TFEB激活和溶酶体生物发生的方法以及用于其的组合物与流程

tfeb激活和溶酶体生物发生的方法以及用于其的组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年8月3日提交的美国临时申请第63/060,611号和2021年2月17日提交的美国临时申请第63/150,520号的优先权，所述临时申请整体并入本文。
3.序列表
4.根据37cfr 1.52(e)(5)，ascii文本文件形式的序列表(名称为“2013075-0043_sl.txt”，创建于2021年7月22日，并且大小为4,821字节)通过引用整体并入本文。


背景技术：

5.离子稳态和酸性ph是溶酶体降解能力的紧密关联的决定因素，并且这些特性的改变可导致疾病。虽然已知溶酶体膜通道调控离子通量，但溶酶体如何局部感测此类变化和细胞如何反应尚不清楚。


技术实现要素：

6.本公开尤其提供了如下见解：通过gabarap蛋白质(gabarap、gabarapl1、gabarapl2)的脂质化和后续接合来刺激、稳定、定位和/或以其他方式增加gabarap/flcn/fnip复合物的膜定位可不依赖于mtorc1活性而激活tfeb和/或可以其他方式增加自噬。
7.可选地或另外地，在一些实施方案中，本公开提供了如下见解：激动trpml1可刺激、稳定、定位和/或以其他方式增加lamp1阳性胞质表面(例如，溶酶体膜表面)的gabarap/flcn/fnip复合物的水平。
8.本公开还提供了用于评估增加自噬和/或激动trpml1和/或刺激、稳定、定位和/或以其他方式增加lamp1阳性胞质表面(例如，溶酶体膜表面)的gabarap/flcn/fnip复合物水平的剂的技术；再进一步地，本公开还提供了如下的见解：此类剂可用于治疗某些疾病、病症或疾患，包括可能与负责gabarap膜定位的接合机制的缺陷相关的和/或可能受益于自噬增加的那些疾病、病症或疾患。
9.在一个方面，本公开提供了不依赖于mtorc1活性而激活tfeb的方法，所述方法包括使系统与trpml1激动剂接触的步骤，所述系统包含含有lamp-1、vatp酶或gabarap的膜以及gabarap/flcn/fnip复合物的组分，使得所述膜处的gabarap/flcn/fnip复合物的水平升高。在一些实施方案中，包含lamp-1vatp酶或gabarap的膜限定了隔室。在一些实施方案中，隔室是或包含溶酶体。在一些实施方案中，膜是或包含溶酶体膜。在一些实施方案中，溶酶体膜是完整溶酶体的一部分。在一些实施方案中，溶酶体处于细胞中。
10.在另一方面，本公开提供了不依赖于mtorc1活性而激活tfeb的方法，所述方法包括施用trpml1激动剂的步骤。在一些实施方案中，施用步骤包括使系统与trpml1激动剂接触，其中所述系统包含溶酶体膜和gabarap/flcn/fnip复合物的组分。
11.在一些实施方案中，系统在编码接合机制蛋白质的基因(接合机制基因)和/或编码gabarap/flcn/fnip复合物的组分的基因中具有多态性或突变。在一些实施方案中，接合机制基因选自由atg3、atg5、atg7、atg12、atg16l1和其组合组成的组。在一些实施方案中，
接合途径基因是atg16l1。在一些实施方案中，多态性是t300a。
12.在一些实施方案中，trpml1激动剂属于选自由多肽、核酸、脂质、碳水化合物、小分子、金属和其组合组成的组的化学类别。
13.在一些实施方案中，施用步骤包括在多种条件下将系统暴露于trpml1激动剂并持续足够的时间，使得相对于在所述暴露之前的情况，在所述系统中观察到一种或多种clear网络基因的表达或活性增强和/或可检测的胞吐活性、自噬、溶酶体贮积物质清除和溶酶体生物发生中的一者或多者的增强。在一些实施方案中，施用步骤包括在多种条件下将系统暴露于trpml1激动剂并持续足够的时间，使得相对于在所述暴露之前的情况，在所述系统中观察到选自表1的一种或多种基因的表达或活性增强。
14.在一些实施方案中，trpml1激动剂的特征在于，当评估对clear网络基因的表达的影响时，其显示出比在饥饿条件下观察到的更受限的影响。在一些实施方案中，trpml1激动剂的特征在于，在可比条件下，其存在时的trpml1水平或活性高于其不存在时的trpml1水平或活性。
15.在一些实施方案中，trpml1激动剂是直接激动剂，因为其与trpml1相互作用。在一些实施方案中，trpml1激动剂是间接激动剂，因为其不直接与trpml1相互作用。
16.在另一方面，本公开提供了治疗trpml1相关的疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括向患有或易患trpml1相关的疾病、病症或疾患的受试者施用trpml1激动剂的步骤。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含炎症性疾患。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含溶酶体贮积症。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含聚谷氨酰胺病症。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含神经退行性蛋白病。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是感染性疾病。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患选自由克罗恩病(crohn's disease)、庞贝病(pompe disease)、帕金森病(parkinson's disease)、亨廷顿病(huntington's disease)、阿茨海默病(alzheimer's disease)、脊髓延髓肌萎缩、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症和多发性硫酸酯酶缺乏症组成的组。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是克罗恩病。
17.在另一方面，本公开提供了通过增强细胞内膜表面的gabarap/fnip/flcn复合物定位来激活tfeb的方法。在一些实施方案中，细胞内膜表面是细胞内隔室的胞质表面。在一些实施方案中，细胞内隔室是溶酶体。在一些实施方案中，细胞内隔室是线粒体。在一些实施方案中，细胞内隔室是内质网。在一些实施方案中，细胞内隔室是病原体液泡。在一些实施方案中，细胞内隔室是内体结构。
18.在一些实施方案中，方法包括施用trpml1激动剂。在一些实施方案中，tfeb激活不依赖于mtorc1活性。
19.在另一方面，本公开提供了表征tfeb激活剂的方法，所述方法包括评估对一种或多种细胞内膜表面的flcn定位和/或gabarap/fnip/flcn复合物的水平的影响。
20.在另一方面，本公开提供了治疗接合机制相关的(“cma”)疾病、病症或疾患或者gabarap/fnip/flcn复合物相关的疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括施用trpml1激动剂的步骤。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患是或包含克罗恩病。
21.在另一方面，本公开提供了包括用于表征tfeb、tfe3和/或mitf的激活剂的细胞测
定的方法，其中所述细胞测定包括包含以下的细胞：vatp酶小分子抑制剂的存在；atg8接合机制的遗传破坏；atg8接合机制的小分子抑制剂的存在；蛋白质的gabarap亚家族成员的遗传破坏；fnip1或fnip2中lir结构域的突变；或其组合。在一些实施方案中，vatp酶小分子抑制剂是巴佛洛霉素a1(bafilomycin a1)。在一些实施方案中，vatp酶小分子抑制剂不是水杨酰卤酰胺a(salicylihalamide a)的类似物。在一些实施方案中，atg8接合机制的遗传破坏包括基因敲除、基因敲入、一种或多种突变等位基因的表达、sirna、shrna、反义，或其组合。在一些实施方案中，蛋白质的gabarap亚家族成员的遗传破坏包括基因敲除、基因敲入、一种或多种突变等位基因的表达、sirna、shrna、反义，或其组合。
附图说明
22.附图仅用于说明目的，而不是限制。
23.图1显示了说明不同处理对lc3脂质化的示例性影响的蛋白质印迹(western blot)。
24.图2显示了说明不同处理对lc3脂质化的示例性影响的细胞图像。
25.图3显示了说明不同处理对lc3脂质化的示例性影响的蛋白质印迹。
26.图4显示了说明azd8055、ebss饥饿和巴佛洛霉素a1(bafa1)对lc3脂质化的示例性影响的蛋白质印迹。
27.图5显示了说明敲除trpml1(mcoln1)对lc3脂质化的示例性影响的蛋白质印迹。
28.图6显示了说明处理后l3c脂质化未伴随溶酶体碱化或膜损伤的细胞图像。
29.图7显示了说明用trpml1激动剂c8处理后atg8(lc3b或gabarapl1)与溶酶体标志物lamp1共定位的细胞图像。
30.图8显示了说明用trpml1激动剂c8处理后atg8(lc3b或gabarapl1)与溶酶体标志物lamp1共定位的图。
31.图9显示了说明在atg16l1 ko细胞中引入atg16l1突变型k490a时，trpml1激动剂(例如，c8)诱导的lc3斑点形成被消除的细胞图像。
32.图10显示了说明用c8或azd8055处理后溶酶体的gfp-lc3结构特征的超微结构相关光学电子显微镜检查(clem)图像。
33.图11显示了说明沙门氏菌属(salmonella)sopf对vatp酶募集atg16l1的损害以及用c8或azd8055处理后sopf诱导对lc3-ii形成的影响的图表和蛋白质印迹。
34.图12显示了说明用c8或ml-sa1处理对野生型细胞或atg16l1
k490a
细胞中与lamp1共定位的lc3斑点形成的影响的细胞图像。
35.图13显示了说明钙调磷酸酶参与trpml1激动剂对tfeb激活的影响的图。
36.图14显示了说明钙调磷酸酶参与trpml1激动剂对tfeb激活的影响的图。
37.图15显示了说明用trpml1激动剂处理的细胞中的sopf表达对tfeb核积累的影响的图。
38.图16显示了说明bafa1和azd8055对通过trpml1激动剂(mk6-83和c8)激活tfeb的影响的蛋白质印迹。
39.图17显示了说明敲除fip200、atg9a、vps34、atg5、atg7或atg16l1对tfeb激活和lc3接合的影响的蛋白质印迹。
40.图18显示了说明atg16l1的敲除、与bafa1的共处理或营养饥饿(ebss)对通过trpml1激动剂(c8)激活tfeb的影响的蛋白质印迹。
41.图19显示了说明展示出离子载体特性和调控单膜atg8接合的药物对tfeb激活的影响的图。
42.图20显示了说明若干atg16l1等位基因(包括fip200结合突变体(δfbd)和c末端结构域截短(δctd))对用trpml1激动剂(c8)处理的atg16l1敲除细胞中的tfeb表达的影响的蛋白质印迹。
43.图21显示了说明在存在trpml1激动剂(例如，c8和ml-sa1)的情况下用wd40点突变atg16l1-f467a(f467a)和atg16l1-k490a(k490a)重构的atg16l1 ko小鼠巨噬细胞未表现出tfeb激活的细胞图像。
44.图22显示了说明用trpml1激动剂处理后对照和atg16l1敲除细胞中的靶基因表达的图。
45.图23显示了说明用trpml1激动剂处理后野生型和atg16l1敲除细胞中的转录组反应的热图。
46.图24显示了说明用trpml1激动剂处理后野生型和atg16l1敲除细胞中的转录组反应的热图。
47.图25显示了说明trpml1激活对lysotracker阳性细胞器数量和强度的影响的图a中的细胞图像以及图b和图c中的图。
48.图26显示了说明用trpml1激动剂处理时gabarap蛋白质参与tfeb激活的蛋白质印迹和图。
49.图27显示了说明gabarap与flcn-fnip复合物共免疫沉淀的蛋白质印迹。
50.图28显示了说明包含gabarap的lir结构域停泊位点(lds)的突变的gabarap蛋白质对降低flcn-fnip复合物的影响的蛋白质印迹。
51.图29显示了说明响应于溶酶体通量的变化的gabarap与溶酶体膜的直接接合和对flcn/fnip复合物的影响的图表。
52.图30显示了说明trpml1激活后膜相关flcn和fnip1的增加的蛋白质印迹。
53.图31显示了说明trpml1激动剂对flcn与溶酶体蛋白质lamp1的共定位的影响的细胞图像。
54.图32显示了说明用trpml1激动剂处理后flcn和fnip1的募集的蛋白质印迹。
55.图33显示了说明在缺乏ragulator复合物组分lamtor1的细胞中用trpml1激动剂处理后的flcn和fnip1的蛋白质印迹。
56.图34显示了说明在野生型和nprl2 ko细胞中在营养丰富条件下敲除flcn对tfeb的核易位的影响的细胞图像和蛋白质印迹。
57.图35显示了说明在trpml1激活后锁定在活性状态的raggtp酶对tfeb的影响的蛋白质印迹。
58.图36显示了说明非trpml1刺激物对flcn的gabarap依赖性封存的影响的蛋白质印迹。
59.图37显示了说明在溶酶体离子含量改变时tfeb激活的细胞机制的图表。
60.图38显示了说明gabarap和flcn-fnip2复合物在尺寸分级柱中的共纯化的图。
61.图39显示了说明gabarap和flcn-fnip2之间的结合位点的图和蛋白质结构模型。
62.图40显示了说明gabarap lir结构域参与与flcn-fnip1复合物的相互作用的蛋白质印迹。
63.图41显示了说明fnip1 lir中的突变对fnip1和flcn之间的相互作用的影响的蛋白质印迹。
64.图42显示了说明fnip1/fnip2双敲除细胞中的tfeb和tfe3激活的蛋白质印迹和细胞图像。
65.图43a显示了用dmso、饥饿或trpml1激动剂处理的亲代、fnip1/fnip2双敲除、具有野生型fnip1和fnip1/fnip2双敲除的fnip1/fnip2双敲除、以及lirmut-fnip1细胞中的tfeb激活。
66.图43b显示了说明用dmso、饥饿或trpml1激动剂处理的亲代、fnip1/fnip2双敲除、具有野生型fnip1和fnip1/fnip2双敲除的fnip1/fnip2双敲除、以及lirmut-fnip1细胞中的tfeb激活的蛋白质印迹。
67.图44a显示了说明用dmso、饥饿或trpml1激动剂处理的亲代、fnip1/fnip2双敲除、具有野生型fnip1和fnip1/fnip2双敲除的fnip1/fnip2双敲除、以及lirmut-fnip1细胞中的tfeb激活的图。
68.图44b显示了说明用dmso、饥饿或trpml1激动剂处理的具有野生型fnip1和fnip1/fnip2双敲除的fnip1/fnip2双敲除以及lirmut-fnip1细胞中的tfeb激活的图。
69.图44c显示了说明fnip1-lir结构域参与在用trpml1激动剂处理时的flcn-fnip复合物膜定位的蛋白质印迹。
70.图44d显示了说明与mtor抑制剂azd8055相比，用trpml1激动剂处理时tfeb靶基因gpnmb在蛋白质水平上的升高的蛋白质印迹。gpnmb的上调依赖于fnip1-lir结构域。
71.图45显示了说明用所示化合物(dmso、缬氨霉素(valinomycin)或寡霉素/抗霉素(o/a))处理4小时的hela.cas9或hela.cas9+parkin细胞中的tfeb强度的图。
72.图46显示了说明缬氨霉素对表达parkin的hela对照敲除细胞、lc3三重敲除细胞或gabarap三重敲除细胞的影响的蛋白质印迹，parkin是刺激线粒体自噬时稳健的tfeb激活所需的。
73.图47显示了说明在用线粒体自噬诱导物(缬氨霉素和oa)或对照(dmso)处理24小时后，稳定表达lir突变型fnip1的fnip1/fnip2双敲除细胞中的tfeb激活的蛋白质印迹。
74.图48显示了基于接近性的线粒体自噬诱导模型的说明。p62募集到线粒体导致不依赖于线粒体功能的化学破坏的线粒体自噬。
75.图49显示了说明表达mkeima、frb-p62和fkbp-fis1的u2os细胞中的线粒体自噬效率的定量的图，并且其说明与bafa1的共处理阻断了keima信号。
76.图50显示了在二聚化因子(dimerizer)诱导的线粒体自噬时u2os细胞中tfe3和flcn的亚细胞定位。用25nm ap21967(二聚化因子)刺激所示基因型(对照敲除、rb1cc1敲除和gabarap三重敲除)的细胞3小时。在ctrl和rb1cc1_ko(自噬缺陷)细胞中可见tfe3核定位和flcn点状结构，但在gabarap_tko细胞中未见到。
77.图51显示了说明在用野生型(wt)或δsopf沙门氏菌属激发时的tfeb迁移率变动的蛋白质印迹。用指示菌株感染hela细胞30分钟，并在感染后指示时间点取得裂解物。
78.图52显示了在沙门氏菌属感染时的核tfeb积累的免疫荧光分析。用野生型(wt)或δsopf沙门氏菌属感染细胞，并在感染后2小时(h.p.i.)进行分析。
79.图53显示了说明感染有野生型(wt)或δsopf沙门氏菌属的细胞中量化的tfeb核定位的图。每个条件下量化最少100个细胞。
80.图54显示了感染有δsopf沙门氏菌属并在感染后2小时(h.p.i.)进行分析的对照敲除细胞、lc3三重敲除细胞或gabarap三重敲除细胞中的tfeb表达的免疫荧光分析。
81.图55显示了说明野生型细胞、lc3三重敲除细胞和gabarap三重敲除细胞中量化的tfeb核定位的图。
82.图56显示了说明在用野生型(对照)或δsopf沙门氏菌属感染后10小时(h.p.i.)，所示基因型(野生型、lc3三重敲除和gabarap三重敲除)的细胞中的tfeb转录活性的图。gpnmb和rragd被用作核心tfeb靶基因。
83.图57显示了感染有鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium salmonella)的对照敲除细胞、lc3三重敲除细胞和gabarap三重敲除细胞中的flcn向沙门氏菌属液泡的募集的免疫荧光分析。gabarap蛋白质(rap_tko)而非lc3家族成员(lc3_tko)的缺失阻断了flcn的重新定位。
84.图58显示了flcn-fnip复合物的gabarap依赖性膜封存作为与营养饥饿不同的tfeb激活范例的说明。
85.定义
86.为了更容易理解本发明，下文首先定义了某些术语。在整份说明书中阐述了以下术语和其他术语的额外定义。本文引用的用于描述本发明的背景并提供关于其实践的其他细节的出版物和其他参考材料特此通过引用并入。
87.在本技术中，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一”可理解为是指“至少一”；(ii)术语“或”可理解为是指“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可理解为涵盖逐项列出的组分或步骤，无论所述组分或步骤是独自提出的，还是与一个或多个额外组分或步骤一起提出的；并且(iv)术语“约”和“大约”可理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的；以及(v)如果提供范围，则包括端点。
88.激动剂：如本领域技术人员将理解的，术语“激动剂”通常是指其存在或水平与靶标的如下水平或活性相关的剂，所述水平或活性与不存在所述剂(或具有不同水平的所述剂)的情况下观察到的相比升高。在一些实施方案中，激动剂是指其存在或水平与靶标的如下水平或活性相关的剂，所述水平或活性可比于或大于特定参考水平或活性(例如，在适当参考条件下观察到的，例如存在已知激动剂，例如阳性对照)。在一些实施方案中，激动剂可以是直接激动剂，因为它直接对靶标施加影响(例如，直接与靶标相互作用)；在一些实施方案中，激动剂可以是间接激动剂，因为其间接施加其影响(例如，通过作用于靶标的调控因子，例如与靶标的调控因子相互作用，或与某些其他组分或实体相互作用)。
89.拮抗剂：如本领域技术人员将理解的，术语“拮抗剂”通常是指其存在或水平与靶标的如下水平或活性相关的剂，所述水平或活性与不存在所述剂(或具有不同水平的所述剂)的情况下观察到的相比降低。在一些实施方案中，拮抗剂是其存在或水平与靶标的如下水平或活性相关的药剂，所述水平或活性可比于或小于特定参考水平或活性(例如，在适当参考条件下观察到的，例如存在已知拮抗剂，例如阳性对照)。在一些实施方案中，拮抗剂可
以是直接激动剂，因为它直接对靶标施加影响(例如，直接与靶标相互作用)；在一些实施方案中，拮抗剂可以是间接拮抗剂，因为其间接施加其影响(例如，通过作用于靶标的调控因子，例如与靶标的调控因子相互作用，或与某些其他组分或实体相互作用)。
90.相关：两个事件或实体彼此“相关”，如果一者的存在、水平和/或形式与另一者的存在、水平和/或形式相关，则在本文中使用这个术语。例如，如果特定实体(例如多肽、遗传签名、代谢物、微生物等)的存在、水平和/或形式与疾病、病症或疾患的发生率和/或易感性相关(例如，在相关群体中)，则认为所述特定实体与所述特定疾病、病症或疾患相关。在一些实施方案中，如果两个或更多个实体直接或间接地相互作用，使它们彼此在物理上接近和/或保持在物理上接近，则它们在物理上彼此“相关”。在一些实施方案中，物理上彼此相关的两个或更多个实体彼此共价连接；在一些实施方案中，物理上彼此相关的两个或更多个实体彼此不共价连接，而是非共价相关，例如通过氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁性和其组合。
91.生物样品：如本文所用，术语“生物样品”典型地是指从所关注的生物来源(例如，组织或生物体或细胞培养物)获得或衍生的样品，如本文所述。在一些实施方案中，所关注的来源包括生物体，例如动物或人类。在一些实施方案中，生物样品是或包含生物组织或流体。在一些实施方案中，生物样品可以是或包含骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针穿刺活检样品；含细胞的体液；自由浮动核酸；痰液；唾液；尿；脑脊液、腹膜液；胸膜液；粪便；淋巴；妇科流体；皮肤拭子；阴道拭子；口腔拭子；鼻拭子；洗涤物或灌洗物，例如导管灌洗物或支气管肺泡灌洗物；抽吸物；刮片；骨髓标本；组织活检标本；外科标本；粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物；和/或来自其中的细胞等。在一些实施方案中，生物样品是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，获得的细胞是或包括来自获得样品的个体的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当的方式直接从所关注的来源获得的“初级样品”。例如，在一些实施方案中，初级生物样品是通过选自由生检(例如，细针穿刺抽吸或组织生检)、外科手术、体液收集(例如，血液、淋巴、粪便等)组成的组的方法获得。在一些实施方案中，从上下文中可以清楚地看出，术语“样品”是指通过处理初级样品(例如，通过除去初级样品的一种或多种组分和/或通过向初级样品中添加一种或多种剂)获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这种“经处理的样品”可包含例如从样品中提取的核酸或蛋白质，或通过使初级样品经受例如mrna的扩增或反转录、某些组分的分离和/或纯化等技术获得的核酸或蛋白质。
92.组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂或用药程式)的那些情况。在一些实施方案中，可同时施用所述两种或更多种方案；在一些实施方案中，可依次施用此类方案(例如，在施用第二方案的任何剂量之前施用第一方案的所有“剂量”)；在一些实施方案中，以重叠给药方案施用此类药剂。在一些实施方案中，组合疗法的“施用”可涉及向受试者施用一种或多种药剂或用药程式，所述受试者正接受组合中的另外一种或多种药剂或用药程式。为清楚起见，组合疗法不需要在单一组合物中一起施用个别药剂(或甚至必须同时施用)，尽管在一些实施方案中，两种或更多种药剂或其活性部分可在组合组合物中或甚至在组合化合物(例如，作为单一化学复合物或共价实体的一部分)中一起施用。
93.组合物：本领域技术人员将理解，术语“组合物”可用于指包含一种或多种指定组分的离散物理实体。一般而言，除非另有说明，否则组合物可以是任何形式的——例如，气
体、凝胶、液体、固体等。
94.给药方案或治疗方案：本领域技术人员将理解，术语“给药方案”和“治疗方案”可用于指个别地向受试者施用的一组单位剂量(典型地多于一个)，典型地以时间段隔开。在一些实施方案中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，其可涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，给药方案包含多个剂量，每个剂量在时间上与其他剂量分开。在一些实施方案中，各个剂量以相同长度的时间段彼此隔开；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量和隔开各个剂量的至少两个不同的时间段。在一些实施方案中，给药方案内的所有剂量具有相同的单位剂量量。在一些实施方案中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量量的第一剂量，接着是与第一剂量量不同的第二剂量量的一个或多个额外剂量。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量量的第一剂量，接着是与第一剂量量相同的第二剂量量的一个或多个额外剂量。在一些实施方案中，当在相关群体中施用时，给药方案与期望或有益的结果相关(即，是治疗性给药方案)。
95.患者或受试者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指施用或可能施用所提供组合物的任何生物体，例如，用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的。典型的患者或受试者包括动物(例如，哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人类)。在一些实施方案中，患者是人类。在一些实施方案中，患者或受试者患有或易患一种或多种病症或疾患。在一些实施方案中，患者或受试者显示出病症或疾患的一个或多个症状。在一些实施方案中，患者或受试者已被诊断出一种或多种病症或疾患。在一些实施方案中，患者或受试者正接受或已接受某种疗法以诊断和/或治疗疾病、病症或疾患。
96.参考：如本文所用，描述了标准或对照，相对于所述标准或对照进行比较。例如，在一些实施方案中，将所关注的剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，对参考或对照进行的测试和/或测定基本上与所关注的测试或测定同时进行。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地以有形介质体现。典型地，如本领域技术人员所理解的，参考或对照是在与被评估者可比的条件或情况下测定或表征的。本领域技术人员将理解何时存在足够的相似性来证明依赖于和/或相比于特定可能参考或对照是合理的。
97.样品：如本文所用，术语“样品”典型地是指从所关注的来源获得或衍生的物质的等分试样。在一些实施方案中，所关注的来源是生物或环境来源。在一些实施方案中，所关注的来源可以是或包含细胞或生物体，例如微生物、植物或动物(例如，人类)。在一些实施方案中，所关注的来源是或包含生物组织或流体。在一些实施方案中，生物组织或流体可以是或包含羊水、房水、腹水、胆汁、骨髓、血液、母乳、脑脊液、耳垢、乳糜、食糜、射精、内淋巴、渗出液、粪便、胃酸、胃液、淋巴、粘液、心包液、外淋巴、腹膜液、胸膜液、脓液、发炎性分泌物(rheum)、唾液、皮脂、精液、血清、阴垢、痰液、滑液、汗液、眼泪、尿、阴道分泌物、玻璃体液、呕吐物和/或其组合或一种或多种组分。在一些实施方案中，生物流体可以是或包含细胞内液、细胞外液、血管内液(血浆)、间质液、淋巴液和/或跨细胞液。在一些实施方案中，生物流体可以是或包含植物渗出液。在一些实施方案中，生物组织或样品可通过例如抽吸、生检(例如，细针穿刺或组织生检)、拭子(例如，口腔、鼻、皮肤或阴道拭子)、刮擦、外科手术、洗涤或灌洗(例如，支气管肺泡、导管、鼻、眼、口腔、子宫、阴道或其他洗涤或灌洗)获得。在一些实施方案中，生物样品是或包含从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何
适当的方式直接从所关注的来源获得的“初级样品”。在一些实施方案中，从上下文中可以清楚地看出，术语“样品”是指通过处理初级样品(例如，通过去除初级样品的一个或多个组分和/或通过向初级样品中添加一种或多种剂)获得的制剂。例如，使用半透膜过滤。这种“经处理的样品”可包含例如从样品中提取的核酸或蛋白质，或通过使初级样品经受一种或多种例如核酸的扩增或反转录、某些组分的分离和/或纯化等的技术获得的核酸或蛋白质。
98.治疗：如本文所用，术语“治疗(treat/treatment/treating)”是指用于部分或完全缓解、改善、减轻、抑制、预防疾病、病症和/或疾患的一个或多个症状或特征、延迟其发作、降低其严重程度、和/或降低其发生率的任何方法。可对未表现出疾病、病症和/或疾患体征的受试者施用治疗。在一些实施方案中，例如，为了降低发展与疾病、病症和/或疾患相关病理的风险的目的，可对仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期体征的受试者施用治疗。
具体实施方式
99.本公开提供了溶酶体离子通道trpml1的小分子激动剂促进atg8蛋白质直接快速和稳健接合到溶酶体表面的机制的见解。具体而言，gabarap蛋白质的接合导致flcn-fnip复合物远离其底物ragc/ragd的膜封存。这导致ragc/ragd保持在“gtp结合”状态，并损害与tfeb/tfe3/mitf转录因子的结合。由于处于“gdp结合”状态的ragc/ragd促进细胞质保留，因此增加的“gtp结合”ragc/ragd促进tfeb/tfe3/mitf核定位。
100.自噬、溶酶体和tfeb
101.自噬是一种进化上保守的细胞过程，其允许被称为“货物(cargo)”的细胞质组分的分解和再循环。这种货物的范围可以从单一蛋白质到蛋白质聚集体；从细胞器到入侵的病原体。这种过程涉及将货物封装在双膜自噬体中，并最终与溶酶体融合(1)。溶酶体是单膜细胞器，其含有将货物分解为单个氨基酸的酸性水解酶和肽酶。除了关键的降解功能外，溶酶体也是细胞内的主要信号传导平台。关于营养物(包括但不限于氨基酸、脂质和糖)的丰度的信息，可通过各种溶酶体驻留蛋白质和信号传导复合物来传达(33)。
102.溶酶体的形成以及众多溶酶体酶、膜蛋白和自噬组分的转录调控受主要转录因子tfe3和tfeb的控制。在营养物胁迫或自噬通量增加的条件下，这些转录因子定位于核并统筹驱动溶酶体生物发生的转录程序(15)。
103.tfe3和tfeb核定位的主要调控因子是mtorc1复合物。这种信号传导复合物驻留于溶酶体表面上并感测细胞营养物状态。mtor是mtorc1的一种组分，响应于营养物而磷酸化tfe3和tfeb，以促进细胞质保留。当营养物较低时，mtorc1失活，并且tfe3和tfeb核定位的阻遏减轻(34)。
104.不依赖于mtorc1磷酸化，tfe3和tfeb转录因子可通过溶酶体离子含量的变化被激活。瞬时受体电位ml1(trpml1)离子通道的小分子激动剂已经证明了这一点。激动剂结合触发阳离子从溶酶体内腔非选择性释放到胞质液。先前的工作表明，tfe3和tfeb的trpml1激动剂激活需要溶酶体钙的释放(14)。
105.或许tfe3和tfeb核定位的最主要调控因子是小gtp酶ragc/ragd的核苷酸状态(24)。当这些小gtp酶处于“gtp结合”状态时，它们不能与tfe3和tfeb结合并导致核积累。raggtp酶是细胞内氨基酸水平的充分证明的传感器，并且氨基酸的缺乏(饥饿)促进ragc/ragd的“gtp结合状态”。在用氨基酸刺激时，由肿瘤抑制因子flcn和其结合配偶体fnip1或
fnpi2组成的复合物充当gap(gtp酶激活蛋白)并触发ragc/ragd gtp水解以导致“gdp结合状态”。这种“gdp结合状态”允许ragc/ragd与tfe3和tfeb直接相互作用，并促进这些转录因子的胞质保留。为了支持这种调控，组成性“gtp结合”形式的ragc的表达可导致tfe3和tfeb在营养物存在下的组成性核定位，同时允许mtorc1适当接近参与合成代谢生长过程的其他底物。反过来，“gdp结合”ragc的表达可抑制饥饿条件下tfe3和tfeb的核积累(35)。
106.本公开突出了调控tfeb和tfe3转录活性的新机制。利用溶酶体离子通道trpml1的小分子激动剂，已经发现了单膜atg8接合(smac)的新途径。溶酶体离子平衡的变化触发液泡atp酶(vatp酶)的代偿反应，由此atg5-atg12-atg16l1复合物被直接募集到溶酶体膜上，并将lc3和gabarap亚家族的atg8同源物与溶酶体的胞质表面接合。具体而言，gabarap蛋白质与溶酶体膜的接合导致gabarap结合的flcn-fnip复合物的封存。当稳健定位于溶酶体膜以及在一些实施方案中的其他膜时，flcn-fnip复合物被限制不能作用于其底物ragc/ragd。flcn-fnip对ragc/ragd的调控通常发生在胞质液中，而不是之前提出的溶酶体膜。在没有flcn-fnip提供的gap活性的情况下，ragc/ragd保持在gtp结合状态，并促进tfeb和tfe3核积累。这个过程不依赖于mtorc1活性的调控，也不依赖于先前提出的钙调磷酸酶(can)介导的tfeb和tfe3去磷酸化的机制。在一些实施方案中，flcn-fnip复合物的gabarap依赖性封存可在trpml1激动剂以外的刺激物的情况下发生。在一些实施方案中，gabarap与细胞内膜(包括但不限于自噬体、线粒体、含病原体的液泡、内质网、质膜、内体和多泡体)的接合可经由flcn-fnip复合物的gabarap依赖性封存激活tfeb/tfe3。
107.活性剂
108.在一些实施方案中，本公开提供了增加自噬和/或激动trpml1和/或刺激、稳定、定位和/或以其他方式增加膜表面(例如，溶酶体表面、胞质表面或与lamp1相关的表面)的gabarap/flcn/fnip复合物的水平的剂，和/或制备、表征和/或使用所述剂的方法。在一些实施方案中，本公开的剂是或包含选自由多肽、核酸、脂质、碳水化合物、小分子、金属和其组合组成的组的调节剂。
109.在一些实施方案中，本公开的剂是或包含表现出亲溶酶体和离子载体/质子载体样特性的剂。在一些实施方案中，剂是线粒体atp合酶的抑制剂。在一些实施方案中，剂是细胞色素c还原酶的抑制剂。在一些实施方案中，剂选自由莫能菌素(monensin)、尼日利亚菌素(nigericin)、沙利霉素(salinomycin)、缬氨霉素、寡霉素、抗霉素、氯喹和cccp组成的组。
110.在一些实施方案中，本公开提供了如下的剂，所述剂是或包含属于选自由多肽、核酸、脂质、碳水化合物、小分子、金属和其组合组成的组的化学类别的trpml1调节剂。在一些实施方案中，trpml1调节剂是小分子化合物。在一些实施方案中，trpml1调节剂包含ml-sa1、ml-sa3、ml-sa5、mk6-83、c8(参见wo 2018/005713)、或c2(参见wo 2018/005713)。在一些实施方案中，trpml1调节剂可在如本文所述的一种或多种测定中显示出活性。在一些实施方案中，通过在tfeb测定中显示活性，确定小分子化合物为trpml1调节剂，其中在用小分子化合物处理野生型和trpml1敲除hela细胞后测量tfeb易位。在一些实施方案中，通过在用小分子化合物处理的野生型和trpml1敲除hela细胞上进行的包含荧光成像读板器(flipr)技术的测定中显示内源性溶酶体钙通量活性，确定小分子化合物为trpml1调节剂。在一些实施方案中，通过在细胞表面上表达四环素诱导型trpml1并已用小分子化合物处理
的细胞系上进行的包含荧光成像读板器(flipr)技术的测定中显示外源性钙通量活性，确定小分子化合物为trpml1调节剂。
111.在一些实施方案中，trpml1调节剂是trpml1激动剂。在一些实施方案中，trpml1激动剂的特征在于，当评估对clear网络基因的表达的影响时，其显示出比在饥饿条件下观察到的更受限的影响。在一些实施方案中，trpml1激动剂的特征在于，在可比条件下，在其存在时的trpml1水平或活性高于其不存在时的水平或活性。在一些实施方案中，trpml1激动剂是直接激动剂，因为其与trpml1相互作用。在一些实施方案中，trpml1激动剂是间接激动剂，因为其不直接与trpml1相互作用。
112.组合物
113.在一些实施方案中，本公开提供了包含和/或递送如本文所述的活性剂的组合物。
114.用途
115.在一些实施方案中，本公开提供了使用所述剂的技术，例如用以不依赖于mtorc1而激活tfeb；刺激、稳定、定位和/或以其他方式增加一个或多个膜表面(例如，胞质表面，例如与lamp1相关的；例如，溶酶体)的gabarap/flcn/fnip复合物的水平；治疗因溶酶体生物发生增加和/或溶酶体酶活性增加和/或线粒体生物发生增加而受益的疾病。
116.在一些实施方案中，本公开提供了一种不依赖于mtorc1活性而激活tfeb的方法，所述方法包括使系统与trpml1激动剂接触的步骤，所述系统包含含有lamp-1、vatp酶或gabarap的膜；以及gabarap/flcn/fnip复合物的组分，使得膜处的gabarap/flcn/fnip复合物的水平升高。在一些实施方案中，包含lamp-1vatp酶或gabarap的膜限定了隔室。在一些实施方案中，隔室是或包含溶酶体。在一些实施方案中，隔室是或包含晚期内体。在一些实施方案中，隔室是或包含多泡体。在一些实施方案中，膜是或包含溶酶体膜。在一些实施方案中，膜是或包含内体膜。在一些实施方案中，膜是或包含多泡体膜。在一些实施方案中，溶酶体膜是完整溶酶体的一部分。在一些实施方案中，内体膜是完整内体的一部分。在一些实施方案中，多泡体膜是完整多泡体的一部分。在一些实施方案中，溶酶体处于细胞中。在一些实施方案中，内体处于细胞中。在一些实施方案中，多泡体处于细胞中。
117.在一些实施方案中，本公开提供了一种不依赖于mtorc1活性而激活tfeb的方法，所述方法包括施用trpml1激动剂的步骤。在一些实施方案中，施用步骤包括使系统与trpml1激动剂接触，其中所述系统包含溶酶体膜和gabarap/flcn/fnip复合物的组分。在一些实施方案中，系统在编码接合机制蛋白质的基因(接合机制基因)和/或编码gabarap/flcn/fnip复合物的组分的基因中具有多态性或突变。在一些实施方案中，接合机制基因选自由atg3、atg5、atg7、atg12、atg16l1和其组合组成的组。在一些实施方案中，接合途径基因是atg16l1。在一些实施方案中，多态性是t300a。在一些实施方案中，trpml1激动剂属于选自由多肽、核酸、脂质、碳水化合物、小分子、金属和其组合组成的组的化学类别。
118.在一些实施方案中，施用步骤包括在多种条件下将系统暴露于trpml1激动剂并持续足够的时间，使得相对于在所述暴露之前的情况，在所述系统中观察到一种或多种协调溶酶体表达与调控(clear)网络基因的表达或活性增强和/或可检测的胞吐活性、自噬、溶酶体贮积物质清除和溶酶体生物发生中的一者或多者的增强。在一些实施方案中，通过tfeb靶向和/或控制clear网络基因。在一些实施方案中，clear网络基因参与调控溶酶体酶的表达、导入和活性，所述溶酶体酶控制蛋白质、糖胺聚糖、鞘脂和糖原的降解。在一些实施
方案中，clear网络基因参与调控额外的溶酶体相关过程，包括自噬、胞吐、内吞、吞噬和免疫反应。在一些实施方案中，clear网络基因包括编码非溶酶体酶的基因，所述酶参与例如血红蛋白和几丁质的必需蛋白质的降解。
119.在一些实施方案中，trpml1激动剂的特征在于，当评估对clear网络基因的表达的影响时，其显示出比在饥饿条件下观察到的更受限的影响。在一些实施方案中，trpml1激动剂的特征在于，当评估对clear网络基因的表达的影响时，其未显示比在饥饿条件下观察到的更受限的影响。
120.在一些实施方案中，施用步骤包括在多种条件下将系统暴露于trpml1激动剂并持续足够的时间，使得相对于在所述暴露之前的情况，在所述系统中观察到选自表1的一种或多种基因的表达或活性增强。
121.表1
122.123.[0124][0125]
在一些实施方案中，trpml1激动剂的特征在于，在可比条件下，在其存在时的trpml1水平或活性高于其不存在时的水平或活性。在一些实施方案中，trpml1激动剂是直接激动剂，因为其与trpml1相互作用。在一些实施方案中，trpml1激动剂是间接激动剂，因为其不直接与trpml1相互作用。
[0126]
在一些实施方案中，本公开提供了一种通过增强细胞内膜表面的gabarap/fnip/flcn复合物定位来激活tfeb的方法。在一些实施方案中，细胞内膜表面是细胞内隔室的胞质表面。在一些实施方案中，细胞内隔室是溶酶体。在一些实施方案中，细胞内隔室是线粒体。在一些实施方案中，细胞内隔室是内质网。在一些实施方案中，细胞内隔室是病原体液泡。在一些实施方案中，细胞内隔室是内体结构。在一些实施方案中，所述方法包括施用
trpml1激动剂。在一些实施方案中，tfeb激活不依赖于mtorc1活性。
[0127]
在一些实施方案中，本公开提供了用作参考或对照的活性剂以鉴定或表征其他活性剂。在一些实施方案中，本公开提供了表征tfeb激活剂的方法，所述方法包括评估对一种或多种细胞内膜表面的flcn定位和/或gabarap/fnip/flcn复合物的水平的影响。
[0128]
在一些实施方案中，本公开提供了一种包括用于表征tfeb、tfe3和/或mitf的激活剂的细胞测定的方法，其中所述细胞测定包括包含以下的细胞：vatp酶小分子抑制剂的存在；atg8接合机制的遗传破坏；atg8接合机制的小分子抑制剂的存在；蛋白质的gabarap亚家族成员的遗传破坏；fnip1或fnip2中lir结构域的突变；或其组合。在一些实施方案中，vatp酶小分子抑制剂是巴佛洛霉素a1。在一些实施方案中，vatp酶小分子抑制剂不是水杨酰卤酰胺a的类似物。在一些实施方案中，atg8接合机制的遗传破坏包括基因敲除、基因敲入、一种或多种突变等位基因的表达、sirna、shrna、反义，或其组合。在一些实施方案中，蛋白质的gabarap亚家族成员的遗传破坏包括基因敲除、基因敲入、一种或多种突变等位基因的表达、sirna、shrna、反义，或其组合。
[0129]
疾病、病症或疾患
[0130]
在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗trpml1相关的疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括向患有或易患trpml1相关的疾病、病症或疾患的受试者施用trpml1激动剂的步骤。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含炎症性疾患。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含溶酶体贮积症。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含聚谷氨酰胺病症。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含神经退行性蛋白病。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含感染性疾病。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患选自由克罗恩病、庞贝病、帕金森病、亨廷顿病、阿茨海默病、脊髓延髓肌萎缩、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症和多发性硫酸酯酶缺乏症组成的组。在一些实施方案中，trpml1相关的疾病、病症或疾患是克罗恩病。
[0131]
在一些实施方案中，本公开提供了以下，如本文所述的活性剂可特别用于治疗一种或多种接合机制相关的(“cma”)疾病、病症或疾患。在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗接合机制相关的(“cma”)疾病、病症或疾患或者gabarap/fnip/flcn复合物相关的疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括施用trpml1激动剂的步骤。在一些实施方案中，所述疾病、病症或疾患是或包含克罗恩病。
[0132]
在一些实施方案中，cma疾病病症或疾患是已经确定与接合机制基因的突变或等位基因相关。例如，atg16l1中的t300a多态性与克罗恩病的发生率增加相关。这种多态性增加了atg16l1的蛋白水解处理的可能性，以除去从氨基酸300延伸的c末端区域。atg16l1的c末端区域对于atg8家族成员与单膜的接合是重要的，并且已知对宿主-病原体反应是重要的。在肠道中，降低的atg16l1 c末端功能有助于克罗恩病的促炎性质，可能是由于缺乏atg16l1-ctd结构域依赖的tfeb激活。在一些实施方案中，用如本文所述的活性剂(例如trpml1激动剂或其他剂)治疗这种疾患以通过如本文所述的完整全长atg16l1的激动来恢复完全tfeb活性可能是有益的。
[0133]
flcn的种系突变是birt-hogg-dube综合征(35,44)中的flcn-fnip复合物功能丧失表型和tfeb依赖性的起因，所述综合征是一种罕见的病症，易使患者发生肾肿瘤。另外，
ras驱动的胰腺腺癌细胞显示tfeb/tfe3的组成性核定位以及lc3与lamp2阳性溶酶体的明显共定位(45,46)。了解flcn-fnip复合物膜封存的参与，以及致癌信号是否利用这种机制来驱动tfeb依赖性肿瘤生长，可能为溶酶体依赖性肿瘤提供新的治疗机会。溶酶体活性或膜通透性的升高(46)可触发这种途径，并解释tfeb核定位，尽管存在全营养物、mtor活性条件(45)。在具有组成性核tfeb/tfe3/mitf的癌症中，gabarap-fnip相互作用的特异性破坏可抑制某些肿瘤中的tfeb/tfe3/mitf活性并降低肿瘤进展。
[0134]
在一些实施方案中，接合机制相关的(“cma”)疾病、病症或疾患或者gabarap/fnip/flcn复合物相关的疾病、病症或疾患是或包含癌症。在一些实施方案中，癌症的特征在于具有tfeb/tfe3转录因子的核定位。在一些实施方案中，癌症的特征在于存在受损的内体或溶酶体结构。在一些实施方案中，癌症的特征在于存在与细胞内膜(例如，内体、溶酶体、自噬体或线粒体)接合的atg8同源物。
[0135]
范例
[0136]
提供以下实施例是为了向本领域技术人员描述如何制造和使用本文所述的方法和组合物，并不旨在限制本公开的范围。
[0137]
材料和方法
[0138]
抗体
[0139]
在这些研究中使用的atg16l1(8089，人类)、磷酸-atg14 s29(92340)、atg14(96752)、磷酸-贝克林s30(54101)、fip200(12436)、flcn(3697)、gabarapl1(26632)、gabarapl2(14256)、gapdh(5174，对于wb为1:10000)、dykddddk标签(14793)、ha标签(3724)、myc标签(2278)、lc3a/b(12741)、lc3b(3868)、lamtor1(8975)、lamp1(15665，对于if为1:1000)、nfat1(if 5861，对于if为1:250)、nprl2(37344)、磷酸-s6k(9234)、s6k(2708)、磷酸-s6s235/236(4858，对于wb为1:3000)、s6(2217，对于wb为1:5000)、tax1bp1(5105)、tfeb(4240)、tfeb(37785；对于if为1:200)以及磷酸-ulk s757(14202)抗体来自cell signaling technologies。fnip1抗体(ab134969)来自abcam。tfe3抗体(hpa023881)来自millipore sigma。p62抗体(gp62-c)来自progen。半乳凝素-3抗体(sc-23938)来自santa cruz biotechnology。tfeb抗体(a303-673a，在鼠类细胞中对于if为1:200)来自bethyl laboratories。除非另有说明，否则所有抗体以1:1000稀释用于蛋白质印迹。
[0140]
用crispr/cas9产生敲除细胞系
[0141]
通过慢病毒转导使hela或u2os细胞稳定表达cas9(载体目录号svc9-ps-hygro，cellecta)。如所示，在后续用grna序列进行慢病毒转导后，作为合并群体产生敲除细胞系(载体目录号svcru6up-l，cellecta)。用嘌呤霉素(2ug/ml，life technologies)选择合并群体3天，并在用grna转导后7-9天用于实验。针对atg16l1_ko分离克隆以用于重构实验。表2中提供了grna序列(5'至3')。
[0142]
表2
[0143][0144][0145]
cdna表达构建体
[0146]
如前所述，将野生型和k490a突变型小鼠atg16l1克隆到pbabe-puro-flag-s-tag质粒中(fletcher等人,embo j 2018)。先前已经描述了pbabe-blast-gfp-lc3a(florey等人,ncb 2011)。表3中列出的构建体是为了在这些研究中使用而产生的。
[0147]
表3
[0148][0149]
合成了具有指示表位标签的cdna构建体(genscript，usa)，并作为入门克隆提供。使用gateway重组将盒穿梭到pcdna-dest40(life technologies)或慢病毒载体中，允许四
环素诱导型表达，称为tet-lenti(由美国的genscript合成)。
[0150]
细胞培养物
[0151]
下面所述的研究使用了u2os、hela和raw264.7细胞系，所述细胞系获自美国典型培养物保藏中心(atcc)。hek293ft细胞获自thermofisher scientific。通过常规测试证实细胞系无支原体。所有细胞均在37℃和5％ co2的加湿培养箱中培养。除非另有规定，否则细胞培养试剂获自invitrogen。细胞在补充有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)中生长。raw264.7野生型和atg16l1_ko细胞由anne simonsen博士提供(lystad等人,ncb)，并维持在dmem 10％ fbs、1％青霉素/链霉素中。
[0152]
试剂
[0153]
巴佛洛霉素a1、pik-iii和azd8055购自selleckchem。ml-sa1和mk6-83购自tocris。莫能菌素、尼日利亚菌素、沙利霉素、缬氨霉素和llome购自sigma aldrich。c8可通过chemshuttle购买(目录号187417)。
[0154]
病毒产生和转导
[0155]
为了crispr grna或cas9病毒和cdna过表达病毒的慢病毒产生，将8x 105个293ft细胞铺板在6孔板中。第二天，使用lipofectamine 2000(thermofisher)，用慢病毒包装混合物(1μg pspax2和0.25μg vsv-g)连同1.5μg慢病毒骨架转染细胞。48小时后从293ft细胞中除去上清液，以2000rpm离心5分钟，然后使用0.45μm过滤器(millipore)进行注射器过滤。然后添加聚凝胺至8μg/ml的最终浓度，并感染靶细胞过夜。然后使细胞在dmem/10％ fbs中恢复24小时，之后用1mg/ml新霉素(g418:geneticin，thermofisher)、2μg/ml嘌呤霉素(thermofisher)或500μg/ml潮霉素b(thermofisher)选择72小时。
[0156]
如前所述(gammoh等人,nsmb 2013)，使用离心进行逆转录病毒感染。用嘌呤霉素(2mg/ml)或杀稻瘟菌素(10mg/ml)选择稳定的群体，持续3-5天。
[0157]
细胞裂解和蛋白质印迹
[0158]
为了制备总细胞裂解物，将细胞在ripa缓冲液(#9806，cell signaling technology)中裂解，所述缓冲液补充有十二烷基硫酸钠至1％最终浓度(sds，boston bioproducts)和蛋白酶抑制剂片剂(完全无edta，roche)。通过依次通过qiashredder柱(qiagen)均质化裂解物，并通过lowry dc蛋白质测定(bio-rad)量化蛋白质水平。将蛋白质在100℃下在6x laemmli sds上样缓冲液(boston bioproducts)中变性5分钟。
[0159]
前一天将1.5x106个细胞铺板在6cm组织培养皿(bd falcon)中，以制备膜级分。根据制造商的方案，使用mem-per试剂盒(thermofisher)制备细胞级分。通过lowry dc蛋白质测定(bio-rad)量化蛋白质水平，并在6x laemmli sds上样缓冲液(boston bioproducts)中变性。
[0160]
在tris-甘氨酸tgx sds-page凝胶(bio-rad)上分离等量的总蛋白进行蛋白质印迹。使用标准方法将蛋白质转移到硝化纤维素中，并用0.2％ tween-20(boston bioproducts)在tbs中的5％脱脂奶粉(cell signaling technology)封闭膜。将一级抗体在含有0.2％ tween-20的tbs中的5％牛血清白蛋白(bsa，cell signaling technology)稀释，并在4℃下与膜一起温育过夜。将hrp接合二级抗体在封闭溶液(1:20000，thermofisher)中稀释，并在室温下与膜一起温育1小时。使用west picoplus super signal ecl试剂(pierce)和薄膜(gehealthcare)对蛋白质印迹进行显影。
[0161]
免疫沉淀
[0162]
将细胞在以下ip chaps裂解缓冲液中裂解：0.3％ chaps，10mmβ-磷酸甘油，10mm焦磷酸酯，40mm hepes ph 7.4，2.5mm mgcl2，补充有蛋白酶抑制剂片剂(roche)和花萼海绵诱癌素a(calyculin a)(cell signaling technology)。通过离心澄清裂解物，并如上所述进行平衡。对于flag ip，将裂解物与抗m2 flag接合琼脂糖珠粒(sigma-aldrich)一起以每1mg蛋白质10μl床体积温育，并在4℃下温和摇动下温育1小时。对于myc ip，将裂解物与抗myc 9e10接合琼脂糖珠粒(sigma-aldrich)一起以每1mg蛋白质10μl床体积温育。然后离心珠粒并用裂解缓冲液洗涤3次。通过在100℃下添加6x laemmli sds上样缓冲液洗脱免疫沉淀物5分钟。
[0163]
免疫荧光和高内涵图像分析
[0164]
在指示的处理后，将gfp-lc3 lamp1-rfp表达细胞在-20℃下用冰冷甲醇固定3分钟。在pbs中洗涤细胞，并使用配备40倍油浸1.40数值孔径(na)物镜的共聚焦zeiss lsm 780显微镜(carl zeiss ltd)使用zen软件(carl zeiss ltd)进行图像采集。
[0165]
为了量化，在多个视野中对》20个细胞的gfp-lc3斑点的数量进行计数。对于共定位定量，针对lamp1-rfp评估gfp-lc3斑点。
[0166]
对于原代bmdm中的lc3和lamp1染色，将细胞铺板在18mm盖玻片上。第二天，如所示处理细胞，并如上所述将细胞固定在冰冷甲醇中。然后在添加一级抗体(抗lc3a/b，cst#4108，1:100；抗lamp1，bd#555798，1:100)之前，将细胞在pbs+5％ bsa中封闭1小时，并在4℃下在封闭缓冲液中稀释过夜。然后洗涤细胞，并在室温下与荧光二级抗体一起在封闭缓冲液中温育1小时。将细胞在pbs中洗涤，用dapi温育，并使用延长防褪色试剂(life technologies)安装在载玻片上。
[0167]
对于小鼠巨噬细胞的内源性tfeb染色，将细胞在室温下在3.7％甲醛中固定15分钟，在pbs中洗涤，并在0.2％triton/pbs中透化5分钟。然后如上对细胞进行一级抗体(抗tfeb，bethyl laboratories，#a303-673a，1:200)和二级抗体处理。使用配备40倍油浸1.40数值孔径(na)物镜的共聚焦zeiss lsm 780显微镜(carl zeiss ltd)使用zen软件(carl zeiss ltd)采集图像。使用image j进行分析。对于核/胞质液定量，在2个独立实验中测量了30个细胞的dapi掩膜内tfeb的荧光强度与胞质液的荧光强度的比率。
[0168]
对于高内涵图像采集，将细胞铺板在96孔玻璃底、黑色壁板(greiner，#655892)或384孔聚苯乙烯、黑色壁板(greiner，#781091)中，并过夜生长到70％汇合。如所示进行处理。将细胞在-20℃甲醇或4％多聚甲醛(electron microscopy sciences)中固定10分钟。将细胞在含有1:1odyssey封闭缓冲液(licor)/pbs(invitrogen)与0.1％ triton x-100(sigma)和1％正常山羊血清(invitrogen)的溶液中在室温下封闭并透化1小时。在上述封闭缓冲液中在4℃下添加一级抗体过夜。使用el-406洗板机(biotek)用pbs洗涤板后，将二级alexa接合抗体(life technologies)在封闭溶液中1:1000稀释，并在室温下应用1小时。然后如所述在pbs中再次洗涤细胞，并使用incell 6500高内涵成像仪(ge healthcare)成像。使用ge incarta软件对图像进行分析。
[0169]
相关fib-sem
[0170]
将细胞接种在35mm玻璃底培养皿(mattek corp.,usa，#p35g-2-14-cgrd)中。将它们用0.1m磷酸盐缓冲液ph 7.4(pb)中的4％甲醛(taab f017，16％w/v无甲醇甲醛溶液)在4
℃下固定30分钟。将它们在pb中洗涤，并在倒置共聚焦显微镜(zeiss lsm780)上用40x/1.4na物镜成像。在进一步加工之前，用2％甲醛和2.5％戊二醛(taab g011/2，25％戊二醛溶液)在pb中进一步固定2小时。
[0171]
使用如前所述的方案包埋样品(38,39)。将细胞在pb中洗涤五次，并在冰上在1％四氧化锇(agar scientific，r1023，4％四氧化锇溶液)和1.5％亚铁氰化钾(v/v)(sigma-aldrich，p3289-100g，三水合六氰高铁酸钾(ii))中后固定1小时。然后将样品脱水并包埋在hard-plus resin812(ems，#14115)中。将样品在60℃下聚合72小时。通过将块浸入液氮中，将盖玻片从树脂中取出。在使用网格压印定位块表面上的所关注区域(roi)后，使用钢锯切割块以适配铝短柱，并用刀片修剪。然后，使用safematic ccu-010溅射镀膜机(labtech)用20nm pt对块/短柱镀膜，以创建导电表面。
[0172]
将块/短柱放置在zeiss 550crossbeam fib sem的腔室中，并使用10kv的电子束对表面成像，以定位网格和底层细胞。一旦确定了roi，则使用atlas软件(fibics)来运行系统。向树脂中切割沟槽以暴露出靶细胞，并使用1.5kv电子束以7nm各向同性分辨率采集系列sem图像。对于3d图像分析，使用atlas软件处理图像栈，并使用imagej查看。
[0173]
rna分离与rnaseq分析
[0174]
rna分离
[0175]
使用trizol提取和rnaeasy微型试剂盒(qiagen)由用dmso或2μm c8处理24小时的细胞制备总rna。总共提交2μg rin得分》9.8的rna进行rnaseq分析。
[0176]
文库制备、hiseq测序和分析
[0177]
rna测序文库是使用制造商的说明(neb,ma)，使用用于illumina的nebnext ultra rna文库制备试剂盒制备的。用oligod(t)珠粒富集mrna，并且将富集的mrna在94℃下片段化15分钟。这之后接着是第一链和第二链cdna合成，将cdna片段在3'端进行末端修复和腺苷酸化。然后将通用衔接子连接到cdna片段，接着通过有限周期的pcr进行索引添加和文库富集。使用qubit 2.0荧光计(life technologies,ca)对rnaseq的测序文库和rna样品进行量化，并使用agilent tapestation 4200(agilent technologies,ca)检查rna完整性。
[0178]
根据制造商的说明，将测序文库聚集在illumina hiseq 4000系统上的流动池的单通道上。使用2x150bp配对末端(pe)配置对样品进行测序。通过hiseq控制软件(hcs)进行图像分析和碱基识别(base calling)。将从illumina hiseq产生的原始序列数据(.bcl文件)转换为fastq文件，并使用illumina的bcl2fastq 2.17软件进行解复用。索引序列鉴定允许一个错配。使用star对齐器v.2.5.2b将序列读段映射到ensembl上可用的智人参考基因组版本grch38。使用子读取包v.1.5.2中的特征计数计算独特基因命中计数。只对外显子区域内的独特读段进行计数。
[0179]
通过m值归一化(tmm)方法的修剪均值将计数数据归一化，接着进行方差估计并应用广义线性模型(glm)，利用数字基因表达的经验分析中的函数(40)来鉴定如前所述(41,42)的差异表达基因。通过将这些线性模型与每个因子组合的系数进行拟合，然后同时提取两个实验维度(c8刺激和基因型状态：atg16l1ko和wt)中相应
‘
微分的微分(differential-of-differential)'分析的对比，将因子设计并入分析。使用benjamini和hochberg(bh)方法调整相关的p值，以控制多重测试中的错误发现率(bh调整p《0.05)。
[0180]
如前所述(42,43)进行途径和生物过程富集分析。简言之，数据探询自kegg途径和
基因本体生物过程。在差异表达基因中，相对于其在基因组的全局基因集合中的表现，评估每个模块或类别的统计学富集或过表现。使用超几何测试计算p值。
[0181]
lysotracker染色
[0182]
将表达对照grna或敲除atg16l1的u2os.cas9细胞用2μm c8处理24小时。然后洗涤细胞并用在温热成像缓冲液(20mm hepes(ph 7.4)、140mm nacl、2.5mm kcl、1.8mm cacl2、1mm mgcl2、10mm d-葡萄糖和5％v/v fbs)中稀释的25nm lysotracker red dnd-99(thermofisher)和hoecsht 33342(thermofisher)进行20分钟活细胞温育。在incell 6500上采集图像之前，除去染色溶液，并将细胞在成像缓冲液中再温育30分钟。使用ge incarta软件对图像进行分析。
[0183]
atg16l1 k490a敲入小鼠模型的产生
[0184]
经由直接受精卵注射crispr/cas9试剂将k490a点突变引入c57/bl6小鼠中。简言之，利用来自dhamacon的tracrrna设计并合成单链指导序列。设计了修复供体单链dna序列，以引入k490a点突变并使pam序列突变，从而阻止cas9复合物重新靶向已编辑的dna。这些试剂与重组cas9一起被注射到小鼠受精卵中。经由transnetyx对因这些注射出生的幼崽进行基因分型，并将杂合首建鼠(heterozogous founder)用野生型小鼠繁殖，以获得纯杂合子动物。进一步的繁殖产生了k490a突变的纯合小鼠。在特定的无病原体条件下，小鼠被安置在babraham institute的biological support unit中。
[0185]
k490a指导序列：
[0186]
guuaggggccaucacggcucguuuuagagcuaugcuguuuug(seq id no:19)
[0187]
修复供体ssdna：
[0188]
gctgtctcccttaggtcagagagagtgtggtccgagagatggaactgttaggggcgatcaccgctttggacctaaaccctgagagaactgagctcctgagctgctcccgtgatgacctg(seq idno:20)
[0189]
骨髓源性巨噬细胞分离
[0190]
使用13-15周龄的c57/bl6野生型和atg16l1 k490a小鼠来获得骨髓源性细胞(bmdc)。通过用pbs+2％ fbs冲洗胫骨和股骨来分离骨髓细胞。将细胞沉淀，并在室温下重悬于1ml红细胞裂解缓冲液(150mm nh4cl、10mm khco3、0.1mm edta)中2分钟。将细胞沉淀，并重悬于以下中：rpmi 1640(invitrogen 22409-031)，10％fbs，1％青霉素/链霉素，50μm 2-巯基乙醇，补充有20ng/ml m-csf(peprotech#af-315-02)和50ng/ml二性霉素(两性霉素b)(gibco#15290018)。在第3天和第6天更新培养基，并在第8天对细胞进行铺板用于测定。
[0191]
hek293 gfp-lc3b atg13/atg16l1_dko细胞
[0192]
如前所述，使用维持在dmem、10％ fbs、1％青霉素/链霉素中的稳定表达gfp-lc3b的atg13_ko hek293细胞(jacquin等人,autophagy 2017)。为了产生atg16l1 ko，对具有悬垂物的含有bpii位点的grna序列(gtggatactcatcctggttc(seq id no:21))进行退火并克隆到用bpii限制酶(thermo scientific，er1011)消化的pspcas9(bb)-2a-gfp质粒(addgene，48138；feng zhang博士保藏)中。经由lipofectamine 2000(invitrogen)将重组质粒与表达小鼠atg16l1变体的pbabe-puro构建体(addgene，1764；hartmut land博士保藏)一起转染到hek293 atg13_ko gfp-lc3b细胞中。用2.5μg/ml嘌呤霉素(p8833，sigma)选择细胞48小时，并通过限制性稀释获得单细胞克隆。克隆扩增后，根据如通过蛋白质印迹法检测的atg16l1蛋白质的不存在，选择atg16l1 ko克隆。
7.8)进行缓冲液交换。为了形成gabarap-mbp:flcn/fnip2蛋白质复合物，将7.5μm gabarap-mbp和1.25μm flcn/fnip2混合，以维持gabarap-mbp与flcn/fnip2的摩尔比为6:1。将游离flcn/fnip2的蛋白质浓度调整为1.25μm。将所有样品用gee标记0、2.5、5和6.5分钟，随后用10％ tca/丙酮沉淀以清除蛋白质。然后将样品还原，并且分别用10mm碘乙酰胺(iam)和25mm dtt进行烷基化，并在37℃下用胰蛋白酶消化过夜，接着在37℃下用asp-n消化8小时。将胰蛋白酶和asp-n均以1:10(w:w)的酶:蛋白质比率添加到蛋白质样品中。接下来，通过液相色谱(nano-acquity)与高分辨率质谱(eclipse)联用来分析消化的样品。将ms数据通过mass matrix软件和手动分析，得出每个肽的剂量-反应图。将游离flcn/fnip2的结果与gabarap-mbp-flcn/fnip2复合物形式进行比较。这些研究的标准方法是评估在肽水平上复合物形成时标记(保护)的总体减少，并且对于具有显著保护作用的肽，为其单独的保护全面检查这些肽中每个残基的修饰。
[0206]
离子稳态和酸性ph是溶酶体降解能力的紧密关联的决定因素，并且这些特性的改变可导致疾病。虽然已知溶酶体膜通道调控离子通量，但溶酶体如何局部感测此类变化以及细胞如何反应尚不清楚。本实施例证明溶酶体离子平衡的特定药理学改变导致atg5-atg12-atg16l1自噬接合机制的向溶酶体表面的vatp酶依赖性募集。atg16l1的c末端wd40结构域的非atp酶依赖性募集使atg8同源物以非自噬依赖性方式直接接合到溶酶体膜。重要的是，接合的gabarap而非lc3蛋白质将flcn/fnip肿瘤抑制复合物封存到溶酶体。flcn/fnip封存消除了ragc/d核苷酸状态的调控，导致转录因子eb(tfeb)以非mtor依赖性方式进行核积累。这种新的atg16l1-gabarap-flcn-tfeb轴响应于溶酶体网络内离子平衡的破坏促进了溶酶体生物发生。
[0207]
实施例1
[0208]
本实施例证明溶酶体离子通道trpml1的激活导致atg8与溶酶体膜接合，不依赖于自噬。atg8同源物(属于lc3和gabarap亚家族)广泛用作自噬体的标志物，自噬体是双膜结合结构，介导胞质内容物向溶酶体的递送以进行降解和再循环(1)。然而，atg8蛋白质也可以与内吞系统内的单膜细胞器接合，但这种修饰的功能性后果尚不清楚(2-6)。单膜atg8接合(smac)可通过表现出亲溶酶体和离子载体/质子载体样特性但缺乏分子靶标的药理剂诱导(7,8)。为了探询内溶酶体离子梯度的改变是否用作atg8接合的触发物，使用溶酶体瞬时受体电位粘脂蛋白通道1(trpml1)的药理学激动剂急性改变内腔离子浓度。在所述过程中，发现了负责维持细胞器内稳态的新机制。
[0209]
用trpml1激动剂mk6-83(9)、ml-sa1(10)或最近出版的更有效的通道激动剂(命名为化合物8“c8”)(11)处理导致lc3在野生型(wt)和自噬缺陷细胞中均从其细胞质“i”形式快速转化为脂化的点状“ii”形式。相比之下，mtor抑制剂azd8055，一种良好建立的诱导自噬体生物发生的剂，能够调控wt中的lc3脂质化，但不能调控自噬缺陷细胞(12)(图1、图2和图3)。azd8055或ebss饥饿以对vps34抑制敏感的方式诱导lc3的转化，并通过vatp酶抑制剂巴佛洛霉素a1(bafa1)增强(图4)。有趣的是，用c8处理稳健诱导非vps34依赖性lc3脂质化，bafa抑制所述脂质化，对mtor活性无影响(图4)。这种快速脂质化依赖于trpml1(图5)，并且不伴有溶酶体碱化或膜损伤(图6)。总之，这些特征是smac的特征，其中atg8与内溶酶体膜接合(7)。与此一致，trpml1激动剂处理也诱导atg8(lc3b或gabarapl1)与溶酶体标志物lamp1的强烈共定位(图7和图8)。最近的发现指示，atg8与非自噬体膜的接合需要不同的残
基，例如atg16l1的c末端wd重复中的k490，而自噬体形成不需要这些(13)。自噬缺陷(atg13 ko)细胞被工程化以分离这个atg16l1结构域的功能，并且发现在atg16l1 ko细胞中引入atg16l1突变型k490a时，trpml1激动剂(例如，c8)诱导的lc3斑点形成被消除(图9)。进一步的超微结构相关光学电子显微镜检查(clem)揭示了具有溶酶体特征的gfp-lc3结构(图10)。最近据报道，atg16l1向含沙门氏菌属的液泡膜的募集需要vatp酶v0c亚基和atg16l1之间的相互作用(8)，并且这种募集被细菌效应蛋白质sopf阻断。图11显示了沙门氏菌属sopf对vatp酶募集atg16l1的损害的图表。在用trpml1激动剂(c8)处理时，诱导sopf足以阻断lc3-ii形成，但在用经典自噬诱导物(和mtor抑制剂)azd8055处理时，则不足以阻断它形成(图11)。接下来，如图12所示，产生atg16l1 k490a突变的敲入小鼠模型，以特异性破坏单膜atg8接合。小鼠是存活的，并且没有表现出任何明显的表型，这与缺乏atg16l1的整个c末端结构域的小鼠的表征一致(16)。从这些动物中分离出原代骨髓源性巨噬细胞，并且如图12所示，经trpml1激动剂c8和ml-sa1中的任一者处理后，野生型细胞中与lamp1共定位的lc3斑点形成在atg16l1
k490a
细胞中未发生。在用mtor抑制剂azd8055处理的细胞中未观察到对atg16l1
k490a
突变的这种敏感性。综上所述，这些数据表明trpml1激活诱导atg8同源物(例如，lc3)的脂质化和向溶酶体的共定位，这一过程不同于自噬体生物发生，但依赖于vatp酶。这代表了具有所定义的分子靶标的小分子的第一个实例，其可用作内溶酶体atg8接合的诱导物。
[0210]
实施例2
[0211]
本实施例证明，atg16l1依赖性atg8与单膜的接合对于溶酶体离子通量变化时的tfeb激活和溶酶体生物发生是重要的。已知通过离子通道trpml1释放溶酶体钙导致转录因子tfeb和tfe3的核易位，这可能归因于磷酸酶钙调磷酸酶(can)的局部激活使tfeb/tfe3去磷酸化(14)。使用can的药理学抑制剂和经由crispr缺失必需的调控亚基ppp3r1，未观察到can在trpml1激动剂激活tfeb中的作用，尽管在离子霉素处理时强烈抑制经典can靶标nfat1的易位(图13和图14)。为了确定trpml1激动剂诱导的atg8接合是否参与tfeb的激活，确定了阻断atg16l1向vatp酶募集的细菌效应子sopf的表达是否能够阻断响应于trpml1激活的tfeb核积累。相对于sopf阴性对照，用trpml1激动剂处理的细胞中sopf的表达抑制了tfeb核积累，而用azd8055处理时，sopf表达不影响tfeb激活(图15)。另外，与抑制vatp酶活性和溶酶体atg8接合的bafa1共处理防止trpml1激动剂(mk6-83和c8)激活tfeb，而与bafa1和mtor抑制剂azd8055共处理细胞不会防止tfeb激活(图16)。这些结果与vatp酶在内腔离子通量变化后atg8蛋白质与溶酶体膜接合中的作用一致。
[0212]
由于bafa1处理也会导致溶酶体ca
2+
贮积的耗尽，atg8脂质化事件通过crispr介导的atg16l1、atg5或atg7(自噬atg8(例如，lc3)接合机制的组分)的缺失而被消除。引人注目的是，发现在缺乏atg8接合的细胞(atg5 ko、atg7 ko和atg16l1 ko)而非在通过fip200、atg9a或vps34的敲除而缺乏自噬的细胞中，tfeb的激活被完全阻断(图17)。重要的是，通过trpml1激动剂(c8)激活tfeb对atg16l1的敲除或与bafa1共处理敏感，而营养饥饿时的tfeb激活(ebss)对bafa1处理或atg16l1的敲除不敏感(图18)，表明在溶酶体离子通量改变后tfeb调控的不同和特异性机制。这些结果与vatp酶在内腔离子通量变化后atg8蛋白质与溶酶体膜接合中的作用一致。有趣的是，其他显示出离子载体特性并调控单膜atg8接合的药物(7)也显示以atg16l1依赖或bafa1敏感的方式激活tfeb(图19)，表明溶酶体离子平衡的
破坏可能充当激活tfeb的共同触发物。
[0213]
为了进一步分离单膜atg8接合的作用，用若干atg16l1等位基因重构atg16l1敲除细胞，所述等位基因包括fip200结合突变体(δfbd)和c末端结构域截短(δctd)，其分别缺乏自噬体或单膜接合(13)。如图20所示，用trpml1激动剂c8处理后，tfeb在野生型atg16l1(wt)和atg16l1-δfbd(δfbd)细胞中激活，但在atg16l1-δctd(δctd)细胞中未激活。另外，在存在trpml1激动剂(例如，c8和ml-sa1)的情况下，用wd40点突变atg16l1-f467a(f467a)和atg16l1-k490a(k490a)重构的永生化atg16l1 ko小鼠巨噬细胞未表现出tfeb激活(图21)。重要的是，无论atg16l1状态如何，mtor抑制剂azd8055都能激活tfeb。这些观察结果证明，atg16l1 wd40结构域调控atg8与溶酶体膜的接合，并且这对于通过trpml1激动剂激活tfeb是重要的。为了证实功能性tfeb转录激活，我们监测已建立的靶基因(例如，flcn和sqstm1)的表达(15)，并观察到trpml1激活时以atg16l1依赖、bafa1敏感的方式上调。与钙调磷酸酶抑制剂fk506的共处理对用azd8055或c8处理后的基因表达没有影响(图22)。
[0214]
在核定位时，tfeb充当负责溶酶体生物发生的主要转录因子(15)。值得注意的是，trpml1依赖性转录组反应在很大程度上依赖于atg16l1，并且包括许多参与溶酶体功能的tfeb靶基因(图23和图24)。与这种概况一致，已发现trpml1激活以atg16l1依赖性方式增加lysotracker阳性细胞器的数量和强度(图25)。总之，这些观察结果证明，在溶酶体离子平衡的变化后，atg16l1中的wd40结构域调控溶酶体smac，并且这是tfeb激活和溶酶体生物发生所需的。
[0215]
实施例3
[0216]
本实施例证明了gabarap将flcn-fnip1复合物封存到溶酶体表面，以防止raggtp酶引起tfeb胞质保留。鉴于上述atg8接合机制(例如atg16l1、atg5、atg12、atg7和atg3)在激活tfeb中的新作用，则研究了负责的分子机制。哺乳动物atg8同源物包括map1lc3家族的3个成员(lc3a/b/c)和gabaa型受体相关蛋白质家族的3个成员(gabarap/l1/l2)(17)。使用组合crispr敲除方法，已发现gabarap蛋白质在用trpml1激动剂处理时特异性参与tfeb的激活(图26)。通过公共相互作用数据库对报道的结合配偶体进行的分析表明，gabarap(而非lc3蛋白质)与tfeb调控因子flcn和fnip1/2有独特的相互作用(18,19)。共免疫沉淀分析显示，gabarap可与flcn-fnip复合物相互作用，但包含lir依赖性相互作用所需的gabarap的lir结构域停泊位点(lds)突变的gabarap蛋白质无法降低flcn-fnip复合物(图27和图28)。
[0217]
假设响应于溶酶体离子通量的变化，gabarap与溶酶体膜的直接接合可将flcn/fnip复合物从胞质液重新分布到溶酶体膜(图29)。事实上，在trpml1激活后，观察到与膜相关的flcn和fnip1的快速且稳健的增加，并且这依赖于gabarap蛋白质的表达(图30)。另外，如图31所示，与对照相比，用trpml1激动剂处理的细胞表现出flcn与溶酶体蛋白质lamp1的共定位增强。为了证实向溶酶体膜的特异性募集，细胞被工程化以表达3xha-tmem192蛋白质，这是一种溶酶体特异性标志物，其可用作快速纯化溶酶体的操作(36)。溶酶体纯化揭示了在trpml1激动剂处理的15分钟内，flcn和fnip1稳健募集，其涉及gabarap蛋白质(图32)。flcn的溶酶体定位也发生在营养饥饿时，其中flcn特异性结合raga
gdp
并形成抑制性溶酶体卵泡蛋白复合物(lfc)(21,22)。然而，在缺乏作为lfc一部分的ragulator复合物组分
lamtor1的细胞中，trpml1激活仍然诱导flcn膜募集，指示flcn/fnip1的gabarap依赖性封存是不同于lfc形成的过程(图33)。
[0218]
与lfc形成对flcn-fnip gap活性的抑制作用类似(21,22)，假设flcn向溶酶体的gabarap依赖性募集也会抑制对ragc/ragd的gap活性。这将表明flcn-fnip1远离溶酶体表面向ragc/d施加其gap功能，从而促进ragc/d
gdp
结合状态和后续的ragc/d结合依赖性tfeb胞质保留(23,24)。事实上，raggtp酶二聚体已显示在饲养细胞条件下与溶酶体动态相互作用(25)。为了测试这一点，使用了nprl2 ko细胞，它们在饥饿时具有组成性raga/b
gtp
和flcn的缺陷性溶酶体定位(26)。flcn的敲除导致野生型和nprl2 ko细胞在营养丰富的条件下tfeb的完全核易位，支持flcn-fnip1远离溶酶体表面充当ragc/d的gap以调控tfeb的模型(图34)。另外，由于lfc的形成失败，nprl2 ko细胞在饥饿时不能激活tfeb，而用trpml1激动剂处理的细胞保留激活tfeb的能力，这与抑制flcn对raggtp酶的持续gap活性一致(图34)。然而，被锁定在活性状态(ragb
q99l
/ragd
s77l
)的raggtp酶的表达不再受flcn-fnip1调控，在trpml1激活后抑制了tfeb和其同源物tfe3的迁移率变动，但在azd8055的情况没有(图35)。flcn的gabarap依赖性封存也可不依赖于trpml1而发生(图36)，表明tfeb调控的这种机制可以广泛地与导致gabarap蛋白质与溶酶体以外的膜隔室接合的其他刺激物关联。总的来说，在溶酶体离子含量改变时的tfeb激活似乎依赖于flcn-fnip1复合物与溶酶体表面的gabarap依赖性栓系，在这里它无法对ragc/d施加gap活性。这导致ragc/d
gtp
状态稳定，并且tfeb从这种复合物中释放，允许其易位到核和tfeb依赖性溶酶体生物发生(图37)。
[0219]
实施例4
[0220]
本实施例阐明了fnip蛋白质上gabarap的新结合位点，并鉴定了参与atg8家族蛋白质对lir结构域的选择性的关键氨基酸残基。为了映射flcn-fnip复合物中gabarap的结合位点，采用标准技术重组并纯化每种蛋白质。gabarap在体外结合flcn-fnip2复合物，并且可在尺寸分级柱上共纯化(图38)。
[0221]
采用gee标记技术进行化学足迹法(37)。在这种方法中，将共价探针与所关注的蛋白质一起温育。所述探针将连接到天冬氨酸和谷氨酸残基，并且这种模式可在蛋白质消化和质谱仪上样时进行分析。对于本实验，建立了flcn-fnip2复合物的标记模式。然后将flcn-fnip2复合物与gabarap一起温育，并且再次进行gee标记，以确定哪些残基受到保护而不结合，并因此构成gabarap和flcn-fnip2之间的结合位点。如图39所示，如与复合物样品(flcn/fnip+gabarap)相比，游离样品(单独的flcn/fnip)中的标记增加所证明的，fnip2中的特定区域似乎受到保护。计算每种残基的k游离/k复合物比率，并且大于1.6的比率被视为对保护有重要意义。在flcn/fnip复合物的结构表示中，以红色突出显示特定的受保护区域。这种特定序列包含先前未报告的在fnip1和fnip2中均为保守的lir结构域(yvvi)。
[0222]
为了证实已鉴定的fnip区域介导gabarap与flcn-fnip复合物的相互作用，在fnip1的lir结构域中产生了点突变(yvlv》avla)。共免疫沉淀实验证实gabarap需要lir结构域yvlv与flcn-fnip1复合物相互作用(图40)。fnip1 lir中的突变不影响fnip1与flcn之间的相互作用(图41)。
[0223]
然后在hela背景中创建fnip1/fnip2双敲除细胞。fnip1/2dko导致flcn gap活性的完全丧失以及tfeb和tfe3转录因子的组成性激活，如持续的核定位和tfeb转录靶标gpnmb的表达增加所证明的(图42)。然后用wt-fnip1或lirmut-fnip1重构这些细胞。表达
fnip1的dko细胞的合并群体显示组成性tfeb/tfe3核定位的部分挽救。当这些细胞营养饥饿时，无论表达的fnip1变体如何，tfeb和tfe3均正常激活。然而，当用trpml1激动剂处理时，仅在表达wt-fnip1的细胞中观察到tfeb核定位，而在含有lir突变型fnip1变体的细胞中未观察到(图43a和图44a至图44b)。如图43b所示，用wt或lir(lir突变型y583a/v586a)fnip1重构fnip1/2双敲除(dko)细胞揭示了gabarap相互作用对trpml1激动剂的功能性需求，而非ebss、tfeb激活。在用trpml1激动剂进行慢性治疗时，通过靶基因gpnmb的蛋白质水平测量功能性tfeb转录反应。gpnmb表达在fnip1-lir突变型细胞中被完全阻断(图44d)。在azd8055处理时，gpnmb蛋白质水平也在很大程度上受到抑制，尽管tfeb被稳健激活。这突出显示了同时抑制蛋白质翻译如何使tfeb转录激活的有效范围最小化(图44d)。atg8接合未因fnip1的调节而改变(图43b)。这些发现证实，通过与fnip蛋白质直接相互作用，flcn-fnip复合物的gabarap依赖性重新定位对于溶酶体离子通量变化时的tfeb激活是重要的。
[0224]
实施例5
[0225]
本实施例检验了如下的概念，即gabarap蛋白质与亚细胞膜接合的任何情况都可能经由flcn/fnip的高亲和力封存导致tfeb激活。因此，检查了选择性自噬、线粒体自噬和异种吞噬的不同形式。已经证明，tfeb激活发生在parkin依赖性线粒体自噬期间(47)，并且如图45和图46所示，这种激活涉及gabarap蛋白质。此外，在稳定表达lir突变型fnip1的细胞中，tfeb激活存在缺陷，证实了flcn向线粒体的gabarap依赖性重新定位在机制上将tfeb激活与线粒体自噬联系在一起(图47)。有趣的是，一项早期研究观察到flcn和fnip在去极化时可定位于线粒体(48)，并且本文揭示的tfeb激活机制指示了这一点的相关性。重要的是，使用接近性调控的线粒体自噬系统，其中线粒体自噬使用keima荧光变动测定(49)(图48和图49)进行测量，证实了tfe3易位和flcn再分布(不依赖于线粒体解偶联剂)的gabarap依赖性(图50)。
[0226]
最后，利用沙门氏菌属感染异种吞噬模型来确定是否通过gabarap介导的flcn封存来调控tfeb激活。一部分肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(salmonella enterica serovar typhimurium)(鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium))被自噬机制快速锁定，并被atg8同源物修饰(50)。最近发现鼠伤寒沙门氏菌通过细菌效应子sopf(8)拮抗atg8反应。假设如果atg8蛋白质参与tfeb激活，则δsopf鼠伤寒沙门氏菌由于atg8接合的增加而显示出比wt更大的tfeb激活。实际上，δsopf鼠伤寒沙门氏菌在感染后的较长持续时间内，在较高百分比的细胞中产生了tfeb的稳健激活(图51至图53)。重要的是，通过缺失gabarap家族成员(rap_tko)，tfeb激活减弱，但不受lc3同功型(lc3_tko)敲除的影响(图54至图56)。此外，还对flcn的定位进行了检查，并且发现flcn的显著重新定位涂布含沙门氏菌属液泡膜(图57)。这种重新定位涉及gabarap蛋白质，指示flcn向沙门氏菌属液泡的gabarap依赖性封存导致感染时的tfeb激活(图57)。综上所述，这些选择性自噬的线粒体自噬和异种吞噬实例突出显示，flcn向不同细胞膜的gabarap依赖性封存可能充当将tfe3/tfeb转录因子的激活与选择性自噬的启动关联的通用机制。
[0227]
如图58所示，flcn-fnip gap复合物通过促进ragc/d的gdp结合状态，对tfeb/tfe3转录因子的mtor依赖性磷酸化和胞质保留进行了关键调控。如前所述，gdp结合的ragc/d直接结合于tfeb/tfe3并将其作为底物呈递给mtor(中心插图)。在营养饥饿期间(部分a)，flcn-fnip向溶酶体膜的募集有助于形成溶酶体卵泡蛋白复合物(lfc)，其对ragc/d具有降
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[0281]
等同物
[0282]
本领域技术人员将认识到，或者仅采用常规实验能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方案。本发明的范围并非旨在限于上述说明书，而是如所附权利要求中所阐述的。

技术特征：
1.一种不依赖于mtorc1活性而激活tfeb的方法，所述方法包括以下步骤：使系统与trpml1激动剂接触，所述系统包含：包含lamp-1、vatp酶或gabarap的膜；以及gabarap/flcn/fnip复合物的组分；使得所述膜处的所述gabarap/flcn/fnip复合物的水平升高。2.如权利要求1所述的方法，其中包含lamp-1vatp酶或gabarap的所述膜限定了隔室。3.如权利要求2所述的方法，其中所述隔室是或包含溶酶体。4.如权利要求1所述的方法，其中所述膜是或包含溶酶体膜。5.如权利要求5所述的方法，其中所述溶酶体膜是完整溶酶体的一部分。6.如权利要求3或权利要求6所述的方法，其中所述溶酶体处于细胞中。7.一种不依赖于mtorc1活性而激活tfeb的方法，所述方法包括以下步骤：施用trpml1激动剂。8.如权利要求7所述的方法，其中所述施用步骤包括使系统与所述trpml1激动剂接触，其中所述系统包含：溶酶体膜；和gabarap/flcn/fnip复合物的组分。9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述系统在以下中具有多态性或突变：编码接合机制蛋白质的基因(接合机制基因)和/或编码所述gabarap/flcn/fnip复合物的组分的基因。10.如权利要求9所述的方法，其中所述接合机制基因选自由atg3、atg5、atg7、atg12、atg16l1和其组合组成的组。11.如权利要求10所述的方法，其中所述接合途径基因是atg16l1。12.如权利要求11所述的方法，其中所述多态性是t300a。13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述trpml1激动剂属于选自由多肽、核酸、脂质、碳水化合物、小分子、金属和其组合组成的组的化学类别。14.如权利要求8所述的方法，其中所述施用步骤包括在多种条件下将所述系统暴露于所述trpml1激动剂并持续足够的时间，使得相对于在所述暴露之前的情况，在所述系统中观察到一种或多种clear网络基因的表达或活性增强和/或可检测的胞吐活性、自噬、溶酶体贮积物质清除和溶酶体生物发生中的一者或多者的增强。15.如权利要求8所述的方法，其中所述施用步骤包括在多种条件下将所述系统暴露于所述trpml1激动剂并持续足够的时间，使得相对于在所述暴露之前的情况，在所述系统中观察到选自表1的一种或多种基因的表达或活性增强。16.如权利要求7所述的方法，其中所述trpml1激动剂的特征在于，当评估对clear网络基因的表达的影响时，其显示出比在饥饿条件下观察到的更受限的影响。17.如权利要求1或权利要求7所述的方法，其中所述trpml1激动剂的特征在于，在可比条件下，其存在时的trpml1水平或活性高于其不存在时的trpml1水平或活性。18.如权利要求1或权利要求7所述的方法，其中所述trpml1激动剂是直接激动剂，因为其与trpml1相互作用。19.如权利要求1或权利要求7所述的方法，其中所述trpml1激动剂是间接激动剂，因为
其不直接与trpml1相互作用。20.一种治疗trpml1相关的疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括以下步骤：向患有或易患所述trpml1相关的疾病、病症或疾患的受试者施用trpml1激动剂。21.如权利要求20所述的方法，其中所述trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含炎症性疾患。22.如权利要求20所述的方法，其中所述trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含溶酶体贮积症。23.如权利要求20所述的方法，其中所述trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含聚谷氨酰胺病症。24.如权利要求20所述的方法，其中所述trpml1相关的疾病、病症或疾患是或包含神经退行性蛋白病。25.如权利要求20所述的方法，其中所述trpml1相关的疾病、病症或疾患是感染性疾病。26.如权利要求20所述的方法，其中所述trpml1相关的疾病、病症或疾患选自由克罗恩病、庞贝病、帕金森病、亨廷顿病、阿茨海默病、脊髓延髓肌萎缩、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症和多发性硫酸酯酶缺乏症组成的组。27.如权利要求20所述的方法，其中所述trpml1相关的疾病、病症或疾患是克罗恩病。28.一种激活tfeb的方法，所述方法通过增强细胞内膜表面的gabarap/fnip/flcn复合物定位来实施。29.如权利要求28所述的方法，其中所述细胞内膜表面是细胞内隔室的胞质表面。30.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞内隔室是溶酶体。31.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞内隔室是线粒体。32.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞内隔室是内质网。33.如权利要求28-32中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用trpml1激动剂。34.如权利要求28-33中任一项所述的方法，其中tfeb激活不依赖于mtorc1活性。35.一种表征tfeb激活剂的方法，所述方法包括：评估对一种或多种细胞内膜表面的flcn定位和/或gabarap/fnip/flcn复合物的水平的影响。36.一种治疗接合机制相关的(“cma”)疾病、病症或疾患或者gabarap/fnip/flcn复合物相关的疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括以下步骤：施用trpml1激动剂。37.如权利要求27所述的方法，其中所述疾病、病症或疾患是或包含克罗恩病。38.一种包括用于表征tfeb、tfe3和/或mitf的激活剂的细胞测定的方法，其中所述细胞测定包括包含以下的细胞：(a)vatp酶小分子抑制剂的存在；(b)atg8接合机制的遗传破坏；(c)atg8接合机制的小分子抑制剂的存在；(d)蛋白质的gabarap亚家族成员的遗传破坏；(e)fnip1或fnip2中lir结构域的突变；
或其组合。39.如权利要求38所述的方法，其中所述vatp酶小分子抑制剂是巴佛洛霉素a1。40.如权利要求38所述的方法，其中所述vatp酶小分子抑制剂不是水杨酰卤酰胺a的类似物。41.如权利要求38所述的方法，其中所述atg8接合机制的遗传破坏包括基因敲除、基因敲入、一种或多种突变等位基因的表达、sirna、shrna、反义，或其组合。42.如权利要求38所述的方法，其中所述蛋白质的gabarap亚家族成员的遗传破坏包括基因敲除、基因敲入、一种或多种突变等位基因的表达、sirna、shrna、反义，或其组合。

技术总结
本公开涉及不依赖于mTORC1活性而激活TFEB的方法，通过增强细胞内膜表面的GABARAP/FNIP/FLCN复合物定位来激活TFEB的方法，表征TFEB激活剂的方法，和治疗TRPML1相关的疾病、病症或疾患的方法，以及用于所述方法的组合物。物。物。


技术研发人员：J
受保护的技术使用者：卡斯玛治疗公司
技术研发日：2021.07.26
技术公布日：2023/7/7