’至3’。
37.本文使用的术语“人血清白蛋白”(human serum albumin)或“hsa”可以互换使用，并应在广义上进行解释。术语“人血清白蛋白”或“hsa”包括野生型人血清白蛋白(例如，参见基因名称：alb；ncbi id:213；uniprotkb-p02768)及其任何功能突变体，所述功能突变体包括一个或几个氨基酸残基的添加、缺失或替换，并保持与野生型hsa基本相同的生物学功能。hsa的生物学功能在本领域中是众所周知的。
38.本文使用的术语“年轻”hsa和“年轻且无损伤的”hsa具有相同的含义，可以互换使用，这意味着与特定hsa制剂(例如，从30岁的个体获得的hsa制剂)相比，蛋白质处于新鲜状态，没有大量的损伤。
39.技术人员将理解，术语“年轻且无损伤的”hsa并不严格要求绝对无损伤。即使并非完全不可能，制备如此完美的制剂也是非常困难的。为了本发明的目的，包含有限损伤的hsa制剂仍然是可接受的。
[0040]“年轻”hsa通常展示出以下至少一种，例如两种或三种，优选全部性质：(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。更年轻的hsa通常具有更高的游离巯基比率、更低的age、羰基和同型半胱氨酸水平。
[0041]
在一些实施方案中，“年轻”hsa展示出以下至少一种(例如两种或三种)、优选全部性质：(1)cys-34残基上游离巯基的比率大于50％，例如70％，特别是80％，优选90％，更优选大于95％，其通过ellman方法测定；(2)晚期糖化终末产物(age)的水平低于60μg/g蛋白质，优选40μg/g蛋白质，更优选低于30μg/g蛋白质，其通过elisa(cloud-clone co.,
ceb353ge)测定；(3)羰基的水平低于1.7nmol/mg蛋白质，优选低于1.5nmol/mg蛋白质，其通过protein carbonyl content assay kit(abcam)测定；和(4)同型半胱氨酸水平低于5nmol/g蛋白质，优选3.5nmol/g蛋白质，更优选低于2nmol/g蛋白质，其通过elisa(jianglai,jl10022)测定。
[0042]
本文使用的术语“制剂”是指通过工艺制备的材料。例如，hsa制剂可指从特定个体或从多个个体制备的hsa样品，其包含人血清白蛋白分子的群体。“制剂”可以是包装的商业产品，也可以是以溶液或冻干粉等形式制备的原料。
[0043]
四个参数及其测量
[0044]
游离巯基：野生型hsa(基因名称：alb；ncbi id:213；uniprotkb-p02768)含有一个还原的半胱氨酸残基(cys-34残基)，这意味着每个hsa分子有一个游离巯基。还原的cys-34残基的游离巯基基团可在体外和体内被氧化为氧化形式。
[0045]
hsa中游离巯基的比率意味着：
[0046][0047]
ellman方法：加入dtnb后，吸光度在412nm处增加。
[0048]
age：血清白蛋白是一种对糖化高度敏感的血浆蛋白。该过程也称为美拉德反应(maillard reaction)，是一种缓慢的非酶促反应，最初涉及葡萄糖或衍生物与白蛋白的游离胺基的连接，以可逆地形成席夫碱产物，导致在amadori重排后形成稳定的果糖胺残基(酮胺)。这是早期糖化过程：席夫碱和果糖胺被称为早期糖化加合物。amadori产物随后可环化，形成吡喃糖或呋喃糖碳水化合物加合物。这些早期糖化产物的进一步修饰，如重排、氧化、聚合和切割，产生不可逆的缀合物，称为晚期糖化终末产物(advanced glycation end products；age)。根据制造商说明书(cloud-clone co.,ceb353ge)，用酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒测量age的质量浓度。结果通过每次反应的hsa浓度归一化，并表示为微克age/g蛋白质。
[0049]
羰基：羰基含有与氧原子双键键合的碳原子。这里，羰基化意味着在hsa的氨基酸残基上形成羰基。protein carbonyl content assay kit(ab126287)用于定量hsa中的羰基。该方法基于dnph与蛋白质羰基的反应，该反应形成dnp腙，并可使用酶标仪在375nm吸光度下定量。根据手册，使用protein carbonyl content assay kit(abcam,ab126287)定量羰基摩尔浓度。结果通过每次反应的hsa浓度归一化，并以每毫克蛋白质的nmol羰基表示。
[0050]
hcy：同型半胱氨酸(hcy)由必需的膳食蛋白质氨基酸met代谢而来，被认为是一种非蛋白原性氨基酸，该非蛋白原性氨基酸被发现参与蛋白质翻译后修饰(ptm)。hcy可以通过与赖氨酸(lys)残基的异肽键与蛋白质连接(n-hcy-蛋白质)或通过与cys-34残基的二硫键与蛋白质连接(s-hcy-蛋白质)。n-同型半胱氨酸化是一种新型的ptm，它影响蛋白质的结构和功能并导致蛋白质损伤。n-同型半胱氨酸化由hcy硫内酯提供，而hcy硫内酯仅由hcy产生。hcy的摩尔浓度可通过elisa和hplc定量测定。在我们的研究中，根据制造商的说明，通过elisa测定hcy摩尔浓度(jianglai,jl10022)。结果通过每次反应的hsa浓度归一化，并以nmol hcy/克蛋白质表示。
[0051]
根据这项研究的结果，年轻的hsa会给接受它的人受试者带来明显的健康优势。
[0052]
发明人创造性地提出了通过以下四个参数定义hsa衰老状态的想法：(1)cys-34残
基上的游离巯基比率，(2)晚期糖化终末产物(age)水平，(3)羰基化水平，和(4)同型半胱氨酸化水平。
[0053]
在一个方面，本发明提供了一种年轻且无损伤的人血清白蛋白(human serum albumin；hsa)的制剂，其中它表现出以下至少一种(例如两种或三种)、优选全部性质：与从年轻人类个体获得的内源性hsa制剂相比，(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。
[0054]
术语“年轻”人类个体通常指30岁以下的人，优选18岁以下，更优选3岁以下，甚至1岁以下的人。
[0055]
在一个实施方案中，提供了一种年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂，其中它表现出以下至少一种、优选全部性质：(1)cys-34残基上游离巯基的比率大于50％，例如70％，特别是80％，优选90％，更优选大于95％，其通过ellman方法测定；(2)晚期糖化终末产物(age)的水平低于60μg/g蛋白质，优选40μg/g蛋白质，更优选低于30μg/g蛋白质，其通过elisa(cloud-clone co.,ceb353ge)测定；(3)羰基的水平低于1.7nmol/mg蛋白质，优选低于1.5nmol/mg蛋白质，其通过protein carbonyl content assay kit测定；和(4)同型半胱氨酸水平低于5nmol/g蛋白质，优选3.5nmol/g蛋白质，更优选低于2nmol/g蛋白质，其通过elisa(jianglai,jl10022)测定。
[0056]
在野生型hsa中，只有一个游离巯基位于cys-34残基上。技术人员将容易理解，如果该hsa是野生型hsa的功能突变体并且包含稍微不同的氨基酸序列，则cys-34残基可能位于与34稍微不同的位置上。该位置基于野生型hsa的氨基酸序列确定。
[0057]
在一个实施方案中，cys-34残基上游离巯基的比率通过ellman方法测定。优选地，cys-34残基上游离巯基的比率大于70％，特别是80％，优选90％，更优选大于95％。
[0058]
在一个实施方案中，age水平通过elisa(cloud-clone co.,ceb353ge)测定。优选地，age的水平低于60μg/g蛋白质，优选40μg/g蛋白质，更优选30μg/g蛋白质，其通过elisa测定。
[0059]
在一个实施方案中，通过protein carbonyl content assay kit(abcam)测定羰基的水平。优选地，羰基的水平低于1.7nmol/mg蛋白质，优选低于1.5nmol/mg蛋白质。
[0060]
在一个实施方案中，通过elisa测定同型半胱氨酸的水平(jianglai,jl10022)。优选地，同型半胱氨酸的水平低于5nmol/g蛋白质，优选3.5nmol/g蛋白质，更优选低于2nmol/g蛋白质。
[0061]
技术人员将理解，上述四个参数可以通过其他公认的方法来测试，并且通过不同方法从同一样品测试的参数的数值结果可能不同。技术人员将能够通过有限数量的实验将从不同方法测试的结果与通过本发明中使用的方法获得的结果进行比较。
[0062]
在优选的实施方案中，cys-34残基上游离巯基的比率大于80％，age水平低于30μg/g蛋白质，羰基水平低于1.5nmol/mg蛋白质，同型半胱氨酸水平低于2nmol/g蛋白质。
[0063]
年轻hsa的制剂可以重组产生或从血浆中纯化。优选地，重组产生hsa制剂。
[0064]
在另一方面，提供了一种年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂在延长受试者的寿命和/或抗衰老中的用途，其中它表现出以下至少一种、优选全部性质：与从所述受试者获得的内源性hsa制剂相比，(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。
[0065]
在这种情况下，与从受试者自身获得的内源性hsa制剂相比，受试者将通过接受“更年轻”的hsa制剂获得健康益处。例如，如果受试者是70岁，那么从年龄或衰老状态为70岁以下(例如50岁、40岁或30岁)的受试者获得的hsa制剂将是有效的。
[0066]
hsa制剂的衰老状态可以通过上述四个参数来评估。如果特定hsa制剂的四个参数中的几个或优选全部，优于从特定年龄，例如30岁，的受试者获得的制剂的参数，则该制剂被判定为处于低于30岁的衰老状态。
[0067]
提供了一种在受试者中延长寿命和/或抗衰老的方法，包括向受试者施用有效量的年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂的步骤，其中该制剂表现出以下至少一种、优选全部性质：与从所述受试者获得的内源性hsa制剂相比，(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。
[0068]
受试者可以是健康个体或患有疾病或受伤的患者。
[0069]
在一个实施方案中，该制剂表现出以下至少一种、优选全部性质：(1)cys-34残基上游离巯基的比率大于50％，例如70％，特别是80％，优选90％，更优选大于95％，其通过ellman方法测定；(2)晚期糖化终末产物(age)的水平低于60μg/g蛋白质，优选40μg/g蛋白质，更优选低于30μg/g蛋白质，其通过elisa(cloud-clone co.,ceb353ge)测定；(3)羰基的水平低于1.7nmol/mg蛋白质，优选低于1.5nmol/mg蛋白质，其通过protein carbonyl content assay kit测定；和(4)同型半胱氨酸水平低于5nmol/g蛋白质，优选3.5nmol/g蛋白质，更优选低于2nmol/g蛋白质，其通过elisa(jianglai,jl10022)测定。
[0070]
提供了一种药物组合物，其包含如本文所定义的年轻hsa和药学上可接受的载体。
[0071]
在另一方面，提供了一种用于监测受试者衰老状态变化的方法，包括：
[0072]
从该受试者获得人血清白蛋白(hsa)样品；
[0073]
在样品中测试hsa的以下四个参数中的至少一个，优选全部：(1)cys-34残基上的游离巯基比率，(2)晚期糖化终末产物(age)水平，(3)羰基化水平，和(4)同型半胱氨酸化水平；
[0074]
如果cys-34残基上游离巯基的比率增加和/或age水平、羰基化水平和/或同型半胱氨酸化水平降低，则与来自同一受试者的更早期测试的数据相比，确定受试者衰老状态得到改善。
[0075]
在另一方面，提供了一种改善受试者骨骼肌功能和/或改善认知能力的方法，包括向受试者施用有效量的如上所述的年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)制剂的步骤。
[0076]
为了避免免疫反应，所有动物研究均使用rmsa(重组小鼠血清白蛋白)进行，与来自不同年龄小鼠的内源性msa(小鼠血清白蛋白)相比，基于这四个参数，所使用的rmsa是年轻且无损伤的。基于rmsa在小鼠寿命(longevity)和健康寿命(healthspan)方面的改善，有理由预计年轻且无损伤的rhsa将在人类中获得类似的效果。
[0077]
实施例
[0078]
1972年，ludwig等人首次报道了在联体共生模型(parabiosis model)中更老的大鼠被更年轻的大鼠延长了寿命1。egerman组和villeda组分别发现，在与年轻小鼠进行联体共生手术后，老年小鼠的肌肉力量和认知能力得到改善
2,3
，这表明衰老的“奥秘”可能存在于血液中。作为循环系统的主要组成部分，血液可以通过影响全身的细胞和组织来调节衰
老过程。已经表明，人类血浆蛋白质组随着年龄而变化4。人们认为，衰老至少部分地是由于大分子的结构变化或损伤的持续累积造成的
5-7
。首先，据报道，氧化应激在衰老中起着至关重要的作用
8,9
，这与活性氧(reactive oxygen species；ros)破坏蛋白质有关。在人类中，随着年龄的增长，血浆巯基/二硫化物氧化还原状态(redst)变得更加促氧化
10,11
。其次，非酶促蛋白糖化的重要性在衰老研究中已被注意到
12-14
。老年人血浆晚期糖化终末产物(age)水平升高
15
。第三，在氧化环境中，羰基也形成了，特别是在蛋白质中的pro、arg、lys和thr残基的侧链上
16,17
。重要的是，羰基的浓度随着人们年龄的增长而增加
18
。第四，据广泛报道，同型半胱氨酸(hcy)随着年龄的增长而增加，并与年龄相关的退行性疾病相关
19-22
。hcy被发现与蛋白质共价结合，从而干扰其正常功能
23,24
。总之，血浆蛋白的损伤或不必要的修饰会随着年龄的增长而增加。有理由提出，减少血浆蛋白的损伤或不必要的修饰可能会延长寿命，甚至逆转衰老过程。
[0079]
人血清白蛋白(human serum albumin；hsa)是血浆中最丰富的蛋白质，其血清半衰期为约21天
25
。它不仅保持稳定的血浆胶体渗透压，而且是重要的载体
26
。hsa的这些功能赋予它各种临床应用
26
。
[0080]
除了基本的性质外，hsa的氧化和糖化(glycation)被广泛报道与一些病理状况有关。hsa的cys-34残基上的单一游离巯基已被提出占血浆中总游离巯基的约80％，其提供了抗氧化功能
27,28
。人们注意到，hsa巯基的氧化与衰老和与年龄相关的疾病密切相关
29
。leto等人发现，不仅游离巯基和hsa的浓度随着年龄的增长而降低，而且游离巯基与hsa的比率也随着年龄的增长而降低，这是由于衰老过程中氧化还原电位的变化导致的
30
。era等人认为hsa可以充当氧化还原缓冲液，以保持细胞外液体的恒定氧化还原电位
31
。年轻男性受试者中的还原态白蛋白的比率大于老年受试者。除了hsa中的巯基氧化外，发现羰基水平的升高也与衰老和各种疾病有关
32-34。白蛋白的糖化是与衰老和老年疾病有关的另一个重要因素。血清白蛋白作为一种长寿蛋白，在体内随着年龄的增长而积累age
35
。据广泛报道，糖化损害了白蛋白的正常功能，并可诱导炎症反应，这与衰老和严重疾病的进展有关
35,36
。此外，hsa是hcy修饰的主要靶点，因此它可以有效地保护其他蛋白质免受hcy的毒性
23,37
。因此，采用几乎没有损伤或不必要修饰的新鲜制备的重组血清白蛋白进行治疗，最有可能延长寿命(lifespan)和健康寿命(healthspan)。在这里，我们报告了与盐水治疗组相比，在自然衰老小鼠模型中年轻且无损伤的重组小鼠血清白蛋白(rmsa)治疗组显著延长了寿命，增加了骨骼肌强度和认知能力。
[0081]
实施例1：rmsa治疗延长小鼠寿命
[0082]
为了验证rmsa治疗是否能延长小鼠的寿命，选择不同年龄的c57bl/6n小鼠用于自然衰老模型。第一组(6m)的小鼠为6月龄，每3周静脉注射20mg的rmsa或等容盐水(isometric saline)，直至死亡。qrt-pcr和血液生化分析表明，白蛋白的mrna和蛋白质水平在第一次注射后8天内恢复正常之前有轻微波动(图5)。主要血液生化参数在正常水平下保持不变(图6，7)。
[0083]
每种性别的生存曲线显示，rmsa治疗小鼠的中值寿命分别增加了46.4％(雌性，增加了5.8个月，p《0.0001)和7.6％(雄性，增加了1.7个月，p＝0.0387，参见下文讨论)(图1a，b)。当达到中值寿命时，观察到两性外貌的变化。有趣的是，用rmsa治疗的小鼠比盐水治疗的小鼠具有更光泽和更厚的毛发(图1c)。此外，观察到盐水治疗组的后凸(kyphosis)比
rmsa治疗组更严重(图8)。这些现象表明，rmsa治疗对长期使用是安全的，并且可以延长6m组中c57bl/6n小鼠的寿命。
[0084]
我们提出，开始用rmsa治疗的小鼠越年轻，越可以取得更深远的效果。因此，在第二组(3m)中选择3月龄的小鼠，使用与6m组相同的剂量。令人惊讶的是，当与盐水治疗组相比时，rmsa治疗的雌性和雄性小鼠的中值寿命分别增加了69.4％(雌性，增加了7.5个月，p＝0.0093)和47.4％(雄性，增加了6.3个月，p＝0.0002)(图1d,e)。
[0085]
类似地，我们想知道rmsa治疗是否对老年小鼠有任何影响。在第三组(18m)中选择18月龄的小鼠。18m组的rmsa治疗小鼠的中值寿命在两种性别中均得到改善，雌性小鼠为9.0％(增加了2.0个月，p＝0.0414)，雄性小鼠为11.3％(增加了2.6个月，p＝0.8635)(图1f,g)。此外，在所有组中，rmsa对体重没有影响(图9)。
[0086]
我们注意到，在3m组和6m组中，雄性小鼠的寿命延长不如用相同量的rmsa治疗的雌性小鼠那样显著，这在18m组中没有观察到，可能是由于3m组和6m组中雌性和雄性小鼠之间的体重存在较大差异，但在18m中没有较大差异(图9)。因此，我们建议应根据体重调整rmsa的量，以获得等效剂量。
[0087]
将每只小鼠的rmsa剂量从每3周每克体重20mg调整至1.5mg。在第四组(12m)中选择12月龄的小鼠注射体重调整剂量。12m组中rmsa治疗小鼠的寿命显著改善，雌性为17.6％(增加了3.4个月，p＝0.0164)，雄性为20.3％(增加了3.9个月，p＝0.0342)(图1h,i)，这表明注射体重调整剂量可以减少两种性别之间寿命延长的差异。
[0088]
实施例2：rmsa增强小鼠骨骼肌功能
[0089]
小鼠寿命的惊人延长引发了我们进一步探索健康寿命是否也能得到改善。由于骨骼肌功能障碍经常在衰老过程中观察到，因此我们首先在12m组中检测了用体重调整剂量的rmsa或等容盐水治疗8个月的小鼠的握力变化。
[0090]
与盐水治疗的小鼠相比，12m组中rmsa治疗的小鼠前肢握力显著增加，雌性从177.9g增加到230.5g(增加了29.6％，p＝0.0002)，雄性从189.6g增加到222.5g(增加了17.4％，p＝0.0069)(图2a,b)。
[0091]
为了评估rmsa注射对体内骨骼肌尺寸和质量的影响，我们进一步对腓肠肌进行了组织学分析(图2c)。我们发现，与盐水组相比，rmsa治疗的雌性小鼠的肌纤维横截面积和平均尺寸分别显著增加(横截面积增加94.6％，p＝0.0304；平均尺寸增加405.2％，p＝0.0348)(图2d,e)。然而，在雄性小鼠中没有观察到类似的现象(图2f,g)。接下来，我们研究了rmsa和盐水治疗组中慢肌球蛋白重链i(mhc1)的表达水平，这是评估肌肉强度的另一个重要参数(图2h)。与盐水治疗的小鼠相比，用rmsa治疗的雄性小鼠呈现出明显更多的慢mhc1阳性纤维(增加了37.7％，p＝0.0327)，而在雌性小鼠中没有获得类似的结果(图2i,j)。总之，研究表明，rmsa治疗增强了雌性小鼠腓肠肌纤维的尺寸，并增加了雄性小鼠中慢mhc1的水平，但对纤维的数量和周长几乎没有影响。
[0092]
实施例3：rmsa治疗改善小鼠的认知能力
[0093]
接下来，我们使用巴恩斯迷宫测试(barnes maze test)研究了rmsa对衰老相关记忆损伤的影响。12m组的雄性小鼠被选择，用rmsa或盐水治疗8个月。与盐水治疗组相比，rmsa治疗组的主要逃逸率大幅增加(73.2％对比50.2％，增加了23.0％，p＝0.0016)(图3a,b)。同时，与盐水治疗的小鼠相比，rmsa治疗的雄性小鼠显示出显著减少的主要逃逸时间
(85.8秒对比133.4秒，快了47.6秒，p《0.0001)(图3c和d，图10a和b)。所有这些结果表明，rmsa治疗显著提高了衰老小鼠的空间学习和记忆能力。
[0094]
然后，我们使用这几组小鼠评估了与认知能力相关的组织学变化。令人兴奋的是，皮层的免疫荧光(if)染色结果显示，与盐水组相比，rmsa治疗显著降低了雄性小鼠的p-tau水平(降低了70.1％，p＝0.0012)(图3e,f)。然而，雌性组中没有显著差异，尽管rmsa治疗小鼠中的p-tau水平低于盐水治疗小鼠(降低了57.8％，p＝0.1469，图3e,g)。总之，注射rmsa可以降低小鼠的p-tau水平(降低了63.2％，p＝0.0036，图3h)，尤其是雄性小鼠。
[0095]
实施例4：rmsa治疗改善了与衰老相关的四个参数
[0096]
先前的研究表明，衰老与蛋白质损伤水平的增加密切相关，包括游离巯基的氧化、羰基化、age形成和同型半胱氨酸化，共四个参数。将来自1.5月龄、12月龄和28月龄小鼠的血清样品的内源性白蛋白进行纯化，用于比较。在衰老过程中，血清白蛋白经历了四个参数的一系列变化：游离巯基水平降低，羰基、age和hcy水平升高。本研究中使用的rmsa甚至比1.5月龄的年轻小鼠的内源性血清白蛋白更年轻，损伤更小。该rmsa含有更多的游离巯基(增加了18.1％，p＝0.0571)、相当的羰基水平、更少的age(降低了37.7％，p＝0.0589)、更少的hcy(rmsa中未检测到，p＝0.1215)(图4a-d)，这使rmsa能够提供更多的保护，防止不必要的修饰和损伤。
[0097]
为了探索年轻且无损伤的rmsa如何改善小鼠的寿命和健康寿命，每3周用1.5mg的rmsa/g体重或等容盐水治疗12月龄的小鼠8个月。最后一次注射后21天采集所有血清样本。与盐水治疗的小鼠相比，rmsa治疗的小鼠的白蛋白含有更多的游离巯基(增加了11.6％，p＝0.1635)、更低的羰基水平(减少了22.1％，p＝0.0230)、age水平(减少了24.4％，p＝0.0243)和同型半胱氨酸水平(减少了42.6％，p＝0.0370)(图4e-h)。
[0098]
用更大的样本量进行了额外的测试，以比较四个参数，其中获得了更明显的显著性。当与1.5月龄的小鼠的内源性血清白蛋白相比时，外源性rmsa含有更多的游离巯基(增加了95.5％，p＝0.0002)、更少的羰基(减少了13.0％，p＝0.2262)、更少的age(减少了40.6％，p＝0.0020)和更少的hcy(减少了80.9％，p＝0.0052)(图4i-l)，这使rmsa能够提供更多的保护，防止不必要的修饰和损伤。
[0099]
总之，年轻且无损伤的rmsa提供了强大的保护功能，防止游离巯基氧化、羰基化、age形成和同型半胱氨酸化。
[0100]
实施例5：年轻且无损伤的rhsa在与衰老相关的四个参数方面与内源性hsa不同
[0101]
为了找出年轻且无损伤的rhsa和内源性hsa之间的差异，从独立制造商购买了3种血液来源的内源性hsa产品进行比较研究，其中游离巯基、羰基、age和同型半胱氨酸如下所述进行测试。
[0102]
首先，使用ellman方法确定游离巯基的绝对量，该绝对量除以hsa的量(hsa分子理论上只有一个游离巯基)，以获得残余游离巯基含量的百分比。结果表明，rhsa(protgen)含有完整的游离巯基，而血液来源的hsa严重受损(102.8％对比17.6％，p《0.0001)(图12a)。
[0103]
其次，根据手册，使用protein carbonyl content assay kit(abcam,ab126287)定量羰基摩尔浓度。结果通过每次反应的hsa浓度归一化，并以每毫克蛋白质的nmol羰基表示。我们发现rhsa(protgen)的羰基水平低于血液来源的hsa(1.46对比1.80nmol/mg蛋白质，p＝0.0072)(图12b)。
[0104]
第三，根据制造商说明书(cloud-clone co.,ceb353ge)，用酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒测量age的质量浓度。结果通过每次反应的hsa浓度归一化，并表示为微克age/g蛋白质。显然，rhsa(protgen)比血液来源的hsa含有更少的age(21.4对比66.8μg/g蛋白质，p《0.0001)(图12c)。
[0105]
第四，根据制造商的说明(jianglai,jl10022)，通过elisa测定同型半胱氨酸(hcy)摩尔浓度。结果通过每次反应的hsa浓度归一化，并以每克蛋白质的nmol hcy表示。结果表明rhsa(protgen)的hcy水平远低于血液来源的hsa(1.46对比5.56nmol/g蛋白质,p＝0.0063)(图12d)。
[0106][0107]
讨论
[0108]
第1部分寿命
[0109]
在本发明中，在3m、6m和18m组中，rmsa治疗的寿命延长百分比对于雌性分别为69.4％、46.4％和9.0％；对于雄性分别为47.4％、7.6％和11.3％，通过长期rmsa治疗也可以显著提高健康寿命。这些结果表明，当治疗尽可能早开始时，应该能获得最佳效果。
[0110]
然而，在相同量的rmsa条件下，3m和6m组雄性小鼠的寿命延长百分比不如雌性小鼠明显。这可能是因为在这个年龄段，雄性小鼠的体重比雌性小鼠重得多。随后，我们根据体重调整rmsa的量，以给每只小鼠注射相等剂量，并在12m组的两种性别中获得一致的结果。因此，体重调整剂量对于取得最佳效果至关重要。
[0111]
第2部分健康寿命
[0112]
就健康寿命而言，使用体重调整剂量的rmsa治疗导致12m组小鼠前肢握力显著增加。rmsa治疗对握力的改善与寿命的改善是一致的，这表明rmsa很可能基于相同的基本原理调节寿命和健康寿命。
[0113]
此外，我们发现rmsa通过增加雄性小鼠中i型纤维的比例和增大雌性小鼠中肌纤维的尺寸，改善了腓肠肌的功能。雄性和雌性小鼠之间这些差异的一个解释可能是激素和代谢机制的差异。
[0114]
巴恩斯迷宫测试发现，rmsa注射可有效提高小鼠的空间学习和记忆能力，并显著降低老年小鼠皮层中的p-tau水平。在我们正在进行的项目中，rmsa注射对记忆改善的作用正在神经退行性疾病模型中被进一步验证。
[0115]
第3部分四个参数
[0116]
基于我们的分析，有理由提出年轻且无损伤的rmsa提供了强大的保护功能，防止游离巯基氧化、羰基化、age形成和同型半胱氨酸化。
[0117]
这里，在实施例中，“年轻”意味着rmsa比通过4个参数(游离巯基、羰基、age和同型
半胱氨酸)分析的仅1.5月龄的年轻小鼠的内源性白蛋白新鲜得多。“未受损”理论上是指完整的游离巯基、无age、无羰基化和无同型半胱氨酸化。在现实中，由于制备过程和检测方法的原因，几乎不可能得到如此完美的样品。
[0118]
因此，即使与1.5月龄的年轻小鼠的内源性血清白蛋白相比，rmsa含有更多的游离巯基、相当水平的羰基、更少的age和同型半胱氨酸。我们需要在此强调，在我们的样品中没有观察到其他损伤，因为通过质谱测量的分子量(图11)与理论计算值
38
完全相同。总之，本研究中使用的rmsa不仅“年轻”，而且几乎“无损伤”。
[0119]
我们意识到，rmsa和内源性白蛋白对小鼠寿命的影响应该平行比较。为了进行这项实验，内源性白蛋白应当从不同年龄的小鼠中制备，从非常年轻的(3个月)到非常老的(29个月，根据我们的数据)，无论何时使用rmsa。然而，足够纯度的内源性小鼠血清白蛋白在商业上是不可得的。此外，需要至少100,000只不同年龄的小鼠以纯化出纯度大于99％的足够量的白蛋白，这是不道德的。
[0120]
2016年，美国开始了一项临床试验，其目的是评估年轻供体(16-25岁)向更年长的成年人(≥35岁)输注血浆的有益效果，但迄今尚未公布结果(clinicaltrials.gov识别号：nct02803554)。最近，conboy小组报道了通过用含有5％内源性白蛋白的盐水交换旧血浆，使小鼠的肌肉、肝脏和海马恢复活力
39
。然而，这些研究都没有使用重组血清白蛋白，这使得结果无法比较。
[0121]
第4部分寿命和健康寿命的优化延长及其他蛋白质
[0122]
2014年，wyss-coray小组报道，年轻小鼠的血浆可以改善老年小鼠的学习和记忆。由于白蛋白占血浆总蛋白的约50％，它很可能在这一过程中发挥最重要的作用，这正是我们在这里发现的。为了实现rmsa对寿命的最大影响，正在研究各种措施，包括最佳剂量、频率和药物递送方法。我们预测，在耐受性和安全性得到保证的前提下，使用早期、缓释的高剂量rmsa，将更显著延长寿命和健康寿命。
[0123]
我们进一步预测，年轻且无损伤的白蛋白增加寿命的概念也可以应用于任何其他蛋白质，如免疫球蛋白、纤维蛋白原、转铁蛋白、转甲状腺素和触珠蛋白，它们是主要的血浆蛋白。
[0124]
已经充分证明，包括游离巯基、羰基、age和同型半胱氨酸在内的4个参数与各种疾病密切相关，如糖尿病、心血管疾病、肥胖症和阿尔茨海默病
20,24,40-43。
[0125]
看到单独一种年轻且无损伤的蛋白质(重组或非重组)hsa可以延长人类的寿命将是一件令人瞩目的事情，这将在不久的将来开始。如果是这样，年轻且无损伤的主要血浆蛋白的组合可以进一步延长寿命。理想情况下，所有年轻且无损伤的血浆蛋白在一起可以最大程度地延长寿命。
[0126]
方法
[0127]
小鼠和药物治疗
[0128]
c57bl/6n小鼠购自beijing vital river laboratory animal technology co.,ltd.(charles river laboratories在中国的经销商)。在运送至清华大学实验动物研究中心(thu-larc)期间，小心避免了小鼠运输应激综合征。所有小鼠被隔离一个月，以保证适应新环境，并进行质量检查。动物被保持在无病原体的屏障环境中，具有12小时的暗-光循环。室温保持在23℃。小鼠到达后，在整个研究过程中，给小鼠喂食辐照灭菌的jax-标准饲养食
品(xietong pharmaceutical bio-technology co.,ltd.,1010058)和无菌水。
[0129]
当小鼠达到指定年龄(3个月、6个月、12个月和18个月)时，将其随机分为rmsa或盐水治疗组。1公斤rmsa由shenzhen protgen,ltd友情提供。由毕赤酵母(pichia pastoris)表达的gmp级rmsa的质量受到严格控制，以确保纯度大于99％。最重要的是，通过elisa测定，宿主细胞蛋白(host cell proteins；hcps)小于1μg/g rmsa，这意味着我们的rmsa几乎不含hcps。
[0130]
缓慢静脉注射溶于盐水中的125mg/ml的rmsa。每次注射前均对小鼠称重以计算剂量，盐水用作阴性对照。如所指示的，每3周对小鼠进行注射，每只小鼠注射20mg的rmsa或每克小鼠体重注射1.5mg的rmsa和等容盐水。所有动物研究均获得清华大学动物保护和使用委员会(北京,中国)的批准。
[0131]
蛋白质水平测定
[0132]
为了测定血液生化参数，腹膜内注射(三溴乙醇，sigma aldrich，t48402)(400mg/kg)进行麻醉后，从小鼠尾静脉或眶窦采集血液样本。在4℃以1,000
×
g离心20分钟后收集血清样本。为了采集血浆样本，将肝素钠盐添加到新鲜血液样本(20单位/毫升血液，sigma-aldrich，h3149)中，以防止血液凝固，然后在4℃以1,000
×
g离心30分钟。用自动生化分析仪(olympus au 400)测定血清样本的主要血液生化参数。
[0133]
为了测定白蛋白的表达水平，麻醉后用二氧化碳对小鼠进行安乐死。快速取出肝组织样本并匀浆。使用trizol reagent(invitrogen,15596026)分离匀浆中的总rna，并使用first strand cdna synthesis kit(fermentas,k1622)将其转化为cdna。使用top green qpcr supermix(transgen biotech co.,aq131)进行定量rt-pcr(qrt-pcr)。使用2^-δδct方法分析相对定量。甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作内部对照。独立实验重复三次。使用以下引物：alb正向5
’‑
tgcttttccaggggtgtgtt，反向5
’‑
ttacttcctgcactaatttggca；gapdh正向5
’‑
gttgtctcctgcgacttca，反向5
’‑
ggtggtccagg gtttctta。
[0134]
握力试验
[0135]
握力使用握力计(yiyan co.ltd.,yls-13a)测量。让小鼠抓住金属网格，然后通过尾巴以恒定的速度轻轻向后拉动，直到小鼠无法再握住网格。每只小鼠进行五次试验，平均值用于表示单个小鼠的握力。
[0136]
巴恩斯迷宫试验
[0137]
12m组的雄性小鼠接受巴恩斯迷宫试验以评估空间记忆功能。在巴恩斯迷宫试验中，小鼠被训练去寻找与黑色逃生箱相连的孔，逃生箱位于圆形平台圆周周围。圆形平台直径91cm，厚度0.4cm，边缘周围有20个直径为5cm的均匀分布的孔，两个头顶灯作为厌恶性刺激。每个试验都由安装在平台上的摄像机记录。流程与rosenfeld等人描述的相似，但有修改
44
。
[0138]
白蛋白纯化
[0139]
在应用于预平衡的blue bestarosetmff柱(bestchrom)之前，用ph 7.8含有0.15m nacl的20mm tris缓冲液稀释指定组的血清样本，然后用3床体积洗涤非特异性结合蛋白。用洗脱缓冲液(0.2m nascn，ph 8.0)洗脱小鼠白蛋白，然后用pbs透析，并用超离
心过滤器在4℃用ultracel-30再生纤维素膜(merckmillipore,ufc803008)浓缩。蛋白质浓度根据制造商说明由piercetmbca protein assay kit(thermo scientific,23227)测定。在q-tof质谱仪(waters,synapt g2-si)上分析样本，该仪器被优化用于高质量蛋白质分子量分析。
[0140]
免疫荧光测定
[0141]
从小鼠切割的冷冻切片，用冷丙酮固定。然后用10％山羊血清封闭这些样本，并在4℃用一级抗体染色过夜，然后在4℃用适当的二级荧光标记抗体染色过夜。载玻片用fitc-、alexa 555-或alexa 647-缀合的二级抗体染色，细胞核用dapi染色。荧光成像在尼康a1激光扫描共焦显微镜上进行，并使用nis-elements software(nikon)进行分析。
[0142]
使用以下抗体：小鼠抗磷酸化tau的单克隆抗体(thermo scientific,mn1020)和抗mhc1抗体(sigma-aldrich,m 8421)。
[0143]
衰老相关参数确定
[0144]
ellman法用于测定游离巯基的含量
45
。将小鼠血清白蛋白和rmsa分别与等体积的5,5
’‑
二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(dtnb)试剂混合。本研究中使用的dtnb的体积和浓度分别为100μl和2mm。加入800μl的tris缓冲液(1m)，以使反应体系体积达到1000μl。将样本在室温下保持30分钟。在412nm处测量荧光吸光度。根据手册，使用protein carbonyl content assay kit(abcam,ab126287)对蛋白质样本中的羰基进行定量。根据制造商说明(meimian,1213)，通过酶联免疫吸附试验(elisa)测定同型半胱氨酸浓度。根据制造商说明(cloud-clone co.,ceb353ge)用elisa试剂盒测量age的浓度。
[0145]
统计分析
[0146]
kaplan
–
meier法用于生存分析，并通过对数秩(mantel-cox)检验比较生存曲线。使用双尾非配对student t-检验(2-tailed unpaired student t-test)或anova确定各组之间的统计显著性差异，其中p《0.05被认为是显著的。使用graphpad prism 6.01软件进行统计分析和图表绘制，除非另有说明。
[0147]
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技术特征：
1.一种年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂，其中它表现出以下至少一种、优选全部性质：与从年轻人类个体获得的内源性hsa制剂相比，(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述年轻个体低于30岁，优选低于18岁。3.一种年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂，其中它表现出以下至少一种、优选全部性质：(1)cys-34残基上游离巯基的比率大于50％，例如70％，特别是80％，优选90％，更优选大于95％，其通过ellman方法测定；(2)晚期糖化终末产物(age)的水平低于60μg/g蛋白质，优选40μg/g蛋白质，更优选低于30μg/g蛋白质，其通过elisa(cloud-clone co.,ceb353ge)测定；(3)羰基的水平低于1.7nmol/mg蛋白质，优选低于1.5nmol/mg蛋白质，其通过protein carbonyl content assay kit(abcam)测定；和(4)同型半胱氨酸水平低于5nmol/g蛋白质，优选3.5nmol/g蛋白质，更优选低于2nmol/g蛋白质，其通过elisa(jianglai,jl10022)测定。4.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中cys-34残基上所述游离巯基的比率大于80％。5.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述age水平低于30μg/g蛋白质。6.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述羰基的水平低于1.5nmol/mg蛋白质。7.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述同型半胱氨酸水平低于2nmol/g蛋白质。8.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述cys-34残基上游离巯基的比率大于80％，所述age水平低于30μg/g蛋白质，所述羰基水平低于1.5nmol/mg蛋白质，所述同型半胱氨酸水平低于2nmol/g蛋白质。9.根据前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述制剂是重组产生的或是从血浆中纯化的。10.年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂在延长受试者的寿命和/或抗衰老中的用途，其中它表现出以下至少一种、优选全部性质：与从所述受试者获得的内源性hsa制剂相比，(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。11.根据权利要求10所述的用途，其中所述制剂表现出以下至少一种、优选全部性质：(1)cys-34残基上游离巯基的比率大于50％，例如70％，特别是80％，优选90％，更优选大于95％，其通过ellman方法测定；(2)晚期糖化终末产物(age)的水平低于60μg/g蛋白质，优选40μg/g蛋白质，更优选低于30μg/g蛋白质，其通过elisa(cloud-clone co.,ceb353ge)测定；(3)羰基的水平低于1.7nmol/mg蛋白质，优选低于1.5nmol/mg蛋白质，其通过protein carbonyl content assay kit(abcam)测定；和(4)同型半胱氨酸水平低于5nmol/g蛋白质，优选3.5nmol/g蛋白质，更优选低于2nmol/g蛋白质，其通过elisa(jianglai,jl10022)测定。12.根据前述权利要求10-11中任一项所述的用途，其中cys-34残基上所述游离巯基的比率大于80％。
13.根据前述权利要求10-12中任一项所述的用途，其中所述age水平低于30μg/g蛋白质。14.根据前述权利要求10-13中任一项所述的用途，其中所述羰基的水平低于1.5nmol/mg蛋白质。15.根据前述权利要求10-14中任一项所述的用途，其中所述同型半胱氨酸水平低于2nmol/g蛋白质，其通过elisa测定。16.根据前述权利要求10-15中任一项所述的用途，其中所述cys-34残基上游离巯基的比率大于80％，所述age水平低于30μg/g蛋白质，所述羰基水平低于1.5nmol/mg蛋白质，所述同型半胱氨酸水平低于2nmol/g蛋白质。17.根据前述权利要求10-16中任一项所述的用途，其中所述受试者是患者或健康个体。18.一种延长受试者寿命和/或抗衰老的方法，包括向所述受试者施用有效量的年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)的制剂的步骤，其中所述制剂表现出以下至少一种、优选全部性质：与从所述受试者获得的内源性hsa制剂相比，(1)cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(age)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述制剂表现出以下至少一种、优选全部性质：(1)cys-34残基上游离巯基的比率大于50％，例如70％，特别是80％，优选90％，更优选大于95％，其通过ellman方法测定；(2)晚期糖化终末产物(age)的水平低于60μg/g蛋白质，优选40μg/g蛋白质，更优选低于30μg/g蛋白质，其通过elisa(cloud-clone co.,ceb353ge)测定；(3)羰基的水平低于1.7nmol/mg蛋白质，优选低于1.5nmol/mg蛋白质，其通过protein carbonyl content assay kit(abcam)测定；和(4)同型半胱氨酸水平低于5nmol/g蛋白质，优选3.5nmol/g蛋白质，更优选低于2nmol/g蛋白质，其通过elisa(jianglai,jl10022)测定。20.根据前述权利要求18-19中任一项所述的方法，其中cys-34残基上所述游离巯基的比率大于80％。21.根据前述权利要求18-20中任一项所述的方法，其中所述age水平低于30μg/g蛋白质。22.根据前述权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述羰基的水平低于1.5nmol/mg蛋白质。23.根据前述权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述同型半胱氨酸水平低于2nmol/g蛋白质，其通过elisa测定。24.根据前述权利要求18-23中任一项所述的方法，其中所述cys-34残基上游离巯基的比率大于80％，所述age水平低于30μg/g蛋白质，所述羰基水平低于1.5nmol/mg蛋白质，所述同型半胱氨酸水平低于2nmol/g蛋白质。25.根据前述权利要求18-24中任一项所述的方法，其中所述受试者是患者或健康个体。26.药物组合物，其包含权利要求1-9中任一项所定义的年轻且无损伤的人血清白蛋白制剂和药学上可接受的载体。
27.用于监测受试者衰老状态变化的方法，包括：从所述受试者获得人血清白蛋白(hsa)样品；在所述样品中测试hsa的以下四个参数中的至少一个，优选全部：(1)cys-34残基上的游离巯基比率，(2)晚期糖化终末产物(age)水平，(3)羰基化水平，和(4)同型半胱氨酸化水平；当与来自同一受试者的更早测试的数据相比，如果cys-34残基上游离巯基的比率增加和/或age水平、羰基化水平和/或同型半胱氨酸化水平降低，则确定受试者衰老状态得到改善。28.改善受试者骨骼肌功能和/或改善认知能力的方法，包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1-9中任一项所定义的年轻且无损伤的人血清白蛋白(hsa)制剂的步骤。

技术总结
本发明提供了一种延长受试者寿命和/或抗衰老的方法，包括向所述受试者施用有效量的年轻且无损伤的人血清白蛋白(HSA)的制剂的步骤，其中所述制剂表现出以下至少一种、优选全部性质：与从所述受试者获得的内源性HSA制剂相比，(1)Cys-34残基上的游离巯基比率更高，(2)晚期糖化终末产物(AGE)水平更低，(3)羰基化水平更低，和(4)同型半胱氨酸化水平更低。和(4)同型半胱氨酸化水平更低。


技术研发人员：罗永章 付彦 唐嘉泽 巨安基 黎博雅 龚元超 张少森 常国栋 李辉
受保护的技术使用者：深圳普罗吉医药科技有限公司
技术研发日：2021.08.11
技术公布日：2023/7/7