新型美登素类似物作为ADC有效载荷及其在癌症治疗中的用途的制作方法

新型美登素类似物作为adc有效载荷及其在癌症治疗中的用途
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技术领域
3.本发明描述了新的类美登素和安丝菌素衍生物及其有效载荷的制备方法，该有效载荷含有能与细胞结合剂偶联的官能团的连接子，用以制备细胞毒性药物偶联物的。本发明进一步涉及这些偶联物用于治疗癌症的治疗用途，因为偶联物被靶向并选择性地递送至特定肿瘤细胞群。本发明进一步涉及由美登素和安丝菌素衍生物有效载荷制成的抗体药物偶联物的制备方法、药物组合物及其用于治疗癌症的用途，该有效载荷含有与肿瘤相关抗原(taa)结合剂偶联的连接子。


背景技术：

4.已经开发了许多先进的诊断和治疗方法，但癌症仍然是全世界死亡的主要原因。成功治疗和预防癌症的主要障碍在于许多癌症仍然无法对当前的化学治疗和免疫治疗干预做出反应，并且许多个体即使在积极治疗后也会复发或死亡。
5.癌症免疫疗法正在复兴，在过去几年中，在快速发展的领域产生了几种治疗癌症的新方法。许多癌症免疫治疗策略一直是广泛研究和临床评估的重点，包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体进行治疗；使用抗体-药物偶联物进行治疗；使用针对共刺激或共抑制分子(免疫检查点)的激动、拮抗或阻断抗体进行治疗；使用双特异性t细胞参与的抗体进行治疗，例如blinatumomab；涉及施用生物反应调节剂如il-2、il-12、il-15、il-21、gm-csf ifn-α，ifn-β和ifn-γ的治疗；使用治疗性疫苗(如sipuleucel-t)进行治疗；使用树突状细胞疫苗或肿瘤抗原多肽疫苗进行治疗；使用嵌合抗原受体(car)-t细胞进行治疗；使用car-nk细胞进行治疗；使用肿瘤浸润淋巴细胞(til)进行治疗；和使用过继转移的抗肿瘤t细胞(离体扩增和/或tcr转基因)进行治疗。
6.抗体-药物偶联物(adc)将抗体的结合特异性与药物的效力相结合，例如细胞毒剂、抗癌药物和免疫抑制药物。adc的使用是靶向特异性递送药物，如果以非偶联的药物的形式给药，可能会对正常细胞产生不可接受的毒性水平。adc的作用机制是通过抗体识别并结合特定抗原，引发一系列反应，然后通过胞吞作用进入细胞质，在溶酶体酶的作用下，高细胞毒性药物从抗体上解离出来对癌细胞进行杀伤。与对癌细胞和正常组织不加区分地损伤的传统化疗相比，靶向给药可以使药物直接作用于癌细胞，减少对正常细胞的损伤。
7.抗体-药物偶联物使用细胞毒素抑制各种不同重要细胞靶标,例如微管
(maytansinoids,auristatins,taxanes:us pat.nos.5,208,020；5,416,064；6,333.410；6,441,163；6,340,701:6,372,738；6,436,931；6,596,757:7.276,497；7,301,019；7,303,749；7,368,565；7,473,796；7,585,857；7,598,290:7.495,114；7,601,354,us patent application nos.20100092495,20100129314,20090274713,20090076263,20080171865)和dna(calicheamicin,doxorubicin,cc-1065analogues:us pat.nos.5,475,092：5,585,499；5,846,545；6,534,660；6,756,397；6,630,579；7,388,026；7,655,660；7,655,661)。
8.美登素是有效的抗有丝分裂剂，通过抑制微管蛋白的组装来干扰微管的形成(remillard，等人(1975)science 189：1002-1005)。虽然美登素比甲氨蝶呤、柔红霉素和长春新碱(美国专利号3,896,111)等常规化学治疗剂的细胞毒性高100至1000倍，观察到美登素类药物由于治疗窗口不足而在人体临床试验中失败。
9.由于其高细胞毒性，已公开了在n-甲基丙氨酰部分上带有各种酰基侧链的类美登素，适用于连接细胞结合剂(参见例如美国专利号5,208,020；5,416,064；7,473,796；7,368,565；7.301,019；7,276,497；6,716,821；6,441,163:us patent application nos.20100129314:20100092495；20090274713；20090076263；20080171865；20080171856；20070270585；20070269447；20070264266；and 20060167245；chari et al.,cancer res.,52:127-131(1992)；liu等人，proc.natl.acad.sci.,93:8618-8623(1996)；和widdison等人，j.med.chem.,49；4392,2006)。在这些偶联物中，细胞结合剂通过可裂解的二硫键与美登素如dm1(n-脱乙酰基-n-(3-巯基-1-丙酰基)-美登素，cas编号：139504-50-0，图2)或dm4(n-脱乙酰基-n-(4-巯基-4-甲基-1-戊酰基)-美登素,cas number:796073-69-31)。
10.仍然非常需要用于治疗或预防癌症和/或免疫疾病复发的新型有效adc。


技术实现要素：

11.本发明描述了新的类美登素和安丝菌素衍生物及其有效载荷的制备方法，该有效载荷含有能与细胞结合剂偶联的官能团的连接子，用以制备细胞毒性药物偶联物的。
12.一方面，本发明涉及抗体药物偶联物(adc)，其包含一个抗体(例如，细胞结合抗体)化学键连接至下式(i)表示的衍生的美登醇或美登醇类似物残基：[mayo-l-]x-ab(i)其中x为约1至约10；ab是抗体(例如，细胞结合抗体)或其抗原结合片段；其中mayo是美登醇或美登醇类似物；l是包含下式表示的n-甲基丙氨酸部分的二价连接子：其中*表示与mayo的连接点，**表示与ab的连接点；y选自
其中m为0-8，n＝2-12。
[0013]
在各种实施方案中，ab是抗trop-2抗体或其抗原结合片段。
[0014]
在各种实施方式中，本发明涉及抗体药物偶联物，其中x为约1至约10。在各种实施方式中，x为约4至约7。在各种实施方式中，x为约4。在各种实施例中，x约为6。在各种实施例中，x约为7。
[0015]
另一方面，本发明涉及下式(ii)表示衍生化的美登醇或美登醇类似物：mayo-l'(ii)其中mayo是美登醇或美登醇类似物，l'是下式表示包含的n-甲基丙氨酸部分的二价连接子：其中*表示与mayo的连接点；y'包含可连接于抗体(例如，细胞结合抗体)的官能团。
[0016]
在各种实施方案中，本发明涉及衍生的美登醇或美登醇类似物，其中y'包含吡咯啉二酮。
[0017]
在各种实施方案中，本发明涉及衍生的美登醇或美登醇类似物，其中y'选自
m为0至8；n为2到12。
[0018]
在各种实施方案中，y'是具有式(iii)的连接子试剂：其中m＝0-8，n＝2-12。
[0019]
在各种实施方案中，y'是具有式(iv)的连接子试剂：其中n＝2-12。
[0020]
在各种实施方案中，y'是具有式(v)的连接子试剂：其中n＝2-12。
[0021]
另一方面，本发明涉及下式(vi)表示的衍生的美登醇或美登醇类似物残基：mayo-l2' (vi)其中mayo是美登醇或美登醇类似物，l2'是由下式表示的二价连接子：*-c(＝o)ry"，其中*表示与mayo的连接点；r是3-7元杂环基、芳基或环状烷基环；和y”包含可以连接至抗体(例如，细胞结合抗体)的官能团。
[0022]
在另一个方面，本发明涉及下式(vii)表示抗体药物偶联物，其包含与一个抗体(例如，细胞结合抗体)通过化学键连接到衍生的美登醇或美登醇类似物残基：[mayo-l2-]x-ab (vii)
其中x为约1至约10；ab是抗体(例如，细胞结合抗体)或其抗原结合片段；其中mayo是美登醇或美登醇类似物；l2是由下式表示的二价连接子：*-c(＝o)ry
”‑
**，其中*表示与mayo的连接点，**表示与ab的连接点；r是3-7元杂环基、芳基或环状烷基环；和y”包含可以连接于细胞结合抗体的官能团。
[0023]
在各种实施方案中，ab是抗trop-2抗体或其抗原结合片段。
[0024]
在各种实施方案中，本发明涉及一种抗体药物偶联物，其中l2是从下列选择的二价连接子：价连接子：其中m＝0-3；和n＝2-12。
[0025]
在各种实施方案中，本发明涉及抗体药物偶联物，其中x为约1至约10。在各种实施方案中，x为约4至约7。在各种实施方案中，x为约4。在各种实施方案中，x约为6。在各种实施方案中，x约为7。
[0026]
在各种实施方案中，本发明涉及衍生化的美登醇或美登醇类似物，其中l2包含吡咯啉二酮。在本发明的各种实施方案中，杂环选自饱和或不饱和的4-6元含氮杂环。饱和杂环基的实例包括饱和的3-6元杂单环基，其含有1-4个氮原子[例如吡咯烷基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基]；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的饱和3至6元杂单环基团[例如吗啉基]；饱和的3至6元杂单环基团，含有1至2个硫原子和1至3个氮原子[例如噻唑烷基]。不饱和杂环基团，也称为“杂芳基”基团，包括含有1-4个氮原子的不饱和5-6元杂单环基，例如吡咯基、吡咯啉基、咪唑基、吡唑基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基，嘧啶基，吡嗪基，哒嗪基，三唑基[例如，4h-1,2,4-三唑基，1h-1,2,3-三唑基，2h-1,2,3-三唑基]；含有1-5个氮原子的不饱和稠合杂环基，例如，吲哚基、异吲哚基、中氮茚基、苯并咪唑基、喹啉基、异喹啉基、
吲唑基、苯并三唑基、四唑并哒嗪基[例如，四唑并[1,5-b]哒嗪基]；含有1至2个氧原子和1至3个氮原子的不饱和5至6元杂单环基团，例如恶唑基、异恶唑基、恶二唑基[例如1,2,4-恶二唑基、1,3,4-恶二唑基、1,2,5-恶二唑基]；含有1-2个氧原子和1-3个氮原子的不饱和稠合杂环基[例如苯并恶唑基、苯并恶二唑基]；以及含有1-2个硫原子和1-3个氮原子的不饱和5-6元杂单环基团，例如噻唑基、噻二唑基[例如1,2,4-噻二唑基。在本发明的各种实施方案中，环状烷基环，也称为环烷基环，是通过从母体环烷烃的单个碳原子上除去一个氢原子而衍生的饱和环状烷基。典型的环烷基包括但不限于衍生自环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷和环庚烷等的基团。
[0027]
在各种实施方案中，l2'是具有式(viii)的连接子：其中n＝2-12。
[0028]
在各种实施方案中，l2'是具有式(ix)的连接子：其中n＝2-12。
[0029]
在各种实施方案中，l2'是具有式(x)的连接子：其中m＝0-3，n＝2-12。
[0030]
本专利提供一个与美登醇或美登醇类似物偶联的抗trop-2抗体，从而靶向疾病细胞或组织。抗trop-2抗体与疾病细胞或组织中的抗原结合。与抗体偶联的药物对抗原表达细胞产生细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制作用，以治疗或预防trop-2阳性癌症的复发。抗体药物偶联物的高亲和力确保美登醇或美登醇类似物靶向肿瘤细胞。本技术提供了一种通过对trop-2阳性细胞递送美登醇或美登醇类似物的细胞抑制或杀伤作用来治疗癌症的方法。
[0031]
在各种实施方案中，adc包含l或l2，它们是不可切割的连接子。在各种实施方案中，adc是由美登醇或美登醇类似物与抗trop-2抗体偶联。在各种实施方案中，adc是由美登
醇或美登醇类似物与抗trop-2抗体偶联，其中美登醇或美登醇类似物通过并非酸性不稳定的连接子与抗trop-2抗体连接。在各种实施方案中，adc是由美登醇或美登醇类似物与抗trop-2抗体偶联，其中美登醇或美登醇类似物通过对肽酶组织蛋白酶不敏感的连接子与抗trop-2抗体连接。在各种实施方案中，adc是由美登醇或美登醇类似物与抗trop-2抗体偶联，其中美登醇或美登醇类似物通过不含二硫键的连接子与抗trop-2抗体连接。在各种实施方案中，adc是由美登醇或美登醇类似物与抗trop-2抗体偶联，其中美登醇或美登醇类似物通过在体内循环期间提供稳定性同时一旦进入细胞能够释放的连接子与抗trop-2抗体连接药物。预期此类连接子可在内吞作用之前，例如在体内循环期间为偶联分子提供稳定性，以防止连接子过早降解导致有毒药物的释放，从而使药物的毒副作用最小化。
[0032]
在各种实施方案中，提供了一组式i和vii的adc中的一个或多个，其中l和l2是能与半胱氨酸反应的连接子。
[0033]
在各种实施方案中，提供了一组式ii和vi的化合物中的一个或多个，其中l'和l2'是不可切割的连接子。
[0034]
在各种实施方案中，药物连接子和抗trop-2抗体上的半胱氨酸残基之间形成的键的数目为3至10。在各种实施方案中，此类键的数目为至少2个，或者至少4个。在各种实施方案中，此类形成的键的数目不超过10，或者不超过9、或8、7、6、5或4。在各种实施方案中，平均每个抗trop-2抗体通过半胱氨酸与约4-7个药物分子结合。
[0035]
抗trop-2抗体的载药量可能因许多因素而异，例如药物的效力、抗trop-2抗体的大小、稳定性、抗trop-2抗体上可偶联的基团等等。在各种实施方案中，1至10个美登醇或美登醇类似物分子与1个抗trop-2抗体分子偶联。在各种实施方案中，平均约4至7个美登醇或美登醇类似物药物分子与抗trop-2抗体分子偶联。
[0036]
本发明的另一方面涉及在哺乳动物中抑制异常细胞生长或治疗增殖性疾病、自身免疫性疾病、破坏性骨疾病、传染病、病毒性疾病、纤维化疾病、神经退行性疾病、胰腺炎或肾病的方法，包括向哺乳动物施用所述哺乳动物治疗有效量的式i和vii的偶联物和任选的化疗剂。
[0037]
本发明的另一方面涉及式i和vii的细胞结合剂偶联物及其药学上可接受的载体、添加剂或稀释剂的药物组合物
[0038]
在各种实施方案中，本发明的adc结构包含作为靶向部分的ab，例如抗体或抗体片段能够结合肿瘤相关抗原(taa)、组织特异性抗原、细胞表面分子，胞外基质蛋白或蛋白酶，或任何翻译后修饰残基。在各种实施方案中，本发明的adc结构包含ab，它是一种对患病细胞或组织表现出结合亲和力的靶向部分。
[0039]
在各种实施方案中，抗体或抗体片段能够结合肿瘤相关抗原，该肿瘤相关抗原选自：肿瘤相关钙信号转导子2(也称为trop-2)、her2、her3、her4、egf、egfr、cd2、cd3、cd5、cd7、cd13、cd19、cd20、cd21、cd23、cd30、cd33、cd34、cd38、cd46、cd55、cd59、cd69、cd70、cd71、cd97、cd117、cd123、cd127、cd134、cd137、cd138、cd146、cd147、cd152、cd154、cd174、cd195、cd200、cd205、cd212、cd223、cd227、cd253、cd272、cd274、cd276、cd278、cd279、cd309、cd319、cd326、cd340、dr6、kv1.3、5e10,muc1,upa,mage3,muc16,klk3,k-ras,mesothelin,p53,survivin,g250,psma,endoplasmin,bcma,gpnmb,epha2,ephb2,tmeff2,integrin beta 6,5t4,ca9,igf-1r,axl、b7h3、b7h4、cdh6、havcr1、steap-1、steap-2、
upk2、cldn18。
[0040]
在各种实施方案中，adc包含选自下组的结合肿瘤相关抗原的抗体：完全人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、抗原结合抗体片段、fab、fab'、fab 2、fab'2、igg、igm、iga、ige、scfv、dsfv、dab、纳米抗体、单体和双抗体。在各种实施方案中，抗体是嵌合抗体。在各种实施方案中，抗体是人源化单克隆抗体。在各种实施方案中，抗体是完全人单克隆抗体。
[0041]
在多个实施方案中，抗体是人源化抗trop-2抗体，其包含具有如seq id no:1所示氨基酸序列的轻链和具有如seq id no:1所示氨基酸序列的重链2.在多个实施方案中，抗体是人源化抗trop-2抗体，其包含具有三个互补区的重链可变结构域，所述互补区由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:7)组成id no:8)，以及具有三个互补区的轻链可变结构域，这些互补区由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成。
[0042]
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体混合的分离的adc构建体。
[0043]
另一方面，本发明提供adc构建体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
[0044]
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗受试者的癌症或癌症转移的方法，包括将治疗有效量的本发明的药物组合物施用于有需要的受试者。在一个实施方案中，受试者是人类受试者。在各种实施方案中，癌症选自胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、肺癌、前列腺癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌，或横纹肌肉瘤或任何癌症。
[0045]
在各种实施方案中，受试者先前对抗癌疗法的治疗有反应，但在停止治疗后，复发(下文称为“复发性癌症”)。在各种实施方案中，受试者患有抗药性或难治性癌症。
[0046]
在另一个方面，本发明提供一种用于治疗受试者的癌症或癌症转移的方法，包括施用治疗有效量的本发明的药物组合物与选自以下的第二疗法组合：细胞毒性化学疗法，免疫治疗、小分子激酶抑制剂靶向治疗、手术、放射治疗、干细胞移植、细胞治疗，包括car-t、car-nk、ips诱导的car-t或ips诱导的car-nk和疫苗，如卡介苗(bcg)。在各种实施方案中，联合疗法可以包括向受试者施用治疗有效量的免疫疗法，包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体的治疗；使用抗体-药物偶联物进行治疗；使用针对共刺激或共抑制分子(免疫检查点)如ctla-4、pd-1、pd-l1、cd40、ox-40、cd137、gitr、lag3、tim-3、siglec 7、siglec 8、siglec 9、siglec 15和vista的激动、拮抗或阻断抗体进行治疗；使用双特异性t细胞结合抗体治疗，例如blinatumomab：治疗涉及施用生物反应调节剂，例如il-12、il-21、gm-csf、ifn
–
α，ifn-β和ifn-γ；使用治疗性疫苗(如sipuleucel-t)进行治疗；使用树突状细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗进行治疗；使用嵌合抗原受体(car)-t细胞进行治疗；使用car-nk细胞进行治疗；使用肿瘤浸润淋巴细胞(til)进行治疗；使用过继转移的抗肿瘤t细胞(离体扩增和/或tcr转基因)进行治疗；使用tall-104细胞治疗；和使用免疫刺激剂治疗，例如toll样受体(tlr)激动剂，cpg和咪喹莫特；以及使用卡介苗等疫苗进行治疗；其中联合疗法任选地提供增加的肿瘤细胞的效应细胞杀伤，即当共同施用时adc药物和免疫疗法之间存在协同作用。
[0047]
在另一方面，提供了本文所述的新型化合物及其制备方法。
附图的简要说明
[0048]
图1描述了美登素和安丝菌素的结构。
[0049]
图2描述了dm-1和dm-4的结构。
[0050]
图3描述了化合物bi-p204的合成。
[0051]
图4描述了化合物bi-p203的合成。
[0052]
图5描述了化合物bi-p205的合成。
[0053]
图6描述了化合物bi-p206的合成。
[0054]
图7描述了化合物bi-p207的合成。
[0055]
图8描述了化合物bi-p208的合成。
[0056]
图9描述了化合物bi-p209的合成。
[0057]
图10描述了化合物bi-p210的合成。
[0058]
图11描述了化合物bi-p211的合成。
[0059]
图12描绘了美登素有效载荷与还原单抗的偶联过程。
[0060]
图13描绘了用线图描述在trop-2阳性胰腺癌细胞系bxpc-3中含有各种dm1衍生物的adc的体外细胞毒性测定结果。
[0061]
图14描绘了用线图描述在trop-2阳性乳腺癌细胞系mda-mb-468中含有各种dm1衍生物的adc的体外细胞毒性测定结果。
[0062]
图15描绘了用线图描绘在trop-2阳性胃癌细胞系nci-n87中含有各种dm1衍生物的adc的体外细胞毒性测定结果。
[0063]
图16描绘了用线图描绘在trop-2阳性卵巢癌细胞系sk-br-3中含有各种dm1衍生物的adc的体外细胞毒性测定结果。
[0064]
图17描绘了用线图描绘在trop-2阳性结肠癌细胞系colo205中含有各种dm1衍生物的adc的体外细胞毒性测定结果。
[0065]
图18描绘了用线图描绘在trop-2阴性肺癌细胞系a549中含有各种dm1衍生物的adc的体外细胞毒性测定结果。
[0066]
图19描绘了用线图描绘在trop-2阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231中含有各种dm1衍生物的adc的体外细胞毒性测定结果。
[0067]
图20描绘了用线图描述在trop-2阳性乳腺癌细胞系mda-mb-468、卵巢癌细胞系sk-br-3中adc-bi-p203和adc-bi-p209的，结肠癌细胞系colo205和trop-2阴性肺癌细胞系a549体外细胞毒性测定结果。
[0068]
图21描绘了用线图描述在trop-2阳性乳腺癌细胞系mda-mb-468(a)和trop-2阴性肺癌细胞a549(b)中adc-bi-p203和adc-bi-p209的体外细胞毒性测定结果。
[0069]
图22描绘了用线图描绘抗trop-2-bi-p203 adc在mda-mb-468异种移植模型中的体内功效。图22a描绘了平均肿瘤体积(mm 3)，图22b描绘了体重(g)。
[0070]
图23描绘了用线图描绘抗trop-2-bi-p203 adc在colo205异种移植模型中的体内功效。图23a描绘了平均肿瘤体积(mm 3)，图23b描绘了体重(g)。实施本发明的模式
[0071]
本发明提供新的类美登素药物连接子衍生物有效载荷，以及包含与抗体连接的本发明的美登素类药物连接子衍生物有效载荷的新型抗体药物偶联物，用于靶向递送至疾病
组织。在各种实施方案中，本发明提供了抗体-药物偶联物(adc)和adc衍生物以及与使用此类偶联物治疗癌症有关的方法。adc中的抗体或其他靶向部分与例如癌细胞上的肿瘤相关抗原(taa)结合。在各种实施方案中，抗体与新的dm1衍生物有效载荷偶联，该有效载荷对抗原表达细胞发挥细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制作用，以治疗或预防抗原表达癌症或免疫病症的复发。重要的是，本发明的adc具有优异的药物/抗体比(dar)，表现出改善的溶解度、增强的cmc特性和增加的治疗功效，特别是针对高抗原表达肿瘤同时保留表达低水平或不表达抗原水平的正常组织。此外，adc提供了针对更广泛的患者群体和患有难治性癌症或先前对抗癌治疗有反应但在停止治疗后复发(以下称为“复发性癌症”)的患者。定义
[0072]
除非本文另有定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交结合使用的命名法和技术是本领域常用和熟知的那些。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行，并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所述。参见，例如，green和sambrook，molecular cloning：a laboratory manual，第4版，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，ny(2012)，通过引用并入本文。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域通常完成的或如本文所述。与本文所述的分析化学、有机合成化学以及药物和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域常用和众所周知的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及对象的治疗。
[0073]
如本文所用，术语“烷基”是指具有至多20个碳原子的完全饱和的支链或直链烃部分。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。
[0074]
如本文所用，术语“杂环基”、“杂环烷基”或“杂环”是指饱和或不饱和的非芳香环或环系统，并且包含至少一个选自o、s和n的杂原子。杂环基可以连接在杂原子、碳原子或两者上。
[0075]
如本文所用，术语“芳基”是指在环部分具有6-20个碳原子的芳烃基团。通常，芳基是具有6-20个碳原子的单环、双环或三环芳基。此外，如本文所用，术语“芳基”是指可以是单个芳环或稠合在一起的多个芳环的芳香部分。非限制性实例包括苯基、萘基或四氢萘基，它们中的每一个可任选地被1-4个取代基取代，例如烷基、三氟甲基、环烷基、卤素、羟基、烷氧基、酰基、烷基-c(o)-o-、芳基-o-、杂芳基-o-、氨基、硫醇、烷基-s-、芳基-s
‑‑
硝基、氰基、羧基、烷基-oc(o)
‑‑
、氨基甲酰基、烷基-s(o)-、磺酰基、磺胺基、苯基和杂环基。
[0076]
如本文所用，“环状烷基”或“环烷基”是指3-12个碳原子的饱和或不饱和单环、双环或三环烃基。除非另有说明，否则环烷基是指具有3至9个环碳原子或3至7个环碳原子的环状烃部分，其各自可任选地被一个、或两个、或三个或更多个独立地选自以下的取代基取代由烷基、卤素、氧代、羟基、烷氧基、烷基-c(o)
‑‑
、酰氨基、氨基甲酰基、烷基-nh
‑‑
、(烷基)2n
‑‑
、硫醇、烷基-s
‑‑
、硝基组成的组，氰基、羧基、烷基-o
‑‑
c(o)
‑‑
、磺酰基、磺酰氨基、氨磺
酰基和杂环基。
[0077]
如本文所用，除非另有说明，否则术语“任选取代的”是指未被取代或被一个或多个，通常为1、2、3或4个合适的非氢取代基取代的基团。
[0078]
本领域技术人员可以容易地确定给定部分与母体结构的连接点。因此，尽管连接点可能没有明确显示，但基于化学领域的公知常识，这对于技术人员来说是显而易见的。
[0079]
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。在各种实施方案中，“肽”、“多肽”和“蛋白质”是其α碳通过肽键连接的一链氨基酸。因此，在链的一端(氨基末端)的末端氨基酸具有游离氨基，而在链的另一端(羧基末端)的末端氨基酸具有游离羧基。如本文所用，术语“氨基末端”(缩写为n-末端)是指α肽的氨基末端的氨基酸上的游离-氨基或α-氨基(参与肽键时的亚氨基)肽内任何其他位置的氨基酸。类似地，术语“羧基末端”是指肽的羧基末端上的游离羧基或肽内任何其他位置的氨基酸的羧基。肽还包括基本上任何聚氨基酸，包括但不限于肽模拟物，例如通过醚键而不是酰胺键连接的氨基酸。
[0080]
本发明的多肽包括以任何方式和出于任何原因被修饰的多肽，例如，以：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(5)赋予或改变其他物理化学或功能特性。例如，可以在天然存在的序列中(例如，在形成分子间接触的结构域之外的多肽部分)进行单个或多个氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代)。“保守氨基酸取代”是指多肽中的氨基酸被功能相似的氨基酸取代。“非保守氨基酸取代”是指将这些类别之一的成员替换为来自另一类别的成员。在进行此类改变时，根据各种实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数。基于其疏水性和电荷特性，每种氨基酸都被指定了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
[0081]
本领域理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性(参见，例如，kyte等人，1982，j.mol.biol.157：105-131)。已知某些氨基酸可以替代具有相似亲水指数或分数的其他氨基酸并且仍然保留相似的生物活性。在基于亲水指数进行改变时，在各种实施方案中，包括取代亲水指数在
±
2以内的氨基酸。在各种实施例中，包括那些在
±
1以内的，并且在各种实施例中，包括那些在
±
0.5内的。
[0082]
本领域还理解相似氨基酸的取代可以基于亲水性有效地进行，特别是在由此产生的生物学功能性蛋白质或肽意欲用于免疫学实施方案的情况下，如本文所公开的。在各种实施方案中，蛋白质的最大局部平均亲水性，由其相邻氨基酸的亲水性决定，与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学特性相关。
[0083]
以下亲水性值已分配给这些氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0.+-.1)；谷氨酸(+3.0.+-.1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)和色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性值进行改变时，在各种实施方案中，包括
亲水性值在
±
2以内的氨基酸的取代，在各种实施例中，包括那些
±
1内的，并且在各种实施例中，包括那些
±
0.5内的。
[0084]
如本文所用，术语“多肽片段”和“截短的多肽”是指与相应的全长蛋白质相比具有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在各种实施方案中，片段可以是，例如，至少5个、至少10个、至少25个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、长度为至少400、至少450、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900或至少1000个氨基酸。在各种实施方案中，片段也可以是，例如，至多1000、至多900、至多800、至多700、至多600、至多500、至多450、至多400、至多350、至多300、至多250、至多200、至多150、至多100、至多50、至多25、至多10或至多5个氨基酸长度。片段可以在其任一端或两端进一步包含一个或多个附加氨基酸，例如来自不同天然存在的蛋白质(例如，fc或亮氨酸拉链结构域)或人工氨基的氨基酸序列酸序列(例如，人工连接子序列)。
[0085]
如本文所用，术语“多肽变体”和“多肽突变体”是指包含氨基酸序列的多肽，其氨基酸序列被插入、删减和/或取代一个或多个氨基酸残基相对于另一多肽序列。在各种实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少25,至少50,至少75,至少100,至少125,至少150,至少175,至少200,至少225,至少250,至少275,至少300,至少350,至少长度至少400、至少450或至少500个氨基酸。本发明的变体包括融合蛋白。
[0086]
已经被化学修饰的多肽，例如，与另一种化学部分例如聚乙二醇、白蛋白(例如人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化的结合。
[0087]
术语“％序列一致性”在本文中可与术语“％一致性”互换使用，是指比对时两个或多个肽序列之间的氨基酸序列一致性水平或两个或多个核苷酸序列之间的核苷酸序列一致性水平使用序列比对程序。例如，如本文所用，80％一致性是指与通过定义的算法确定的80％序列一致性相同的事物，并且是指给定序列与另一序列的另一长度至少80％一致性。在各种实施方案中，％一致性选自例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少与给定序列有95％，或至少99％或更多的序列一致性。在各种实施方案中，％一致性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％的范围内至约95％，或约95％至约99％。
[0088]
术语“％序列同源性”在本文中与术语“％同源性”可互换使用，是指比对时两个或多个肽序列之间的氨基酸序列同源性水平或两个或多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性水平使用序列比对程序。例如，如本文所用，80％同源性是指与通过定义的算法确定的80％序列同源性相同的事物，因此给定序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80％的序列同源性。在各种实施方案中，同源性百分比选自例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少与给定序列具有95％，或至少99％或更多的序列同源性。在各种实施方案中，％同源性在例如约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％的范围内至约95％，或约95％至约99％。
[0089]
可用于确定两个序列之间一致性的示例性计算机程序包括但不限于blast程序套件，例如blastn、blastx和tblastx、blastp和tblastn，可在互联网上的ncbi网站上公开获得。另见altschul等人，j.mol.biol.215:403-10,1990(特别参考公布的默认设置，即参数w＝4,t＝17)和altschul等人，nucleic acids res.,25:3389-3402,1997。通常在评估给定
氨基酸序列相对于genbank蛋白质序列和其他公共数据库中的氨基酸序列时使用blastp程序进行。blastx程序适用于在genbank蛋白质序列和其他公共数据库中搜索已有所有翻译成可阅读形式的核酸序列。blastp和blastx都使用11.0的开放间隙惩罚和1.0的扩展间隙惩罚的默认参数运行，并使用blosum-62矩阵。见id。
[0090]
除了计算序列一致性百分比之外，blast算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参考例如，karlin&altschul,proc.nat'l.acad.sci.usa,90:5873-5787,1993)。blast算法提供的一种相似性度量是最小和概率(p(n))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸比较中的最小总概率为例如小于约0.1、小于约0.01或小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似.
[0091]
在多肽序列的上下文中，术语“基本相似”或“基本相似”表示多肽区域具有至少70％，典型地至少80％，更典型地至少85％，或至少90％的序列或至少95％与参考序列的序列相似性。例如，一种多肽与第二种多肽基本相似，例如，其中两种肽因一个或多个保守取代而不同。
[0092]
如本文所用，术语“重组多肽”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生、衍生或分离的所有多肽，包括融合分子和adc，例如使用转染的重组表达载体表达的多肽进入宿主细胞。
[0093]
如本文所用，术语“异源”是指非天然的或天然存在的组合物或状态，例如，可通过用衍生自另一来源的组合物或状态替代现有的天然组合物或状态来实现。类似地，蛋白质在除天然表达该蛋白质的生物体之外的生物体中的表达构成异源表达系统和异源蛋白质。
[0094]
术语“肿瘤相关抗原”(taa)是指，例如，细胞由癌细胞选择性表达或过度表达的表面抗原癌细胞相对于大多数正常细胞。如本文所用，术语“taa变体”和“taa突变体”指包含氨基酸序列的taa，其中一个或多个氨基酸残基相对于另一taa插入、缺失和/或取代到该氨基酸序列中序列。在各种实施方案中，待插入、缺失或取代的氨基酸残基的数目可以是例如至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少25,至少50,至少75,至少100,至少125,至少150,至少175,至少200,至少225,至少250,至少275,至少300,至少350,至少长度至少400、至少450或至少500个氨基酸。
[0095]
术语“抗肿瘤相关抗原拮抗剂抗体”(可互换地称为“抗taa抗体”)是指能够结合taa并抑制taa生物活性和/或taa信号介导的下游途径的抗体。抗taa拮抗剂抗体包括阻断、拮抗、抑制或降低(包括显著地)taa生物活性的抗体，包括由taa信号传导介导的下游途径，例如受体结合和/或引发对taa的细胞反应。出于本发明的目的，应明确理解术语“抗taa拮抗剂抗体”涵盖所有先前确定的术语、名称和功能状态和特征，由此taa 本身、taa生物活性(包括但不限于其调节头痛任何方面的能力)或生物活动的后果，在任何有意义的程度上基本上被取消、减少或中和。在一些实施方案中，抗taa拮抗剂抗体结合taa并防止taa与taa受体结合。在其他实施方案中，抗taa抗体结合taa并阻止taa受体的活化。本文提供了抗taa拮抗剂抗体的实例。
[0096]
术语“[目标]抗体”应解释为与“抗-[目标]抗体”相似，是指能够与[目标]结合的抗体。术语“靶标”或[靶标]应解释为taa或存在于细胞表面的任何分子，优选肿瘤细胞，更优选哺乳动物和人类细胞，并且可用于药物递送。优选地，与正常细胞相比，靶标在肿瘤细胞表面上特异性表达或过表达。
[0097]
术语“抗体”在本文中用于指包含一种或多种基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽并且对肿瘤抗原具有特异性或对在病理状态下过表达的分子具有特异性的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及这些基因的亚型和无数免疫球蛋白可变区基因。轻链(lc)分为kappa或lambda。重链(hc)分为gamma、mu、alpha、delta或epsilon，它们又分别用igg、igm、iga、igd和ige定义了免疫球蛋白类别。典型的免疫球蛋白(例如抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kd)和一条“重”链(约50-70kd)。每条链的n末端定义了一个可变区，其主要负责抗原识别，该可变区由大约100到110个或更多个氨基酸组成。
[0098]
在全长抗体中，每条重链由重链可变区(本文缩写为hcvr或vh)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成(在某些情况下，ch4)。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为lcvr或vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域c l组成。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。框架区和cdr的范围已经确定。不同轻链或重链的框架区序列在一个物种内相对保守，例如人类。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和对齐cdr。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg 3、igg4、iga1和iga2)或亚类。
[0099]
cdr主要负责与抗原的表位结合。每条链的cdr通常称为cdr1、cdr2、cdr3，从n端开始依次编号，也通常由特定cdr所在的链标识。因此，vh cdr3位于发现它的抗体重链可变域中，而vl cdr1是来自发现它的抗体轻链可变域的cdr1。具有不同特异性(即不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的cdr。尽管cdr因抗体而异，但cdr内只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。cdr中的这些位置称为特异性决定残基(sdr)。
[0100]
kabat定义是用于对抗体中的残基进行编号的标准并且通常用于鉴定cdr区。kabat数据库现在在线维护并且可以确定cdr序列，例如，参见imgt/v-quest程序版本：2011年3月29日的3.2.18，可在通过线上获得，以及brochet，x.等人，nucl.acids res.36，w503-508，2008)。chothia定义类似于kabat定义，但chothia定义考虑了某些结构环区域的位置。参见例如，chothia等人，j.mol.biol.，196：901-17，1986；chothia et al.,nature,342:877-83,1989。abm定义使用由oxford molecular group that model antibody structure。参见，例如，martin et al.,proc.natl.acd.sci.usa，86：9268-9272，1989；“abmtm，protein structure prediction using a combined hierarchical approach，”牛津，英国；oxford molecular,ltd.abm定义使用知识数据库和ab initio方法的组合从一级序列模拟抗体的三级结构，例如samudrala等人描述的那些，“ab initio protein structure prediction using a combined hierarchical approach”，在proteins,structure,function and genetics suppl.,3:194-198,1999中。接触定义基于对可用复杂晶体结构的分析。参见，例如，maccallum等人，j.mol.biol，5:732-45，1996。
[0101]
术语“fc区”用于定义免疫球蛋白重链的c末端区，其可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶降解产生。fc区可以是天然序列fc区或变体fc区。免疫球蛋白的fc区通常包含两个恒定结构域，一个ch2结构域和一个ch3结构域，并且任选地包含一个ch4结构域。抗体的fc部分介导几种重要的效应功能，例如细胞因子诱导、adcc、吞噬作用、补体依赖性细胞毒性
(cdc)以及抗体和抗原抗体复合物(例如，新生儿fcr(fcrn)结合在内体中酸性ph下igg的fc区，并保护igg不被降解，从而有助于延长igg的血清半衰期)。fc部分中氨基酸残基的替换以改变抗体效应器功能是本领域已知的(参见例如winter等人，美国专利号5,648,260和5,624,821)。
[0102]
抗体以完整的免疫球蛋白或许多已充分表征的片段形式存在。这样的片段包括与靶抗原结合的fab片段、fab'片段、fab2、f(ab)'2片段、单链fv蛋白(“scfv”)和二硫键稳定的fv蛋白(“dsfv”)。scfv蛋白是一种融合蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过连接子结合，而在dsfvs中，这些链已发生突变以引入二硫键以稳定结合的链条。虽然根据完整抗体的降解来定义各种抗体片段，但技术人员将理解，这些片段可以通过化学或利用重组dna方法从头合成。因此，如本文所用，术语抗体涵盖例如单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体,嵌合抗体,单链fvs(scfv),单链抗体,单结构域抗体,结构域抗体,fab片段,f(ab')2片段,表现出所需生物活性的抗体片段,二硫键连接的fvs(sdfv)、胞内抗体和任何上述的表位结合片段或抗原结合片段。
[0103]
抗体的木瓜蛋白酶降解产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，每个片段都有一个抗原结合位点。“fab片段”包含一条轻链和一条重链的ch1和可变区。fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。“fab'片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，其包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间的区域，使得可以在两个重链之间形成链间二硫键两个fab'片段链形成一个f(ab')2分子。
[0104]
抗体的胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点并且仍然能够交联抗原的f(ab')2片段。“f(ab')2片段”包含两条轻链和两条重链，两条重链在ch1和ch2结构域之间含有恒定区的一部分，从而在两条重链之间形成链间二硫键。因此，一个f(ab')2片段由两个fab'片段组成，这两个片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。
[0105]“fv区”包含来自重链和轻链的可变区但缺少恒定区。
[0106]“单链抗体”是fv分子，其中重链和轻链可变区已通过柔性连接子连接以形成单个多肽链，该多肽链形成抗原结合区。在国际专利申请公开号wo 88/01649、美国专利号4,946,778和5,260,203中详细讨论了单链抗体，其公开内容通过参考文献形式包含进来。
[0107]
如本文所用，术语“抗原结合片段”和“抗原结合蛋白”是指结合特定靶标抗原的任何蛋白。“抗原结合片段”包括但不限于抗体及其结合部分，例如免疫功能片段。抗体的示例性抗原结合片段是重链和/或轻链cdr，或重链和/或轻链可变区。
[0108]
如本文所用，术语抗体或免疫球蛋白链(重链或轻链)抗原结合蛋白的“免疫功能片段”(或简称“片段”)是一种抗原结合蛋白，其包含部分(无论该部分如何获得或合成的抗体缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸，但仍能够特异性结合抗原。此类片段具有生物活性，因为它们与靶抗原结合并且可以与包括完整抗体在内的其他抗原结合蛋白竞争结合给定表位。在一些实施方案中，片段是中和片段。在一方面，这样的片段将保留至少一个存在于全长轻链或重链中的cdr，并且在一些实施方案中将包含单个重链和/或轻链或其部分。这些生物活性片段可以通过重组dna技术产生，或者可以通过抗原结合蛋白(包括完整抗体)的酶促或化学裂解产生。具有免疫功能的免疫球蛋白片段包括但不限于fab、双抗体、fab'、f(ab')2、fv、域抗体和单链抗体，并且可以衍生自任何哺乳动物来源，包括但不限于
对人、小鼠、大鼠、骆驼或兔子。进一步预期本文公开的抗原结合蛋白的功能部分，例如，一个或多个cdr，可以与第二蛋白质或小分子共价结合，以产生针对体内特定靶标的治疗剂，具有双功能治疗特性，或具有延长的血清半衰期。
[0109]
双抗体是包含两条多肽链的二价抗体，其中每条多肽链包含通过连接子连接的vh和vl区，该连接子太短而无法在同一链上的两个区域之间配对，因此允许每个区域与另一个区域上的互补区域配对多肽链(参见，例如，holliger等人，proc.natl.acad.sci.usa，90：6444-48，1993；和poljak等人，structure，2：1121-23，1994)。如果双抗体的两条多肽链相同，则由它们配对产生的双抗体将具有两个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可用于制备具有两个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三体和四体是分别包含三个和四个多肽链并分别形成三个和四个抗原结合位点的抗体，它们可以相同或不同。
[0110]
双特异性抗体或片段可以有几种构型。例如，双特异性抗体可能类似于单一抗体(或抗体片段)，但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。在各种实施方案中，双特异性抗体可以通过化学技术产生(kranz等人，proc.natl.acad.sci.usa，78:5807,1981；通过“polydoma”技术(参见，例如，美国专利号4,474,893)；或通过重组dna技术。在各种实施方案中，本发明的双特异性抗体可以特异性结合至少两个不同的表位，其中至少一个是肿瘤相关抗原。在各种实施方案中，抗体和片段也可以是异抗体。异抗体是连接在一起两个或多个抗体，或的抗体结合片段(例如，fab)，每个抗体或片段具有不同的特异性。
[0111]
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即构成该群体的个体抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体具有高度特异性结合单一抗原。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
[0112]
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指含有来自一个物种例如人的框架残基和来自另一个物种的cdr(其通常赋予抗原结合)的抗体，例如特异性结合靶向抗原的鼠抗体。
[0113]
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有源自人的免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在cdr，特别是cdr3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的cdr序列已移植到人框架序列上的抗体。
[0114]
如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供cdr的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可具有有限数量的取自供体框架取代的氨基酸。人源化或其他单克隆抗体可以具有对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本上没有影响的额外保守氨基酸取代。在各种实施方案中，框架区选自人种系外显子xh、jh、vκ和jκ序列。例如，用于vh结构域的fr人源化的受体序列可以选自真正的vh外显子vh 1-18(matsuda et al.,nature genetics 3:88-94,1993)或vh 1-2(shin等人，embo j.10:3641-3645,1991)和对于铰链区(jh)，外显子jh-6(mattila等人，eur.j.immunol.25:2578-2582,1995)。在其他实例中，种系vκ外显子b3(cox et al.,eur.j.immunol.24:827-836,1994)和jκ外显子jκ-1(hieter et al.,j.biol.chem.257:1516-1522,1982)可以选择作为vl域人源化的受体序列。
[0115]
如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体；从重组的组合人抗体文库中分离的抗体；从对人免疫球蛋白基因而言是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体；或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他dna序列的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在各种实施方案中，对此类重组人抗体进行体外诱变(或者，当使用人ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此对重组人抗体的vh和vl区的氨基酸序列进行抗体是虽然衍生自人种系vh和vl序列并与其相关的序列，但可能不天然存在于体内人抗体种系库中。所有这些重组方式对于本领域普通技术人员来说都是众所周知的。
[0116]
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或t细胞受体或以其他方式与分子相互作用的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面组组成，例如氨基酸或碳水化合物或糖侧链，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是“线性的”或“构象的”。在线性表位中，蛋白质与相互作用分子(例如抗体)之间的所有相互作用点沿蛋白质的一级氨基酸序列线性发生。在构象表位中，相互作用点发生在蛋白质上彼此分离的氨基酸残基上。一旦确定了抗原上的所需表位，就有可能产生针对该表位的抗体，例如，使用本发明中描述的技术。或者，在发现过程中，抗体的产生和表征可以阐明有关所需表位的信息。根据该信息，可以竞争性地筛选与相同表位结合的抗体。实现此目的的一种方法是进行交叉竞争研究以发现彼此竞争性结合的抗体，例如抗体竞争结合抗原。竞争结合表位可以通过本领域技术人员已知的任何方法或技术来确定，例如但不限于放射性、biacore、elisa、流式细胞术等。如“竞争结合表位”这意味着至少20％、优选至少50％、更优选至少70％的竞争。
[0117]
如果抗原结合蛋白(包括抗体)以高结合亲和力与抗原结合，则抗原结合蛋白(包括抗体)与抗原“特异性结合”，该高结合亲和力由解离常数(kd或相应的kb，如下定义)值确定，至少为1x 10
ꢀ‑
6m，或至少1x 10
ꢀ‑
7m，或至少1x 10
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8m，或至少1x 10
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9m，或至少1x 10
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10m，或至少1x 10
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11m。特异性结合人类目标抗原的抗原结合蛋白可能也能够以相同或不同的亲和力结合来自其他物种的相同目标抗原。如本文所用，术语“kd”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
[0118]
术语“药物组合物”是指适合用于动物的药物组合物。药物组合物包含药理学有效量的活性剂和药学上可接受的载体。“药理学有效量”是指有效产生预期药理学结果的药剂的量。“药学上可接受的载体”是指任何标准的药学载体、媒介物、缓冲剂和赋形剂，例如磷酸盐缓冲盐溶液、5％葡萄糖水溶液和乳剂，例如油/水或水/油乳剂，以及各种类型的润湿剂和/或助剂。合适的药物载体和制剂描述于remington's pharmaceutical sciences，第21版。2005年，mack出版公司，easton。一种“药学上可接受的盐”是可配制成用于药用的化合物的盐，包括例如金属盐(钠、钾、镁、钙等)和氨或有机胺的盐。
[0119]
术语“治疗”、“治疗”和“治疗”是指减轻或消除生物障碍和/或至少一种其伴随症状的方法。如本文所用，“减轻”疾病、病症或病症是指降低疾病、病症或病症的症状的严重性和/或发生频率。如本文所用，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。对于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于以下任何一种或多种：减轻一种或多种症状、减轻疾病程度、预防或延迟扩散(例如，转移，例如转移)肺或淋巴结)，预防或延缓
疾病的复发，延缓或减缓疾病进展，改善疾病状态，和缓解(无论是部分的还是全部的)。“治疗”还包括减少增殖性疾病的病理后果。本发明的方法考虑了这些治疗方面的任何一个或多个方面。
[0120]
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指化合物或组合物的量足以治疗特定病症、症状或疾病例如改善、减轻、减轻和/或延迟它的一种或多种症状。关于癌症或其他不需要的细胞增殖，有效量包括足以：(一)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减缓和优选阻止癌细胞浸润到外周器官；(iv)抑制(即在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延缓肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。有效量可以是一次或多次给药。
[0121]
术语“一半最大药效浓度”(ec50)对应于在某些特定暴露时间后在基线和最大值之间诱导反应的药物、抗体或毒物的浓度。它通常用作衡量药物效力的指标。因此，分级剂量反应曲线的ec50代表观察到最大效应的50％时化合物的浓度。量子剂量反应曲线的ec50表示在指定的暴露持续时间后，50％的群体表现出反应的化合物浓度。浓度测量值通常遵循s形曲线，在浓度变化相对较小时迅速增加。这可以通过推导最佳拟合线在数学上确定。
[0122]“辅助设置”是指个体有增殖性疾病病史，特别是癌症病史，并且通常(但不一定)对治疗有反应的临床设置，包括但不限于手术(例如手术切除)、放疗和化疗。然而，由于他们的增殖性疾病(如癌症)病史，这些人被认为有患上该疾病的风险。“辅助设置”中的治疗或给药是指随后的治疗模式。风险程度(即，当个体在辅助环境中被认为是“高风险”或“低风险”时)取决于几个因素，最常见的是首次治疗时的疾病程度。
[0123]
如本文所用，指本发明的融合分子和一种或多种其他治疗剂的术语“共同给药”、“共同给药”和“联合给药”旨在表示并且确实是指和包括以下：将本发明的融合分子和治疗剂的这种组合同时给予需要治疗的个体，当这些组分一起配制成单一剂型时，该单一剂型在上述个人体内基本上同时释放所述组分；将本发明的融合分子和治疗剂的这种组合基本上同时给予需要治疗的个体，当这些组分彼此分开配制成单独的剂型时，所述个体基本上同时服用，因此所述成分基本上同时释放给所述个体；将本发明的融合分子和治疗剂的这种组合顺序给予需要治疗的个体，当这些组分彼此分开配制成单独的剂型时，所述个体连续时间服用具有显著每次给药之间的时间间隔，因此所述组分在基本上不同的时间释放给所述个体；当这些组分一起配制成单一剂型时，将本发明的融合分子和治疗剂的这种组合依次给予需要治疗的个体，该单一剂型以受控方式同时释放所述组分，在相同和/或不同时间向所述个体连续和/或重叠释放，其中每个部分可以通过相同或不同途径施用。
[0124]
术语“治疗性蛋白质”是指蛋白质、多肽、抗体、肽或其片段或变体，具有一种或多种治疗和/或生物活性。本发明涵盖的治疗性蛋白质包括但不限于蛋白质、多肽、肽、抗体和生物制品(术语肽、蛋白质和多肽在本文中可互换使用)。特别考虑到术语“治疗性蛋白质”包括本发明的融合分子。
[0125]
术语“患者”、“个体”和“受试者”可以互换使用，指哺乳动物，优选人或非人灵长类动物，但也包括驯养哺乳动物(例如，犬科动物或猫科动物)、实验室哺乳动物(例如、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠)和农业哺乳动物(例如，马、牛、猪、羊)。在各种实施方案中，患者可以是在医院、精神病护理机构的医生或其他卫生工作者的护理下的人(例如，成年男性、成年
女性、青春期男性、青春期女性、男孩、女童)，如门诊或其他临床情况。在各种实施方案中，患者可以是免疫功能低下的患者或免疫系统减弱的患者，包括但不限于患有原发性免疫缺陷、aids的患者；正在服用某些免疫抑制药物的癌症和移植患者；以及患有影响免疫系统的遗传性疾病(例如，先天性无丙种球蛋白血症、先天性iga缺乏症)的人。在各种实施方案中，患者患有免疫原性癌症，包括但不限于膀胱癌、肺癌、黑色素瘤和据报道具有高突变率的其他癌症(lawrence et al.,nature,499(7457):214
–
218，2013)。
[0126]
短语“给药”或“导致给药”是指由医疗专业人员(例如，医生)或控制患者医疗保健的人采取的行动，以控制和/或允许药剂的给药(s)/对患者有争议的化合物。导致给药可以涉及诊断和/或确定合适的治疗方案，和/或为患者开具特定药剂/化合物。这样的处方可以包括，例如，起草处方表格、注释医疗记录等。在本文描述给药的情况下，“导致给药”也被考虑在内。
[0127]“抗药性或难治性癌症”是指对先前的抗癌疗法(包括例如化学疗法、手术、放射疗法、干细胞移植和免疫疗法)没有反应的肿瘤细胞或癌症。肿瘤细胞在治疗开始时可能是耐药或难治的，或者在治疗期间它们可能变得耐药或难治。难治性肿瘤细胞包括在治疗开始时没有反应或最初在短时间内反应但对治疗没有反应的肿瘤。难治性肿瘤细胞还包括对抗癌疗法有反应但对随后的几轮疗法没有反应的肿瘤。对于本发明的目的，难治性肿瘤细胞还包括似乎被抗癌疗法治疗抑制但在停止治疗后长达五年、有时长达十年或更长时间复发的肿瘤。抗癌疗法可以使用单独的化学治疗剂、单独的放射治疗、单独的靶向治疗、单独的手术或它们的组合。为了便于描述而非限制，应理解难治性肿瘤细胞可与耐药性肿瘤互换。
[0128]
术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的细胞环境，包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓来源的炎症细胞、淋巴细胞、信号分子和细胞外基质(ecm)。肿瘤微环境中的成分可以调节肿瘤细胞的生长，例如它们的进展和转移能力。肿瘤微环境还可以受到肿瘤释放细胞外信号、促进肿瘤血管生成和诱导外周免疫耐受的影响。
[0129]
术语“增殖性疾病”包括肿瘤疾病(包括良性或癌性)和/或任何转移。增生性疾病可包括过度增生病症，例如增生、纤维化(尤其是肺纤维化，但也包括其他类型的纤维化，例如肾纤维化)、血管生成、牛皮癣、动脉粥样硬化和血管中的平滑肌增生，例如血管成形术后的狭窄或再狭窄.在一些实施方案中，增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，增殖性疾病是非癌性疾病。在一些实施方案中，增殖性疾病是良性或恶性肿瘤。
[0130]
如本文所用，术语“免疫原性”是指抗体或抗原结合片段在施用于受体时引发免疫反应(体液或细胞)的能力，包括例如人抗小鼠抗体(hama)反应.当来自受试者的t细胞对所施用的抗体产生免疫反应时，就会引发hama反应。然后t细胞募集b细胞以产生特定的“抗抗体”抗体。
[0131]
如本文所用，术语“免疫细胞”是指参与调节针对抗原(例如，自身抗原)的免疫应答的造血谱系的任何细胞。在各种实施方案中，免疫细胞是例如t细胞、b细胞、树突细胞、单核细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、朗格汉氏细胞或kuffer细胞。
[0132]“多核苷酸”是指由核苷酸单元组成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如脱氧核糖核酸(“dna”)和核糖核酸(“rna”)以及核酸类似物。核酸类似物包括那些包含非天然存在的碱基、与那些除天然存在的磷酸二酯键之外的其他核苷酸键合的核苷酸或包括通过除磷酸二酯键之外的键连接的碱基。因此，核苷酸类似物包括，但不限于，例如，硫代磷
酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、硼酸磷酸酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)等。例如，可以使用自动化dna合成仪合成这样的多核苷酸。术语“核酸”通常是指大的多核苷酸。术语“寡核苷酸”通常是指短多核苷酸，通常不超过约50个核苷酸。应当理解，当核苷酸序列由dna序列(即a、t、g、c)表示时，这也包括其中“u”取代的rna序列(即a、u、g、c)“t。”[0133]
本文使用常规符号来描述多核苷酸序列：单链多核苷酸序列的左手端是5'端；双链多核苷酸序列的左手方向称为5'方向。将核苷酸从5'到3'添加到新生rna转录物的方向称为转录方向。与mrna具有相同序列的dna链称为“编码链”；dna链上与从该dna转录的mrna具有相同序列并且位于rna转录物的5'端至5'端的序列称为“上游序列”；dna链上与rna具有相同序列并且位于编码rna转录物3'端至3'端的序列称为“下游序列”。
[0134]“互补”是指两个多核苷酸的相互作用表面的拓扑相容性或匹配在一起。因此，这两种分子可以说是互补的，而且接触面的特性是互补的。如果第一多核苷酸的核苷酸序列与和它结合配偶体的第二多核苷酸的核苷酸序列基本相同，或者如果第一多核苷酸可以在严格杂交条件下与第二多核苷酸杂交，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。
[0135]“特异性杂交”或“特异性杂交”或“选择性杂交”是指当特定核苷酸序列存在于dna或rna的复杂混合物中(例如，总细胞的)，核酸分子在严格条件下优先与特定核苷酸序列结合、双链体或杂交。。术语“严格条件”是指探针将优先与它的靶标序列杂交并且在较小程度上与或根本不与其他序列杂交的条件。核酸杂交实验如southern和northern杂交中的“严格杂交”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。有关核酸杂交的详尽指南，请参见tijssen，1993，laboratory techniques in biochemistry and molecular biology-hydridization with nucleic acid probe，第一部分，第2章，“overview of principles of hydridization and the strategy of nucleic acid probe assays”，elsevier，n.y.；sambrook等人，2001，molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,第3版，纽约；和ausubel等人，eds.，current edition，current protocols in molecular biology，greene publishing associates和wiley interscience，ny。
[0136]
通常，高度严格的杂交和洗涤条件选择为比特定序列在确定的离子强度和ph值下的热解链点(tm)低约5℃。tm是50％的靶序列与完美匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和ph下)。选择非常严格的条件以等于特定探针的tm。在southern或northern印迹中，滤膜上具有超过约100个互补残基的互补核酸杂交的严格杂交条件的一个例子是50％福尔马林与1mg肝素在42℃下进行杂交，杂交过夜.高度严格的洗涤条件的一个例子是0.15m nacl在72℃下洗涤约15分钟。严格洗涤条件的一个例子是0.2x ssc在65℃洗涤15分钟。见sambrook等人。有关ssc缓冲区的说明。高严格性洗涤之前可以进行低严格性洗涤以去除背景探针信号。用于例如多于约100个核苷酸的双链体的示例性中等严格性洗涤是在45℃下1x ssc15分钟。对于例如多于约100个核苷酸的双链体的示例性低严格性洗涤是在40℃下4-6x ssc 15分钟。一般而言，在特定杂交测定中观察到信噪比为不相关探针的信噪比的2倍(或更高)就表明检测到特异性杂交。
[0137]“引物”是指能够与指定的多核苷酸模板特异性杂交并提供合成互补多核苷酸的起始点的多核苷酸。当将多核苷酸引物置于诱导合成的条件下时，即在核苷酸、互补多核苷
酸模板和诸如dna聚合酶的聚合试剂存在下，会发生这种合成。引物通常是单链的，但也可以是双链的。引物通常是脱氧核糖核酸，但多种合成的和天然存在的引物可用于许多应用。引物与其设计杂交的模板互补，以作为起始合成的位点，但不需要反映模板的确切序列。在这种情况下，引物与模板的特异性杂交取决于杂交条件的严格程度。引物可以用例如显色、放射性或荧光部分标记并用作可检测部分。
[0138]“探针”在用于多核苷酸时是指能够与另一多核苷酸的指定序列特异性杂交的多核苷酸。探针与目标互补多核苷酸特异性杂交，但不需要反映模板的确切互补序列。在这种情况下，探针与靶标的特异性杂交取决于杂交条件的严格程度。探针可以用例如显色、放射性或荧光部分标记并用作可检测部分。在探针为互补多核苷酸的合成提供起始点的情况下，探针也可以是引物。
[0139]“连接子”是指以共价键或通过离子键、范德华键或氢键连接两个其他分子的分子，例如，在5'端与一个互补序列杂交并在3'端与另一个互补序列杂交的核酸分子，从而连接两个非互补序列。“可切割连接子”是指可以降解或以其他方式切断以分离由可切割连接子连接的两个组分的连接子。可切割连接子通常被酶切割，通常是肽酶、蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等。可切割的连接子也可以被环境因素切割，例如温度、ph、盐浓度等的变化。不可切割的连接子是在内化后通过抗体的溶酶体降解释放附着的有效载荷的连接子。
[0140]
如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指在抗体中引入另一个分子。在一个实施方案中，标记是可检测的标记，例如放射性标记的氨基酸的引入或生物素基部分与多肽的结合，可以通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白，可以通过光学或量热法检测)。在另一个实施方案中，标记或标记可以是治疗性的，例如药物偶联物或毒素。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的并且可以使用。多肽标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如3h、14c、15n、35s、90y、99tc、111in、125i、131i)，荧光标记(例如，fitc、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基团、由二级报告分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、磁性试剂(例如钆螯合物)、毒素例如百日咳毒素、紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌肽d、溴化乙锭、依米汀、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、多柔比星、柔红霉素、二羟基蒽环类二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素d、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。在一些实施例中，标签通过各种长度的间隔臂连接以减少潜在的空间位阻。
[0141]“载体”是可用于将与其连接的另一种核酸引入细胞中的多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，它指的是可以与别的核酸片段连接的线性或环状双链dna分子。另一种类型的载体是病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中可以将额外的dna片段引入病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制(例如，包含细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。“表达载体”是一种可以指导所选多核苷酸表达的载体。
[0142]“调控序列”是影响与其可操作连接的核酸的表达(例如，表达的水平、时间或位置)的核酸。例如，调节序列可以直接作用于受调节的核酸，或通过一种或多种其他分子(例
如，与调节序列和/或核酸结合的多肽)的作用。调节序列的例子包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。调节序列的其他实例描述见例如goeddel，1990，gene expression technology：methods in enzymology 185，academic press，san diego，ca和baron等人，1995，nucleic acids res.23:3605-06。如果调控序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或位置)，则核苷酸序列与调控序列“可操作地连接”。
[0143]“宿主细胞”是可用于表达本发明的多核苷酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，例如大肠杆菌，或者它可以是真核生物，例如单细胞真核生物(例如酵母或其他真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄的植物细胞)、动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤细胞。通常，宿主细胞是可以用编码多肽的核酸转化或转染的培养细胞，然后可以在宿主细胞中表达。短语“重组宿主细胞”可用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以是含有核酸但没有表达它到所需水平的细胞，除非将调节序列引入宿主细胞中以使其与核酸可操作地连接。应当理解，术语宿主细胞不仅指特定的受试细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于例如突变或环境影响而在后代中发生，所以这种后代实际上可能与母代细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。
[0144]
术语“分离的分子”(其中分子是，例如，多肽或多核苷酸)是这样的分子，由于其来源或衍生来源(1)，它不与天然相关的成分相关联状态，(2)基本上不含来自同一物种的其他分子(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)在自然界中不存在。因此，化学合成的或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中表达的分子将与其天然相关的成分“分离”。也可以使用本领域熟知的纯化技术通过分离使分子基本上不含天然有关的成分。分子纯度或同质性可以通过本领域公知的许多方法来测定。例如，多肽样品的纯度可以使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶染色以使用本领域熟知的技术显现多肽来测定。出于某些目的，可以通过使用hplc或本领域熟知的其他纯化手段来提供更高的分辨率。
[0145]
当至少约60％至75％的样品显示单一种类的多肽时，蛋白质或多肽是“基本上纯的”、“基本上同质的”或“基本上纯化的”。多肽或蛋白质可以是单体的或多聚体的。基本上纯的多肽或蛋白质通常将占蛋白质样品的约50％、60％、70％、80％或90％重量比，更通常为约95％，优选超过99％纯。蛋白质纯度或同质性可以通过本领域公知的许多方法来表征，例如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在用本领域公知的染料对凝胶染色后显现单个多肽条带。出于某些目的，可以通过使用hplc或本领域熟知的其他纯化手段来提供更高的分辨率。
[0146]
在本技术中，除非另有明确说明，否则单数的使用包括复数。在本技术中，除非另有说明，否则“或”的使用是指“和/或”。此外，术语“包括”以及诸如“包括”和“包含”的其他形式的使用不是限制性的。此外，诸如“元件”或“组分”之类的术语包括包括一个单元的元件和组分以及包括多于一个亚单元的元件和组分，除非另有明确说明。
[0147]
本文提及“大约”一个值或参数包括(并描述)针对该值或参数本身的变化。例如，提及“关于x”的描述包括“x”的描述。
[0148]
如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“a”，“或者，”和“the”包括复数指称，除非上下文另有明确规定。应当理解，本文描述的本发明的方面和变体包括“由
……
组成”和/或“基本上由
……
组成”的方面和变体。
抗体药物偶联物
[0149]
在一个方面，本发明涉及下式(xi)的adc：ab-(l-d)n(xi)或其药学上可接受的盐，其中ab是抗体或抗原结合抗体片段；l是连接子；和d是药物部分。
[0150]
在一些实施方案中，adc包含抗体。在一些实施方案中，抗体是抗trop-2抗体。在一些实施方案中，抗体包含具有三个互补区的重链可变结构域，所述互补区由hcdr1(seq id no:6)，hcdr2(seq id no:7)，和hcdr3(seq id no:8)组成，以及轻链可变区。亲链可变区含有三个互补区，由lcdr1(seq id no:3)，lcdr2(seq id no:4)，和lcdr3(seq id no:5)组成。
[0151]
在一些实施方案中，adc包含二价连接子。在一些实施方案中，二价连接子是由下式表示的l其中*表示与药物部分(例如美登素或美登素类似物)的连接点，**表示与抗体(例如抗trop-2抗体)的连接点。在一些实施例中，y选自：其中m为0-8，而n＝2-12。
[0152]
在一些实施方案中，adc包含由下式*-c(＝o)r-y
”‑
**表示的二价连接子l2，其中*表示与药物部分(例如，美登素或美罗登类似物)的连接点，**表示与抗体(例如抗trop-2抗体)的连接点，r是3-7元杂环基、芳基或环状烷基环。在一些实施方案中，l2选自：
其中m＝0-3；而n＝2-12。
[0153]
在一些实施方案中，adc包含抗trop-2抗体和二价连接子。在一些实施方案中，抗tro-2抗体包含具有三个互补区的重链可变结构域，所述互补区由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:8)组成，以及具有三个互补区的轻链可变结构域，这些互补区由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成。在一些实施方案中，二价连接子由式代表l或式*-c(＝o)ry
”‑
**代表l2，其中*表示与美登醇或美登醇类似物的连接点，**表示与抗trop-2抗体的连接点，y选自：选自：其中m为0-8，n＝2-12；l2选自：
其中m＝0-3；而n＝2-12。
[0154]
在一些实施方案中，adc包含抗trop-2抗体、二价连接子和美登醇或美登醇类似物；其中抗tro-2抗体包含具有三个互补区的重链可变结构域，所述互补区由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:8)组成，和轻链可变结构域，具有三个互补区，由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成；二价连接子由式代表l或式*-c(＝o)ry
”‑
**代表l2，其中*表示与美登醇或美登醇类似物的连接点，**表示与抗trop-2抗体的连接点，y选自：其中m为0-8，而n＝2-12；l2选自：
其中m＝0-3；而n＝2-12。
[0155]
药物部分共价连接的抗trop2抗体或其抗原结合片段，其中药物部分和二价连接子具有以下结构：其中抗trop2抗体包含具有由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:8)组成的三个互补区的重链可变结构域，和轻链可变结构域。轻链可变结构域具有三个互补区，由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成。
[0156]
在一些实施方案中，提供了抗体药物偶联物，其包含通过二价连接子与药物部分共价连接的抗trop2抗体或其抗原结合片段，其中药物部分和二价连接子具有以下结构：
其中抗trop2抗体包含具有由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:8)组成的三个互补区的重链可变结构域，和轻链可变结构域。轻链可变结构域具有三个互补区，由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成。
[0157]
药物部分共价连接的抗trop2抗体或其抗原结合片段，其中药物部分和二价连接子具有以下结构：其中抗trop2抗体包含具有由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:8)组成的三个互补区的重链可变结构域，和轻链可变结构域。轻链可变结构域具有三个互补区，由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成。
[0158]
在一些实施方案中，提供了抗体药物偶联物，其包含通过二价连接子与药物部分共价连接的抗trop2抗体或其抗原结合片段，其中药物部分和二价连接子具有以下结构：
其中抗trop2抗体包含具有由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:8)组成的三个互补区的重链可变结构域，和轻链可变结构域。轻链可变结构域具有三个互补区，由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成。
[0159]
药物部分共价连接的抗trop2抗体或其抗原结合片段，其中药物部分和二价连接子具有以下结构：其中抗trop2抗体包含具有由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:8)组成的三个互补区的重链可变结构域，和轻链可变结构域。轻链可变结构域具有三个互补区，由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成。
[0160]
在一些实施方案中，提供了抗体药物偶联物，其包含通过二价连接子与药物部分共价连接的抗trop2抗体或其抗原结合片段，其中所述药物部分和二价连接子具有以下结构，
其中抗trop2抗体包含具有由hcdr1(seq id no:6)、hcdr2(seq id no:7)和hcdr3(seq id no:8)组成的三个互补区的重链可变结构域，和轻链可变结构域。轻链可变结构域具有三个互补区，由lcdr1(seq id no:3)、lcdr2(seq id no:4)和lcdr3(seq id no:5)组成。
[0161]
根据本文所述的一些方法，adc或adc衍生物被靶向肿瘤细胞或被活化的免疫细胞内化，其中adc或adc衍生物对抗原表达细胞发挥细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制作用以治疗或防止表达抗原的癌症或免疫疾病的复发。在某些实施方案中，adc或adc衍生物未被内化，并且抗靶标抗体通过与细胞膜结合而有效地消耗或抑制靶抗原表达细胞。在某些实施方案中，adc或其adc衍生物可以靶向细胞中的生物分子(例如，炎症剂)并在分泌或结合生物分子的细胞处或附近积聚，从而让治疗药物部分发挥作用(例如、细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制作用)。
[0162]
重要的是，本发明的adc具有优异的药物/抗体比(dar)，表现出改善的溶解度、增强的cmc特性和增加的针对高抗原表达肿瘤细胞的治疗功效，同时对低抗原表达细胞或无抗原表达细胞即正常细胞的影响较小.此外，adc提供了能针对更广泛的患者群体和患有难治性癌症或先前对抗癌治疗有反应但在停止治疗后复发(以下称为“复发性癌症”)的患者。
[0163]
在另一个方面，本发明涉及包含药物部分(例如美登醇或美登醇类似物)和二价连接子的化合物。在一些实施方案中，所述化合物是式(ii)mayo-l'的化合物，或式(vi)mayo-l2'的化合物，其中mayo是美登醇或美登醇类似物，l'和l2'是二价连接子。在一些实施方案中，二价连接子包含可连接至抗体或其抗原结合片段的官能团。在一些实施方案中，l'是二价连接子，其包含由表示的n-甲基丙氨酸部分。在一些实施例中，y'选自：
其中m为0至8；n为2到12。
[0164]
在一些实施方案中，l2'是式*-c(＝o)r-y”表示的二价连接子，其中*表示与药物部分(例如，美登醇或美登醇类似物)的连接点，r是3-7元杂环基、芳基或环状烷基环；y”包含可以连接于抗体(例如，细胞结合抗体)的官能团。在一些实施方案中，二价连接子l2'选自：其中m＝0-3；而n＝2-12。
[0165]
在一些实施方案中，包含药物部分和二价连接子的化合物选自：
[0166]
本发明还提供了按照本文描述任一种的合成方法制备化合物bi-p204、bi-p203、bi-p205、bi-p206、bi-p207、bi-p208、bi-p209、bi-p210和bi-p211的方法。
[0167]
另一方面，本发明涉及制备抗体药物偶联物(adc)的方法。在一些实施方案中，该方法包括使化合物与抗体反应，从而获得抗体药物偶联物，其中该化合物包含药物部分和二价连接子。在一些实施方案中，化合物选自化合物bi-p204、bi-p203、bi-p205、bi-p205、bi-p206、bi-p207、bi-p208、bi-p209、bi-p210和bi-p211。靶抗原和示例性抗体
[0168]
细胞膜上表达的肿瘤抗原是免疫治疗的潜在靶点，理想的肿瘤抗原在正常细胞上不存在，而在肿瘤细胞表面过度表达。本发明方法中使用的adc可以包含对本领域描述的任何肿瘤相关抗原特异的抗体或抗原结合抗体片段，包括本领域中描述的任何肿瘤相关抗原的任何生物仿制药、生物仿制药、后续生物制品或后续蛋白质形式。肿瘤相关抗原可以是技术人员希望针对其诱导免疫反应的任何肽、多肽、蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物或有机小分子，或它们的任何组合。
[0169]
在各种实施方案中，考虑用于本发明的组合方法的肿瘤相关抗原、肿瘤相关抗原变体或肿瘤相关抗原突变体选自或来源于表1中提供的列表。表1
[0170]
在各种实施方案中，肿瘤相关抗原具有观察到的百分比同源性的氨基酸序列，例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少约99％与表1中公开的任何一种序列。
[0171]
滋养层细胞表面抗原2(trop-2)，也称为肿瘤相关钙信号转导子2(tacstd1)、膜成分1号染色体表面标志物1(m1s1)、胃肠道抗原733-1(ga733-1)，以及上皮糖蛋白-1(egp-1)，属于tacstd家族，包括至少两种i型膜蛋白。它转导细胞内钙信号并充当细胞表面受体。它含有323个氨基酸，由一个大的胞外结构域、一个单一的跨膜结构域和一个短的胞质尾组成。如本文所用，术语“trop-2”包括人trop-2(htrop-2)、htrop-2的变体、同种型和物种同源物，以及具有至少一个与htrop-2共同表位的类似物。在各种实施方案中，如本文所用的htrop-2多肽可包含ncbi参考序列：np_002344.2中列出的氨基酸序列
[0172]
尽管它最初是作为滋养层细胞的细胞表面标志物被发现的，但随后的报道显示trop-2在有限的正常组织中也以低水平表达，例如鼻、乳房、皮肤和支气管上皮细胞。进一步的研究表明，trop-2在许多不同的癌症类型中过表达，包括口腔癌、头颈癌、甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌和神经胶质
瘤。升高的表达与癌症患者的疾病进展和不良预后有关。trop-2在癌细胞中的过表达已在体外和体内显示刺激肿瘤生长。类似地，已显示通过sirna抑制trop-2表达可抑制肿瘤细胞增殖。除了对肿瘤生长至关重要外，trop-2还参与转移。这里至少有六种主要的信号通路涉及trop-2，包括igf、erbb3、erk、mapk、notch-wnt和raf通路。然而，它在这些途径中的确切作用，以及哪些下游途径在不同的癌症和不同的治疗方法中至关重要，仍有待阐明。
[0173]
基于其在肿瘤与正常组织中的差异表达、其在促进肿瘤生长和转移中的作用以及负预后价值，trop-2已被提议作为一种有前途的诊断/治疗靶点。阻断trop-2信号可能是治疗癌症的一种手段。已显示trop-2靶向抗原结合片段(fab)可诱导细胞凋亡并对乳腺癌细胞增殖具有抑制作用。尽管已经开发了几种抗trop-2抗体，但没有一种适合作为裸抗体进行治疗。最近开发了trop-2靶向抗体-药物偶联物(adc)。sacituzumab govitecan(immu-132)是人源化抗trop-2抗体hrs7与sn-38(伊立替康的活性代谢物)的偶联物。它已在许多临床前研究中开发和测试，能够抑制多种肿瘤的生长。它还在非小细胞肺癌、小细胞肺癌、转移性三阴性乳腺癌和胰腺癌患者的早期临床试验中显示出令人鼓舞的疗效。尽管这种抗trop-2-adc表现出一些临床效果，但仍然需要使用抗trop-2抗体来治疗癌症和其他与trop-2活性相关的疾病的改进的治疗剂。在各种实施例中，肿瘤相关抗原是trop-2。
[0174]
产生与本文所述的肿瘤相关抗原结合的抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，产生特异性结合靶向抗原多肽的单克隆抗体的方法可以包括向小鼠施用一定量的包含靶向抗原多肽的免疫原性组合物以有效刺激可检测的免疫反应，获得来自小鼠产生抗体的细胞(例如,来自脾脏的细胞)并将产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以获得产生抗体的杂交瘤，并测试产生抗体的杂交瘤以鉴定产生与靶向抗原多肽特异性结合的单克隆抗体的杂交瘤.一旦获得，杂交瘤可以在细胞培养物中增殖，也可以选择在杂交瘤衍生细胞产生与靶向抗原多肽特异性结合的单克隆抗体的培养条件下增殖。可以从细胞培养物中纯化单克隆抗体。然后有多种不同的技术可用于测试抗原/抗体相互作用以发现特别理想的抗体。
[0175]
可以使用产生或分离具有所需特异性的抗体的其他合适的方法，包括例如从抗体库中选择重组抗体的方法，或者依赖于能够产生人类全部抗体库的转基因动物(例如小鼠)的免疫的方法抗体。参见例如，jakobovits等人，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.),90:2551-2555,1993；jakobovits等人，nature，362：255-258，1993；lonberg等人，美国专利号5,545,806；和surani等人，美国专利号5,545,807。
[0176]
可以通过多种方式设计抗体。它们可以制成单链抗体(包括小型模块化免疫药物或smipstm)、fab和f(ab')2片段等。抗体可以是人源化的、嵌合的、去免疫的或完全人源的。许多出版物阐述了许多类型的抗体和改造这些抗体的方法。例如，参见美国专利号6,355,245；6,180,370；5,693,762；6,407,213；6,548,640；5,565,332；5,225,539；6,103,889；和5,260,203。
[0177]
嵌合抗体可以通过本领域已知的重组dna技术产生。例如，用限制性内切酶降解编码鼠(或其他物种)单克隆抗体分子的fc恒定区的基因以去除编码鼠fc的区域，并且替换编码人fc恒定区的基因的等效部分(参见robinson等人，国际专利公开pct/us86/02269；akira等人，欧洲专利申请184,187；taniguchi,m.，欧洲专利申请171,496；morrison等人，欧洲专利申请173,494；neuberger等人.，国际申请wo86/01533；cabilly等人，美国专利号4,816,567；cabilly等人，欧洲专利申请125,023；better等人，science,240:1041-1043,
1988；liu等人，proc.natl.acad.sci.(usa),84:3439-3443,1987；liu et al.,j.immunol.,139:3521-3526,1987；sun et al.,proc.natl.acad.sci.(usa),84:214-218,1987；nishimura等人,canc.res.,47:999-1005,1987；wood等人,nature,314:446-449,1985；和shaw等人.,j.natl cancer inst.,80:1553-1559,1988)。
[0178]
本领域已经描述了用于人源化抗体的方法。在一些实施方案中，人源化抗体除了非人cdr之外还具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。人源化基本上可以按照winter和同事的方法进行(jones等人，nature，321：522-525，1986；riechmann等人，nature，332：323-327，1988；verhoeyen等人，science,239:1534-1536,1988)，通过用高变区序列代替人抗体的相应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变区已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基和可能的一些框架区残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
[0179]
queen等人的美国专利号5,693,761公开了对winter等人的人源化抗体改进。并且基于将亲合力损失归因于人源化框架中的结构基序问题的前提，由于空间或其他化学不相容性，这些问题会干扰cdr折叠成在小鼠抗体上发现有结合能力构象。为了解决这个问题，queen教导使用在线性肽序列中与待人源化的小鼠抗体的框架序列密切同源的人框架序列。因此，queen的方法侧重于比较物种之间的框架序列。通常，将所有可用的人可变区序列与特定的小鼠序列进行比较，并计算相应框架残基之间的一致性百分比。选择具有最高百分比的人可变区为人源化项目提供框架序列。queen还教导在人源化框架中保留来自小鼠框架的某些氨基酸残基对于支持具有结合能力的构象的cdr至关重要。从分子模型评估潜在的关键性。用于保留的候选残基通常是那些在线性序列中与cdr相邻的残基或空间上在任何cdr残基范围内的残基。
[0180]
像riechmann等，1988所述，一旦得到低亲和力的人源化抗体构建，通过将单个氨基酸残基转换成鼠抗序列上的氨基酸残基并测试抗体亲和力的实验可以确定特定框架氨基酸残基的重要性。另一个示例方法carter等人的美国专利号5,821,337和adair等人的美国专利号5,859,205公开了用于鉴定构架序列中重要氨基酸的方法。这些参考文献公开了框架中特定的kabat残基位置，在人源化抗体中，可能需要用相应的小鼠氨基酸取代以保持亲和力。
[0181]
另一种人源化抗体的方法，称为“框架改组”，依赖于生成一个组合抗体库，其中非人cdr可变区在框架内融合到单个人种系框架池中(dall'acqua等人，methods，36:43，2005)。然后筛选抗体库以鉴定编码保留良好结合的人源化抗体的克隆。
[0182]
选择用于制备人源化抗体的人可变区(轻的和重的)对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，将啮齿动物抗体的可变区序列与已知人类可变域序列的整个抗体库进行筛选。然后接受与啮齿动物序列最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(框架区)(sims等人，j.immunol.，151:2296,1993；chothia等人，j.mol.biol.,196:901,1987)。另一种方法使用源自特定轻链或重链可变区亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架区。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(carter et al.,proc.natl.acad.sci.(usa),89:4285,1992；presta et al.,j.immunol.,151:2623,1993)。
[0183]
替代人可变区的非人残基的选择可能受到多种因素的影响。这些因素包括，例如，
特定位置的氨基酸稀有性、与cdr或抗原相互作用的可能性，以及参与轻链和重链可变域界面之间相互作用的可能性。(参见，例如，美国专利号5,693,761、6,632,927和6,639,055)。分析这些因素的一种方法是使用非人类和人源化序列的三维模型。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序可用于说明和显示选定候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。检查这些展示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择非人残基并用人可变区残基替代以实现所需的抗体特性，例如增加对靶抗原的亲和力。
[0184]
本领域已经描述了制备完全人抗体的方法。例如，生产肿瘤相关抗原抗体或其抗原结合片段的方法包括以下步骤：在噬菌体上合成人抗体库，用肿瘤相关抗原或其抗体结合部分筛选抗体库，分离结合肿瘤相关抗原的噬菌体，并从噬菌体中获得抗体。作为另一个例子，制备用于噬菌体展示技术的抗体库的一种方法包括以下步骤：用肿瘤相关抗原或其抗原部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人动物以产生免疫反应，从免疫动物产生抗体的细胞中提取抗体；从提取的细胞中分离编码本发明抗体的重链和轻链的rna，逆转录rna以产生cdna，使用引物扩增cdna，并将cdna插入噬菌体展示载体，使得抗体在噬菌体上表达。可以这种方式获得本发明的重组抗肿瘤相关抗原抗体。
[0185]
同样，举例来说，本发明的重组人抗肿瘤相关抗原抗体也可以通过筛选重组组合抗体库来分离。优选地，抗体库是scfv噬菌体展示抗体库，使用人vl和vh生成从b细胞中分离的mrna制备的cdna。制备和筛选此类抗体库的方法是本领域已知的。用于生成噬菌体展示抗体库的试剂盒是可商购的(例如，pharmacia recombinant phage antibody system，目录号27-9400-01；和stratagene surfzaptm噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。还有其他方法和试剂可用于生成和筛选抗体展示库(参见，例如，美国专利号5,223,409；pct公开号wo 92/18619、wo 91/17271、wo 92/20791、wo 92/15679、wo 93/01288、wo 92/01047、wo 92/09690；fuchs等人，bio/technology，9：1370-1372(1991)；hay等人，hum.antibod.hybridomas，3：81-85，1992；huse等人，science，246：1275-1281，1989；mccafferty等人，nature，348：552-554，1990；griffiths等人，embo j.，12：725-734,1993；hawkins等人,j.mol.biol.,226:889-896,1992；clackson等人,nature,352:624-628,1991；gram等人,proc.natl.acad.sci.(usa),89:3576-3580,1992；garrad et al.,bio/technology,9:1373-1377,1991；hoogenboom et al.,nuc.acid res.,19:4133-4137,1991；和barbas等人，proc.natl.acad.sci.(usa),88:7978-7982,1991)，均以引用的方式并入本文。
[0186]
人抗体也通过用人ige抗原免疫非人转基因动物在其基因组中包含一些或所有人免疫球蛋白重链和轻链基因座来产生，例如xenomousetm动物(abgenix,inc./amgen,inc.-加利福尼亚州弗里蒙特)。xenomousetm小鼠是经过改造的小鼠品种，包含人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大片段，并且缺乏小鼠抗体产生。参见，例如，green等人，nature genetics，7：13-21，1994和美国专利号5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963和6,150,584。xenomousetm小鼠可产生类似成人的完整人类抗体库，并产生抗原特异性人类抗体。在一些实施方案中，通过在酵母人工染色体(yac)中引入人重链基因座和κ轻链基因座的兆碱基大小的种系构型片段，
4406)和d2/b(wo 2009/130575)每个引用的专利或申请的文本通过引用并入本文。
[0191]
在各种实施方案中，本发明的adc包括至少一种结合trop-2的抗体或其片段。在各种实施方案中，抗trop-2抗体是包含seq id no：1的轻链序列和seq id no：2的重链序列的人源化抗体。在各种实施方案中，抗trop-2抗体是包含轻链cdr序列cdr1(seq id no:3)的人源化抗体；cdr2(seq id no:4)；和cdr3(seq id no:5)和重链cdr序列cdr1(seq id no:6)；cdr2(seq id no:7)和cdr3(seq id no:8)。
[0192]
在另一个方面，本发明的特征在于包含本发明的抗trop-2抗体或其抗原结合片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合片段可以衍生或连接至另一种功能分子，例如另一种肽或蛋白质(例如，另一种抗体或受体的配体)以产生结合至少两个不同的结合位点或靶分子。本发明的抗体实际上可以衍生或连接到多于一种的其他功能性分子以产生结合多于两个不同结合位点和/或靶分子的多特异性分子；这样的多特异性分子也意在被本文所用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可以功能性连接(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)到一个或多个其他结合分子，例如另一种抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，从而产生双特异性分子。在各种实施方案中，本发明包括能够结合表达fcγr或fcαr的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(pmn))和表达trop-2的靶细胞的双特异性分子。在此类实施方案中，双特异性分子将trop-2表达细胞靶向效应细胞并触发fc受体介导的效应细胞活性，例如trop-2表达细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、细胞因子释放、或产生超氧阴离子。制备本发明的双特异性分子的方法是本领域众所周知的。
[0193]
在各种实施方案中，与抗trop-2抗体连接的另一种功能性分子，例如受体的另一种抗体或配体，可以选自：针对信号分子的激动性、拮抗性或阻断性抗体，例如如her-2、her-3、egfr、igf-r、c-met、epha2、ephb2和muc16；对共刺激或共抑制分子(免疫检查点)如pd-1、pd-l1、ox-40、cs137、gitr、lag3、tim-3和vista的激动、拮抗或阻断抗体；在t细胞上发现的cd3。
[0194]
双特异性抗体或片段可以有几种构型。例如，双特异性抗体可能类似于单一抗体(或抗体片段)，但具有两个不同的抗原结合位点(可变区)。在各种实施方案中，抗体可以通过化学技术生产(kranz等人，proc.natl.acad.sci.usa，78:5807,1981；通过“polydoma”技术(参见，例如，美国专利号4,474,893)；或通过组合基因技术。在各种实施方式中，本公开的双特异性抗体可以具有针对至少两种不同表位的结合特异性，其中至少一种是肿瘤相关抗原。在各种实施方式中，抗体和片段也可以是异抗体。异抗体是两种或更多的抗体，或抗体结合片段(例如，fab)连接在一起，每个抗体或片段具有不同的特异性。抗体与抗原结合的表征
[0195]
可以通过例如标准elisa测试本发明的抗体与靶抗原的结合。例如，微量滴定板用pbs中的纯化靶抗原包被，然后用pbs中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体稀释液(例如，来自靶抗原免疫小鼠的血浆稀释液)添加到每个孔中并在37℃温育1-2小时。将板用pbs/tween洗涤，然后与与碱性磷酸酶偶联的第二试剂(例如，对于人抗体，山羊抗人igg fc特异性多克隆试剂)在37℃孵育1小时。洗涤后，将板用pnpp底物(1mg/ml)显色并在405-650的od下进行分析。优选地，产生最高滴度的小鼠将用于融合。elisa测定也可用于筛选与靶抗原免疫原呈阳性反应的杂交瘤。以高亲和力结合靶抗原的杂交瘤被亚克隆并进一步表征。每个杂
交瘤的一个克隆保留了母细胞的反应性(通过elisa)，可以选择用于制备5-10瓶细胞库，储存在-140℃，并用于抗体纯化。
[0196]
为了确定所选的抗靶抗原单克隆抗体是否与特定的表位结合，可以使用市售试剂(pierce，rockford，il)对每种抗体进行生物素标记。未标记的单克隆抗体和生物素标记的单克隆抗体的竞争研究可以使用如上所述的靶抗原包被的elisa板进行。结合的生物素标记的mab可以用链霉亲和素碱性磷酸酶探针检测。为了确定纯化抗体的同种型，可以使用对特定同种型抗体特异的试剂进行同种型elisa。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以在4℃下用1μg/ml的抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％ bsa封闭后，将板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应1到2小时。然后孔可以与人igg1或人igm特异性碱性磷酸酶偶联探针反应。如上所述对板进行显影和分析。
[0197]
可以通过蛋白质印迹进一步测试抗靶抗原人igg与靶抗原的反应性。简而言之，可以制备靶抗原并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胚胎牛血清封闭，并用待测的单克隆抗体进行探测。结合了的人igg可以使用抗人igg碱性磷酸酶检测，并使用bcip/nbt底物片剂(sigma chem.co.,st.louis,mo)显色。
[0198]
人igg与其抗原的结合亲和力可以通过基于生物层干涉(bli)技术的octet系统确定。bli是附着在光纤尖端的一层分子，它在检测器处产生干涉图案，结合的分子数量的任何变化都会导致图案发生可测量的偏移。octet系统可以实时分析96孔微孔板中生物分子相互作用的亲和力和动力学。简而言之，可以将目标抗原稀释并加载到96孔微孔板中。然后将抗体稀释并添加到指定的孔中。将板放入octet系统并开始测定。可以使用octet data acquisition software(fortebio data analysis 10.0)分析数据以计算结合速率常数kon、解离速率常数koff和解离常数kd(kd＝koff/kon)。
[0199]
人igg与其在细胞表面表达的抗原的结合可以通过流式细胞术进行测试。简而言之，可以将抗体添加到facs缓冲液中的细胞中，并在4o c下孵育30分钟。孵育后，洗涤细胞以去除未结合的抗体。然后将细胞解离并在冰上用荧光偶联的二抗染色30分钟，然后使用贝克曼流式细胞术系统进行分析。荧光强度和细胞结合百分比可以通过贝克曼流式细胞仪软件进行分析。药物部分
[0200]
在本发明的adc中，任何对癌细胞或激活的免疫细胞发挥治疗作用的药剂都可以用作与抗靶抗原抗体偶联的弹头。有用的细胞毒剂或免疫抑制剂类别包括，例如，抗微管蛋白剂(例如，auristatins和maytansinoids)、dna小沟结合剂、dna复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和-卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化疗增敏剂、多卡霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、来西托普辛、亚硝基脲、铂醇、预形成化合物、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷类、拓扑异构酶抑制剂、rna聚合酶抑制剂(例如，鹅膏菌毒素如α-鹅膏菌素)、激酶抑制剂、长春花生物碱、寡核苷酸等。
[0201]
个别细胞毒剂或免疫抑制剂包括例如雄激素、蒽霉素(amc)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜亚胺、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(bsnu)、cc-1065、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷、细胞松弛素b、达卡巴
嗪、放线菌素(原放线菌素)、柔红霉素、地卡巴肼、多西他赛、多柔比星、雌激素5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽d、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(ccnu)、甲氯乙胺、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素c、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普立霉素、丙卡比嗪、链霉素、替诺泊苷、6-硫鸟嘌呤、硫代特帕、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、vp-16和vm-26。
[0202]
在各种实施方案中，治疗药物部分是细胞毒剂。合适的细胞毒剂包括，例如，多拉他汀类(例如，奥瑞他汀e、afp、mmaf、mmae)、dna小沟结合剂(例如，enediynes和lexitropsins)、多卡霉素、紫杉烷类(例如，紫杉醇和多西他赛)、嘌呤霉素、长春花生物碱、cc-1065,sn-38,拓扑替康,吗啉代-多柔比星,rhizoxin,cyanomorpholino-doxorubicin,棘霉素,考布他汀,netropsin,埃坡霉素a和b,雌莫司汀,隐藻素,西马多丁,美登素,discodermolide,eleutherobin,α-鹅膏菌素,和mitoxantrone。在各种实施方案中，细胞毒剂是常规化疗剂，例如多柔比星、紫杉醇、美法仑、长春花生物碱、甲氨蝶呤、丝裂霉素c或依托泊苷。此外，强效剂如cc-1065类似物、加利车霉素、美登素、多拉司他丁10类似物、根瘤菌素和海藻毒素可用于本发明的adc。
[0203]
美登素类似物emtansine(也称为mertansine，dm1)是美登素的化学衍生物。dm1与微管末端结合，从而抑制微管的生长和缩短，进而抑制微管动力学。具体而言，dm1显示出与每个微管约37个位点的高亲和力结合(k d,0.1μmol/l)。dm1与微管上的高亲和力位点的结合强度也比长春碱强20倍。基于dm1的adc
–
kadcyla(曲妥珠单抗emtansine(t-dm1)由曲妥珠单抗(一种抗her2/neu单克隆抗体)通过不可切割的smcc连接子与dm1偶联配制而成。2013年获fda批准用于治疗her2阳性乳腺癌。
[0204]
在各种实施方案中，药物部分是具有通式(xii)的dm1：
[0205]
本发明的adc包含药物部分和抗靶抗原抗体或其衍生物之间的连接子区。在本发明中，“连接子”、“连接子单元”、“l”、“l2”或“连接”是指包含将抗体与至少一种药物共价连接的共价键或原子链的化学部分.连接子可以是“不可切割的”或“可切割的”。
[0206]
连接子可以使用多种双功能蛋白修饰剂制成，例如n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(spdp)、琥珀酰亚胺基-4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(smcc)、亚氨基硫醇(it)，亚胺酯的双功能衍生物(如己二酸二甲酯)hcl)，活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸)、醛类(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双炔烃化合物、双重氮衍生物(如双-(对叠氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯2,6-二异氰
酸酯)、双马来酰亚胺化合物和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。碳14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)是用于将细胞毒剂与寻址系统结合的示例性螯合剂。其他交联剂试剂可以是bmps、emcs、gmbs、hbvs、lc-smcc、mbs、mpbh、sbap、sia、siab、smcc、smpb、smph、磺基-emcs、磺基-gmbs、磺基-kmus、磺基-mbs、磺基-siab、磺基-smcc和磺基-smpb和svsb(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)，它们是市售的(例如，来自美国伊利诺伊州罗克福德的pierce biotechnology,inc.)。
[0207]
在各种实施方案中，adc包含促进药物部分在细胞中释放的“可切割连接子”。例如，可以使用酸不稳定连接子、肽酶敏感连接子、光不稳定连接子或含二硫键的连接子，从而在细胞内环境中切割连接子导致药物部分从抗体上释放。在各种实施方案中，连接子是被细胞内肽酶或蛋白酶切割的肽基连接子，包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶。裂解剂可以包括组织蛋白酶b和d以及纤溶酶，已知所有这些都会水解二肽药物衍生物，从而在靶细胞内释放活性药物。在各种实施方案中，可以使用可被在癌组织中高度表达的巯基依赖性蛋白酶组织蛋白酶-b切割的肽基连接子(例如，包含或为phe-leu或gly-phe-leu-gly的连接子(seq id no:9))。在各种实施方案中，可被细胞内蛋白酶切割的肽基连接子包含或者是val-cit或phe-lys。在各种实施方案中，可切割连接子是ph敏感的，即在某些ph值下对水解敏感。通常，ph敏感连接子在酸性条件下是可水解的。例如，可以使用在溶酶体中可水解的酸不稳定连接子(例如，腙、氨基脲、氨基硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、缩醛、缩酮等)。此类连接子在中性ph条件下(例如血液中的连接子)相对稳定，但在低于ph 5.5或5.0(溶酶体的近似ph)下不稳定。在某些实施方案中，可水解连接子是硫醚连接子(例如，通过酰基腙键与药物连接的硫醚)。在各种实施方案中，连接子在还原条件下是可切割的(例如，二硫键连接子)。多种二硫键连接子是本领域已知的，包括例如可以使用sata(n-琥珀酰亚胺基-s-乙酰硫代乙酸酯)、spdp(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、spdb形成的那些(n-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)和smpt(n-琥珀酰亚胺基-氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)。
[0208]
在各种实施方案中，连接子单元具有以下通式(xiii)：-l1 l2a a'l3-c(＝o)-(xiii)
[0209]
抗体连接到l1的末端而抗肿瘤毒素连接到-l3的-c(＝o)-部分。
[0210]
l1代表-(琥珀酰亚胺-3-基-n)-(ch2)n1-c(＝o)-。
“‑
(琥珀酰亚胺-3-基-n)”具有以下结构：上述结构的位置3是与抗体的连接位置。在位置3与抗体通过硫醚键结合。上述结构1位的氮原子与包括该结构的连接子的亚甲基的碳原子相连。
[0211]
l2a表示-nh-(ch2-ch2-o)n2-ch2-。a'代表1,2,3-三氮唑。l3代表-(ch2)n3-，n＝2-5，或-(ch2)2-o-(ch2)n4-，n＝2，m＝1-2。
[0212]
美登醇与n-甲基-n-(6-叠氮基-l3-c(＝o)-l-丙氨酸反应生成叠氮基-l3-c(＝
o)-d。l-d是通过叠氮基的-l3-c(＝o)-d与l1 l2a-炔烃的点击反应制备的。
[0213]
将药物与蛋白质，特别是与抗体偶联的技术是有很多报道的。(参见，例如，arnon etal，“monoclonal antibodies for immunotargeting of drugs in cancer therapy”，monoclonal antibodies and cancer therapy(reisfeld etal eds，alan r.liss，inc.，1985)；hellstrom etal,“antibodies for drug delivery”in controlled drug delivery(robinson et al.eds.,marcel dekker,inc.,第2版1987)；thorpe，biological and clinical applications(pinchera et al.eds.,1985)；"analysis,results,and future prospective of the therapeutic use of radiolabeled antibody in cancer therapy,"in monoclonal antibodies for cancer detection and therapy(baldwin et al.eds.,academic press,1985)；and thorpe et al.,1982,immunol.rev.62:119-58.也参见，例如，pct专利wo 89/12624。
[0214]
adc中的连接子可能对生物活性产生重大影响。例如，体内研究表明，短肽连接的偶联物诱导已建立的异种移植肿瘤的消退和治愈，治疗指数高达60倍。这些偶联物说明了连接子技术、药物活性和偶联方法在开发安全有效的用于癌症治疗的adc中的重要性。
[0215]
本发明的一些实施方案涉及通过不可切割的连接子与抗体连接的dm1。在此示例中，通过将抗体加到溶解于ph调节后的pbs edta缓冲液中的tcep(三(2-羧乙基)膦)溶液中来还原抗体。将抗体/tcep溶液在37o c下孵育2-3小时。将还原的抗体进行缓冲液交换到用于偶联反应的缓冲液中。将溶解在dmso中的bi-p203有效载荷以7-30:1的有效载荷/抗体比率添加到还原的单克隆抗体溶液中，制备到具有不同药物与抗体比率(dar)的adc。有效载荷/抗体溶液在20o c下孵育1-2小时，同时还原的抗体通过bi-p203有效载荷的马来酰亚胺基团与bi-203发生偶联反应。偶联完成后，将反应混合物脱盐并浓缩以产生抗trop-2-dm1 adc。使用分子排阻色谱高效液相色谱(sec-hplc)确定纯度和聚集物含量，并使用疏水相互作用色谱hplc(hic-hplc)确定载药量(dar)，表征所得adc的生化特性。最终的adc产品含有四个或六个或七个dm1-连接子。与赖氨酸偶联方法相比，偶联过程中使用半胱氨酸偶联方法产生的adc同质性更好。
[0216]
在adc中，高载药量，例如药物/抗体比率》5，可能会导致某些抗体-药物偶联物的聚集、不溶解、毒性或细胞通透性丧失。通常，在偶联反应中偶联至抗体的药物数量小于理论最大值。载药量也称为药物-抗体比(dar)，是偶联到每个抗体的平均药物数量。在抗体igg1和igg4同种型的情况下，在抗体部分还原后药物与抗体半胱氨酸反应，每个抗体的载药量范围为1至8个药物(d)，即2、4、5、6和8个药物共价连接到抗体上。在抗体igg2同种型的情况下，在抗体部分还原后药物与抗体半胱氨酸反应，每个抗体的载药量范围为1至12种药物(d)，即2、4、6、8、10和12药物与抗体共价连接。adc的结构包括细胞结合剂，如抗体，和偶联到抗体上的1到8或1到12个药物。偶联反应产生的adc的平均药物数量可以通过常规方法表征，例如uv、反相hplc、hic、质谱、elisa实验和电泳。与那些含有smcc-dm1或vc-mmae有效载荷的adc相比，本发明的含有bi-p203的adc具有很好的水溶性，因此允许更多的药物偶联到抗体上，如dar》7。药物组合物
[0217]
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含如本文所述的adc，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。本文所述的药物组合物和使用方法还包括与其他活性剂组合
(共同给药)的实施方案，如下文详述。本文提供的adc可以通过药物制剂领域的技术人员熟知的多种方法来配制。此类方法可以在例如remington's pharmaceutical sciences,第19版(mack publishing company,1995)中找到。药物组合物通常被配制成无菌的、基本上等渗的并且完全符合美国食品和药物管理局的所有gmp规定。
[0218]
通常，本发明的adc适合作为与一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体结合的制剂施用。此类药学上可接受的赋形剂和载体是普通技术人员熟知和理解的并且已被广泛描述(参见例如，remington's pharmaceutical sciences，第18版，ar gennaro，编辑，mack publishing company，1990)。可包括药学上可接受的载体以用于改变、维持或保持例如组合物的ph、渗透压、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透.此类药物组合物可影响多肽的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。合适的药学上可接受的载体包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(例如硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐、其他有机酸)；填充剂(如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(如乙二胺四乙酸(edta))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充物；单糖；二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；染色；调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；形成盐的抗衡离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、洗必泰、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(例如pluronics、聚乙二醇、山梨糖醇酐酯、聚山梨醇酯例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、triton、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、tyloxapal)；稳定性增强剂(蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物(优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送载体；稀释剂；赋形剂和/或药物助剂。
[0219]
药物组合物中的主要赋形剂或载体本质上可以是水性的或非水性的。例如，合适的赋形剂或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能辅以有用于肠胃外给药的组合物中常见的其他材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是进一步的示例性载体。其他示例性药物组合物包含约ph 7.0-8.5的tris缓冲液或约ph4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可进一步包含山梨糖醇或其合适的替代物。在本发明的一个实施方案中，组合物可以通过将具有所需纯度的所选组合物与可选的制剂试剂(remington's pharmaceutical sciences，同上)作为冻干饼或水溶液形式的混合来制备用于储存。此外，可以使用合适的赋形剂如蔗糖将治疗组合物配制成冻干物。最佳药物组合物将由本领域普通技术人员根据例如预期的给药途径、递送形式和所需剂量来确定。
[0220]
本发明的药物组合物通常适用于肠胃外给药。如本文所用，药物组合物的“肠胃外给药”包括以物理破坏患者组织为特征的任何给药途径和通过破坏组织的给药药物组合物，因此通常导致直接给药到血液中，进入肌肉，或进入内部器官。因此，肠胃外给药包括但不限于通过注射组合物、通过手术切口施用组合物、通过组织穿透性非手术伤口施用组合物等施用药物组合物.在各种实施方案中，将药物组合物配制成通过选自例如皮下注射、腹膜内注射、肌肉内注射、胸骨内注射、静脉内注射、动脉内注射、鞘内注射、心室内注射、尿道内注射、颅内注射、滑膜内注射或通过输液。
[0221]
当考虑肠胃外给药时，治疗药物组合物可以是无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式，其在药学上可接受的载体中包含所需的adc。用于肠胃外注射的特别合适的载体是无菌蒸馏水，其中多肽被配制成无菌、等渗溶液，并适当保存。在各种实施方案中，适用于可注射给药的药物制剂可以配制在水溶液中，优选在生理相容的缓冲液中，例如汉克斯溶液、林格溶液或生理缓冲盐水。水性注射混悬剂可能含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。此外，活性化合物的悬浮液可以制备成合适的油性注射悬浮液。，悬浮液还可选择包含合适的稳定剂或试剂以增加化合物的溶解度并允许制备高度浓缩的溶液。可注射制剂可以以单位剂型制备、包装或出售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。其他可用的非胃肠道给药制剂包括那些包含微晶形式或脂质体制剂中的活性成分的制剂。用于肠胃外给药的制剂可以配制成立即释放和/或改良释放。改良释放制剂包括延迟释放、持续释放、脉冲释放、控制释放、靶向释放和程序释放。
[0222]
用于配制和施用肽、蛋白质、抗体和免疫偶联物的任何方法都可以适当地用于施用本发明的adc。给药
[0223]
调整剂量方案以提供最佳所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个拆分的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少或增加剂量。将非肠道组合物配制成剂量单位形式是特别有利的，以便于给药和剂量的均匀性。如本文所用，术语“剂量单位形式”是指适合作为待治疗对象的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算可产生所需的治疗效果以及所需的药物载体。
[0224]
在本发明的方法中使用的adc的精确剂量将取决于给药途径以及疾病或病症的严重程度，并且应该根据从业者的判断和每个受试者的情况来决定。应当注意，剂量值可以包括单次或多次剂量，并且对于任何特定受试者，应根据个体需要和施用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调整特定的剂量方案，并且本文所述的剂量范围仅是示例性的，并不旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。此外，本专利公开的组合物的给药方案可以考虑多种因素，包括疾病类型、年龄、体重、性别、受试者的医学状况、状况的严重性、给药途径、和使用的特定抗体。因此，给药方案可以有很大差异，但可以使用标准方法常规确定。例如，可以根据药代动力学或药效学参数调整剂量，这些参数可能包括临床效应，如毒性效应和/或实验室数据。因此，本发明包括由技术人员确定的受试者内剂量递增。确定合适的剂量和方案在相关领域中是众所周知的，并且一旦提供本文公开的教导，本领域技术人员将被理解为包括在内。
[0225]
对于施用于人类受试者，本发明的adc的总月剂量可以在每名患者0.002-500mg、每名患者0.002-400mg、每名患者0.002-300mg、每名患者0.002-200mg的范围内，每名患者0.002-100mg，每名患者0.002-50mg，每名患者0.006-500mg，每名患者0.006-400mg，每名患者0.006-300mg，每名患者0.006-200mg，每名患者0.006-100mg，0.006
ꢀ‑
50mg每名患者，0.02-500mg每名患者，0.02-400mg每名患者，0.02-300mg每名患者，0.02-200mg每名患者，0.02-100mg每名患者，0.02-50mg每名患者，0.06-每名患者500mg，每名患者0.06-400mg，每名患者0.06-300mg，每名患者0.06-200mg，每名患者0.06-100mg，每名患者0.06-50mg，每名患者0.2-500mg，0.2-400mg每名患者，0.2-300mg每名患者，0.2-200mg每名患者，0.2-100mg每名患者，0.2-50mg每名患者，0.6-500mg每名患者，0.6-400mg每名患者，0.6-300mg每名患
者，每名患者0.6-200毫克，每名患者0.6-100毫克，或每名患者0.6-50毫克患者，每名患者2-500mg，每名患者2-400mg，每名患者2-300mg，每名患者2-200mg，每名患者2-100mg，每名患者2-50mg，每名患者6-500mg，每名患者6-400mg，每名患者6-300mg，每名患者6-200mg，每名患者6-100mg，或每名患者6-50mg，当然取决于给药方式。每月总剂量可以单次或分次给药，并且可以根据医生的判断超出本文给出的典型范围之外。
[0226]
本发明的adc的治疗有效量的示例性、非限制性每周给药范围可以是约0.0001至约0.9mg/kg、约0.0001至约0.8mg/kg、约0.0001至约0.7mg/kg、约0.0001至约0.6mg/kg、约0.0001至约0.5mg/kg、约0.0001至约0.4mg/kg、约0.0001至约0.3mg/kg、约0.0001至约0.2mg/kg、约0.0001至约0.1mg/kg、约0.0003至约0.9mg/kg、约0.0003至约0.8mg/kg、约0.0003至约0.7mg/kg、约0.0003至约0.6mg/kg、约0.0003至约0.5mg/kg、约0.0003至约0.4mg/kg、约0.0003至约0.3mg/kg、约0.0003至约0.2mg/kg、约0.0003至约0.1mg/kg、约0.001至约0.9mg/kg、约0.001至约0.8mg/kg kg,约0.001至约0.7mg/kg,约0.001至约0.6mg/kg,约0.001至约0.5mg/kg,约0.001至约0.4mg/kg,约0.001至约0.3mg/kg,约0.001至约0.2mg/kg，约0.0001至约0.1mg/kg、约0.003至约0.9mg/kg、约0.003至约0.8mg/kg、约0.003至约0.7mg/kg、约0.003至约0.6mg/kg、约0.003至约0.5mg/kg、约0.003至约0.4mg/kg、约0.003至约0.3mg/kg、约0.003至约0.2mg/kg、约0.003至约0.1mg/kg、约0.01至约0.9mg/kg、约0.01至约0.8mg/kg kg、约0.01至约0.7mg/kg、约0.01至约0.6mg/kg、约0.01至约0.5mg/kg、约0.01至约0.4mg/kg、约0.01至约0.3mg/kg、约0.01至约0.2mg/kg、约0.01至约0.1mg/kg、约0.03至约0.9mg/kg、约0.03至约0.8mg/kg、约0.03至约0.7mg/kg、约0.03至约0.6mg/kg约0.03至约0.5mg/kg、约0.03至约0.4mg/kg、约0.03至约0.3mg/kg、约0.03至约0.2mg/kg、约0.03至约0.1mg/kg、约0.1至约0.9mg/kg、约0.1至约0.8mg/kg、约0.1至约0.7mg/kg、约0.1至约0.6mg/kg、约0.1至约0.5mg/kg，约0.1至约0.4mg/kg、约0.1至约0.3mg/kg、约0.1至约0.2mg/kg、约0.1至约0.1mg/kg、约0.3至约0.9mg/kg、约0.3至约0.8mg/kg、约0.3至约0.7mg/kg、约0.3至约0.6mg/kg、约0.3至约0.5mg/kg、约0.3至约0.4mg/kg、约0.3至约0.3mg/kg、约0.3至约0.2mg/kg，约0.3至约0.1mg/kg。
[0227]
在各种实施方案中，药物组合物的单次或多次给药取决于患者需要和耐受的剂量和频率。在任何情况下，组合物应含有足够量的至少一种本专利报道的adc，以便有效治疗患者。该剂量可以一次给药，但可以周期性多次给药直到达到治疗结果或直到观察到的副作用要求停止治疗。
[0228]
adc药物组合物的给药频率取决于治疗的性质和所治疗的特定疾病。可以定期对患者进行治疗，例如每周或每月，直到达到所需的治疗结果，或者开始用负荷剂量给药，然后定期接受维持剂量。示例性给药频率包括但不限于：每周一次，不间断；每周一次，每隔一周一次；每两周一次；每3周一次；每周给药持续2周,每周两次持续2周,每周两次持续3周,每周两次持续4周,每周两次持续5周,每周两次持续6周,每周两次持续7周，每周两次持续8周，每月一次；每隔一个月一次；每三个月一次；每四个月一次；每五个月一次；或每六个月一次，或每年一次。
[0229]
本发明的药物组合物的毒性和治疗指数可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如，用于确定ld 50(对50％的群体致死的剂量)和ed 50(剂量对50％的群体有治疗效果)。毒性剂量与治疗有效剂量的比率即为治疗指数，可用ld50/ed 50比值
表示。通常会优先选择表现出大治疗指数的组合物。治疗使用方法
[0230]
一方面，本发明涉及一种治疗增殖性疾病(例如癌症)的方法，包括向病人施用治疗有效量的adc。重要的是，本文所述的adc和方法可用于以惊人的低剂量有效治疗癌症，包括复发性、耐药性或难治性癌症。
[0231]
在各种实施方案中，本发明的方法可用于治疗某些细胞增殖性疾病。此类疾病包括但不限于以下：a)乳腺增生性疾病，包括但不限于浸润性导管癌、浸润性小叶癌、导管癌、小叶原位癌和转移性乳腺癌；b)淋巴细胞增殖性疾病，包括但不限于各种t细胞和b细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金病和中枢神经系统淋巴瘤；(c)多发性骨髓瘤、慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸性粒细胞白血病/高嗜酸性粒细胞综合征、慢性特发性骨髓纤维化、真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、慢性粒单核细胞白血病、非典型慢性粒细胞白血病、幼年粒单核细胞白血病、有环状铁粒幼细胞和无环状铁粒幼细胞的难治性贫血，难治性血细胞减少症(骨髓增生异常综合征)伴多系发育不良、难治性贫血(骨髓增生异常综合征)伴原始细胞增多、5q综合征、骨髓增生异常综合征伴t(9；12)(q22；p12)和骨髓性白血病(如费城染色体阳性(t(9；22)(qq34；q11))；d)皮肤增生性疾病，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤和卡波西肉瘤；e)白血病，包括但不限于急性髓细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病和毛细胞白血病，f)消化道增生性疾病，包括但不限于肛门、结肠、结肠直肠、食道、胆囊、胃(胃)、胰腺癌、胰腺癌-胰岛细胞、直肠、小肠和唾液腺癌症；g)肝脏增殖性疾病，包括但不限于肝细胞癌、胆管癌、混合性肝细胞胆管癌、原发性肝癌和转移性肝癌；h)男性生殖器官的增殖性疾病，包括但不限于前列腺癌、睾丸癌和阴茎癌；i)女性生殖器官的增殖性疾病，包括但不限于子宫癌(子宫内膜)、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌、子宫肉瘤和卵巢生殖细胞瘤；j)呼吸道增殖性疾病，包括但不限于小细胞和非小细胞肺癌、支气管水肿、胸膜肺母细胞瘤和恶性间皮瘤；k)脑的增殖性疾病，包括但不限于脑干和下丘脑胶质瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、少突胶质细胞、脑膜瘤和神经外胚层和松果体肿瘤；l)眼部增生性疾病，包括但不限于眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤和横纹肌肉瘤；m)头颈部的增殖性疾病，包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌，以及唇癌和口腔癌、鳞状颈癌、转移性鼻窦癌；n)甲状腺增生性疾病，包括但不限于甲状腺癌、胸腺瘤、恶性胸腺瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、2a型多发性内分泌瘤(men2a)、嗜铬细胞瘤、甲状旁腺腺瘤、多发性内分泌瘤2b型(men2b)、家族性甲状腺髓样癌(fmtc)和类癌；o)泌尿道增生性疾病，包括但不限于膀胱癌；p)肉瘤，包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤；q)肾脏增殖性疾病，包括但不限于肾细胞癌、肾透明细胞癌；和肾细胞腺癌；r)前体b淋巴细胞白血病/淋巴瘤(前体b细胞急性淋巴细胞白血病)、b细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、b细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区b细胞淋巴瘤、毛细胞白血病,浆细胞骨髓瘤/浆细胞瘤,malt型结外边缘区b细胞淋巴瘤,淋巴结边缘区b细胞淋巴瘤,滤泡性淋巴瘤,套细胞淋巴瘤,弥漫性大b细胞淋巴瘤,纵隔大b细胞淋巴瘤,原发性积液淋巴瘤和伯基特淋巴瘤/伯基特细胞白血病；(s)前体t细胞淋巴瘤/白血病(前体t细胞急性淋巴细胞白血病)、t细胞幼淋巴细胞白血病、t细胞颗粒淋巴细胞白血病、侵袭性nk细胞白血病、成人t细胞淋巴瘤/白血病(htlv-1)、结外nk/t细胞淋巴瘤、鼻型、肠病型t细胞
淋巴瘤、肝脾γ-δt细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样t细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿/sezary综合征、间变性大细胞淋巴瘤，t/null细胞淋巴瘤，原发性皮肤型，外周t细胞淋巴瘤，无其他特征，血管免疫母细胞t细胞淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，t/null细胞和原发性全身型；(t)结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤、结节性硬化霍奇金淋巴瘤(1级和2级)、富含淋巴细胞的经典霍奇金淋巴瘤、混合细胞型霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞耗竭型霍奇金淋巴瘤；和(u)aml与t(8；21)(q22；q22)、aml1(cbf-α)/eto、急性早幼粒细胞白血病(aml与t(15；17)(q22；q11-12)和变体，pml/rar-α)、骨髓嗜酸性粒细胞异常(inv(16)(p13q22)或t(16；16)(p13；q11)、cbfb/myh11.times.)的aml，以及11q23(mll)异常的aml，aml低分化、未成熟的aml、成熟的aml、急性粒单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红细胞白血病、急性巨核细胞白血病、急性嗜碱性粒细胞白血病和急性全髓性骨髓纤维化。
[0232]
在各种实施方案中，增殖性疾病是选自下组的癌症：b细胞淋巴瘤；肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；支气管癌；结直肠癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；胃癌；卵巢癌；膀胱癌；脑或中枢神经系统癌症；周围神经系统癌症；食道癌；宫颈癌；黑色素瘤；子宫癌或子宫内膜癌；口腔或咽癌；肝癌；肾癌；胆道癌；小肠癌或阑尾癌；唾液腺癌；甲状腺癌；肾上腺癌；骨肉瘤；软骨肉瘤；脂肪肉瘤；睾丸癌；和恶性纤维组织细胞瘤；皮肤癌；头颈癌；淋巴瘤；肉瘤；多发性骨髓瘤；和白血病。
[0233]
在多个实施方案中，提供了治疗个体癌症的方法，包括向个体施用有效量的包含adc的药物组合物，其中adc以选自下组的每周剂量施用给个体0.0001毫克/公斤、0.0003毫克/公斤、0.001毫克/公斤、0.003毫克/公斤、0.01毫克/公斤、0.03毫克/公斤、0.1毫克/公斤、0.2毫克/公斤、0.3毫克/公斤、0.4毫克/公斤、0.5毫克/公斤、0.6毫克/公斤、0.7毫克/公斤、0.8毫克/公斤和0.9毫克/公斤。在各种实施方案中，以包括在以下任何范围内的剂量(例如，每周剂量)向个体施用adc：约0.0001至约0.0003mg/kg、约0.0003至约0.001mg/kg、约0.001约0.003mg/kg、约0.003至约0.01mg/kg、约0.01至约0.03mg/kg、约0.03至约0.1mg/kg、约0.1至约0.3mg/kg、约0.3至约0.4mg/kg kg、约0.4至约0.5mg/kg、约0.5至约0.6mg/kg、约0.6至约0.7mg/kg、约0.7至约0.8mg/kg和约0.8至约0.9mg/kg。在各种实施方案中，以不大于以下任何一项的剂量(例如，每周剂量)向个体施用adc：0.0001mg/kg、0.0003mg/kg、0.001mg/kg、0.003毫克/公斤、0.01毫克/公斤、0.03毫克/公斤、0.1毫克/公斤、0.2毫克/公斤、0.3毫克/公斤、0.4毫克/公斤、0.5毫克/公斤、0.6毫克/公斤、0.7毫克/公斤、0.8毫克/公斤和0.9毫克/公斤。在各种实施方案中，癌症表达本发明的adc靶向的肿瘤相关抗原。在各种实施方案中，癌症是肿瘤本身表达肿瘤相关抗原但肿瘤微环境中不表达肿瘤相关抗原的癌症。
[0234]
在各种实施方案中，所述方法可以抑制或阻止个体中表达肿瘤相关抗原或不表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞的生长或增殖，例如至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。结果，在肿瘤是实体瘤的情况下，调节可以将实体瘤的大小减小至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0235]
肿瘤细胞增殖的抑制可以通过基于细胞的测定来测量，例如溴脱氧尿苷(brdu)掺
入(hoshino et al.,int.j.cancer 38,369,1986；campana et al.,j.immunol.meth.107:79,1988；[3h]-胸苷掺入(chen,j.,oncogene 13:1395-403,1996；jeoung,j.,j.biol.chem.270:18367-73,1995；染料alamar blue(可从biosource international获得)(voytik-harbin等人，in vitro cell dev biol动画34:239-46,1998)。癌细胞的不依赖贴壁的生长通过软琼脂中的集落形成测定来评估，例如通过计算在软琼脂顶部形成的癌细胞集落的数量(参见实施例和sambrook等人，molecular cloning，cold spring harbor，1989)。
[0236]
可以通过监测对象中的癌症生长来评估对象中肿瘤细胞生长的抑制，例如在动物模型或人类对象中。一种示例性监测方法是致瘤性测定。在一个实例中，异种移植物包含来自已存在的肿瘤或来自肿瘤细胞系的人类细胞。肿瘤异种移植物测定是本领域已知的并在本文中描述(参见例如ogawa等人，oncogene 19:6043-6052,2000)。在另一个实施方案中，使用中空纤维测定法监测致瘤性，该测定法描述于美国专利号5,698,413中，该专利通过引用以其整体并入本文。
[0237]
通过比较调节剂处理下的肿瘤细胞增殖、不依赖锚定的生长或肿瘤细胞生长与阴性对照条件下(通常没有经过调节剂处理)下的肿瘤细胞生长来计算抑制百分比。例如，当肿瘤细胞或肿瘤细胞集落的数量(集落形成测定)或prdu或[3h]-胸苷掺入为a(在调节剂处理下)和c(在阴性对照条件下)时，抑制为(ca)/cx100％。
[0238]
源自人类肿瘤并可用于体外和体内研究的肿瘤细胞系的实例包括但不限于白血病细胞系(例如，ccrf-cem、hl-60(tb)、k-562、molt-4、rpm1-8226、sr、p388和p388/adr、h292、mv-4-11)；非小细胞肺癌细胞系(例如，a549/atcc、ekvx、hop-62、hop-92、nci-h226、nci-h23、nci-h322m、nci-h460、nci-h522和lxfl 529)；小细胞肺癌细胞系(例如，dms 114和shp-77)；结肠癌细胞系(例如，colo 205、hcc-2998、hct-116、hct-15、ht29、km12、sw-620、dld-1和km20l2)；中枢神经系统(cns)癌细胞系(例如，sf-268、sf-295、sf-539、snb-19、snb-75、u251、snb-78和xf 498)；黑色素瘤细胞系(例如lox i mvi、malme-3m、m14、sk-mel-2、sk-mel-28、sk-mel-5、uacc-257、uacc-62、rpmi-7951和m19-mel)；卵巢癌细胞系(例如，igrov1、ovcar-3、ovcar-4、ovcar-5、ovcar-8和sk-ov-3)；肾癌细胞系(例如，786-0、a498、achn、caki-1、rxf 393、sn12c、tk-10、uo-31、rxf-631和sn12k1)；前列腺癌细胞系(例如，pc-3和du-145)；乳腺癌细胞系(例如，mcf7、nci/adr-res、mda-mb-231/atcc、hs 578t、mda-mb-435、bt-549、t-47d和mda-mb-468)；和甲状腺癌细胞系(例如，sk-n-sh)。
[0239]
另一方面，本发明涉及激活或刺激位于肿瘤微环境中不表达肿瘤相关抗原的免疫细胞的方法，包括向个体施用有效量的包含adc的药物组合物；其中adc以包括在任何以下范围内的剂量(例如，每周剂量)施用于个体：约0.0001至约0.0003mg/kg、约0.0003至约0.001mg/kg、约0.001至约0.003mg/kg、约0.003至约0.01mg/kg、约0.01至约0.03mg/kg、约0.03至约0.1mg/kg、约0.1至约0.3mg/kg、约0.3至约0.4mg/kg、约0.4至约0.5mg/kg、约0.5至约0.6mg/kg、约0.6至约0.7mg/kg、约0.7至约0.8mg/kg和约0.8至约0.9mg/kg。在各种实施方案中，adc以选自约0.0001mg/kg、约0.0003mg/kg、约0.001mg/kg、约0.003mg/kg的每周剂量施用于个体。kg、约0.01mg/kg、约0.03mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg和约0.9mg/kg。在各种实施方案中，以不大于以下任何一项的剂量(例如，每周剂量)向个体施用adc：0.0001mg/kg、
0.0003mg/kg、0.001mg/kg、0.003毫克/公斤、0.01毫克/公斤、0.03毫克/公斤、0.1毫克/公斤、0.2毫克/公斤、0.3毫克/公斤、0.4毫克/公斤、0.5毫克/公斤、0.6毫克/公斤、0.7毫克/公斤、0.8毫克/公斤和0.9毫克/公斤。
[0240]
在各种实施方案中，本文所述的方法可与其他常规抗癌治疗方法组合使用，这些方法涉及治疗或预防增殖性疾病，此类方法包括但不限于化学疗法、小分子激酶抑制剂靶向疗法、手术、放射治疗和干细胞移植。例如，这些方法可用于预防性癌症预防、预防手术后癌症复发和转移，以及作为其他常规癌症治疗的辅助手段。本发明认识到常规癌症疗法(例如，化学疗法、放射疗法、光疗法、免疫疗法和手术)的有效性可以通过使用本文所述的adc分子来增强。
[0241]
许多常规化合物已被证明具有抗肿瘤活性。这些化合物已被用作化学疗法中的药剂以缩小实体瘤、防止转移和进一步生长，或减少白血病或骨髓恶性肿瘤中恶性t细胞的数量。尽管化学疗法在治疗各种类型的恶性肿瘤方面是有效的，但许多抗肿瘤化合物会引起不良的副作用。已经表明，当组合两种或更多种不同的治疗时，治疗可以协同作用并允许减少每种治疗的剂量，从而减少每种化合物在较高剂量下产生的有害副作用。在其他情况下，对治疗无效的恶性肿瘤可能对两种或多种不同治疗的联合治疗有反应。
[0242]
当本专利公开的adc与另一种常规抗肿瘤剂联合给药时，同时或依次给药，此类融合分子可增强抗肿瘤剂的治疗效果或克服细胞对此类抗肿瘤剂的抗性。这允许减少抗肿瘤剂的剂量，从而减少不希望看到的副作用，或恢复抗肿瘤剂在抗性t细胞中的有效性。在各种实施方案中，将向患者施用第二抗癌剂，例如化疗剂。示例性化疗剂的列表包括但不限于柔红霉素、放线菌素、阿霉素、博来霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、苯达莫司汀、阿糖胞苷(ca)、5-氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷(5-fudr)、甲氨蝶呤(mtx)、秋水仙碱、长春新碱、长春碱、依托泊苷、替尼泊苷、顺铂、卡铂、奥沙利铂、喷司他丁、克拉屈滨、阿糖胞苷、吉西他滨、普拉曲沙、米托蒽醌、己烯雌酚(des)、氟拉达滨、异环磷酰胺、羟基脲紫杉烷(例如紫杉醇和多西紫杉醇)和/或蒽环类抗生素，以及药剂的组合，例如但不限于da-epoch、chop、cvp或folfox。在各种实施方案中，此类化疗剂的剂量包括但不限于约10mg/m2中的任何一个，20毫克/m2,30毫克/m2,40毫克/m2,50毫克/m2,60毫克/m2,75毫克/m2,80毫克/m2,90毫克/m2,100毫克/m2,120毫克/m2,150毫克/m2,175毫克/m2,200毫克/m2,210毫克/m2,220毫克/m2,230毫克/m2,240毫克/m2,250毫克/m2,260毫克/m2,和300毫克/m2。联合免疫疗法
[0243]
在另一个方面，本发明涉及设计用于治疗增殖性疾病(例如癌症)的联合疗法，包括向个体施用：a)治疗有效量的adc，和b)免疫疗法，其中所述组合治疗可能达到增加的对肿瘤细胞的效应细胞杀伤，即当联合给药时adc和免疫治疗之间存在协同作用。
[0244]
在各种实施方案中，增殖性疾病是选自下列癌症：b细胞淋巴瘤；肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；支气管癌；结直肠癌；前列腺癌；乳腺癌；胰腺癌；胃癌；卵巢癌；膀胱癌；脑或中枢神经系统癌症；周围神经系统癌症；食道癌；宫颈癌；黑色素瘤；子宫癌或子宫内膜癌；口腔或咽癌；肝癌；肾癌；胆道癌；小肠癌或阑尾癌；唾液腺癌；甲状腺癌；肾上腺癌；骨肉瘤；软骨肉瘤；脂肪肉瘤；睾丸癌；和恶性纤维组织细胞瘤；皮肤癌；头颈癌；淋巴瘤；肉瘤；多发性骨髓瘤；和白血病。
[0245]
在各种实施方案中，联合疗法可以包括向受试者施用治疗有效量的免疫疗法，包括但不限于使用针对特定肿瘤抗原的消耗性抗体的治疗；使用抗体-药物偶联物进行治疗；使用针对共刺激或共抑制分子(免疫检查点)如ctla-4、pd-1、pd-l1、cd40、ox-40、cd137、gitr、lag3、tim-3、siglec 7、siglec 8、siglec 9、siglec 15和vista；使用双特异性t细胞结合抗体治疗，例如blinatumomab：治疗涉及施用生物反应调节剂，例如il-12、il-21、gm-csf、ifn-γifn-β和ifn-γ；使用治疗性疫苗(如sipuleucel-t)进行治疗；使用树突状细胞疫苗或肿瘤抗原肽疫苗进行治疗；使用嵌合抗原受体(car)-t细胞进行治疗；使用car-nk细胞进行治疗；使用肿瘤浸润淋巴细胞(til)进行治疗；使用过继转移的抗肿瘤t细胞(离体扩增和/或tcr转基因)进行治疗；使用tall-104细胞治疗；和使用免疫刺激剂治疗，例如toll样受体(tlr)激动剂cpg和咪喹莫特；以及使用卡介苗等疫苗进行治疗。
[0246]
在各种实施方案中，提供了治疗增殖性疾病的联合治疗方法，包括向病人施用a)有效量的adc；b)免疫疗法；其中联合疗法提供增加的效应细胞杀伤。在各种实施方案中，免疫疗法是使用针对共刺激或共抑制分子的激动性、拮抗性或阻断性抗体进行的治疗。在各种实施方案中，免疫疗法是使用嵌合抗原受体(car)-t细胞的治疗。在各种实施方案中，免疫疗法是使用car-nk细胞的治疗。在各种实施方案中，免疫疗法是使用双特异性t细胞结合抗体的治疗。在各种实施方案中，癌症表达本发明的adc的肿瘤相关抗原。在各种实施方案中，癌症是肿瘤表达肿瘤相关抗原的但肿瘤微环境中的不表达肿瘤相关抗原的癌症。在各种实施方案中，免疫疗法将靶向与adc靶向的肿瘤相关抗原不同的肿瘤相关抗原。试剂盒
[0247]
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗癌症和/或辅助治疗的试剂盒。试剂盒通常包括含有本发明的adc的容器。adc可能混有药理学上可接受的赋形剂。试剂盒可选择性地包含癌症免疫治疗剂。
[0248]
此外，试剂盒可选择性地包括介绍使用adc和/或免疫疗法治疗癌症的方法的说明材料。指导材料还可以选择性地教导优选剂量、禁忌症等。
[0249]
试剂盒还可以包括附加组件以促进试剂盒设计的特定应用。因此，例如另外包括用于对伤口进行消毒、用于减轻疼痛、用于附接敷料等的装置。
[0250]
虽然指导材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。本发明涵盖了能够存储这些指令并将它们传送给最终用户的任何介质。这样的介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，cd rom)等。此类媒体可能包括提供此类教学材料的互联网站点的地址。
[0251]
提供以下实施例以更全面地说明本发明，但不解释为限制其范围。示例1化合物bi-p204的合成
[0252]
向2ml dmf中的6-叠氮基-己酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-酯(50mg，0.20mmol)中加入2-甲基氨基丙酸(20.3mg，0.20mmol)。将混合物冷却至0℃并加入三乙胺(40mg，0.40mmol)。
将反应混合物在室温搅拌2小时，然后用水稀释，用1n hcl酸化至ph～3，萃取到乙酸乙酯(3x5ml)中。合并的有机层用饱和食盐水洗涤，经na2so 4干燥并浓缩，得到化合物1(30mg，63％产率)。
[0253]
将美登醇(10mg，0.018mmol)和化合物1(21.4mg，0.088mmol)溶解在二氯甲烷(32ml)中并在氩气下搅拌。添加溶解在二氯甲烷(1ml)中的dcc(20.1mg，0.097mmol)溶液。1分钟后，加入1m zncl 2的乙醚溶液(0.019ml，0.019mmol)。将混合物在室温搅拌4小时，然后加入乙酸乙酯(5ml)并将混合物过滤。滤液用nahco3和食盐水洗涤。有机层经na2 so4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(50-100％乙酸乙酯/己烷)，得到所需产物化合物2(5mg，36％产率)。
[0254]
化合物2(16.5mg,0.021mmol)和alkyne-peg4-mal(8mg,0.021mmol)溶解在二氯甲烷(3ml)中。向混合物中加入0.1m的cuso4
·
5h2o水溶液(0.23ml，0.023mmol)和0.1m的抗坏血酸钠水溶液(1.26ml，0.126mmol)。然后将最终混合物在室温下剧烈搅拌过夜，用水稀释，用10％异丙醇的氯仿溶液萃取。有机层用饱和食盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物bi-p2o4(9.3mg，38％产率)。c56h79cln8o17的esi ms计算值1171.72(m)观察值1172.96(m)。示例2化合物bi-p203的合成
[0255]
向2ml dmf中的叠氮基-peg1-nhs酯(50mg，0.20mmol)添加2-甲基氨基-丙酸(20.3mg，0.20mmol)。将混合物冷却至0℃并加入三乙胺(40mg，0.40mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后用水稀释，用1n hcl酸化至ph～3，萃取到乙酸乙酯(3x5ml)中。合并的有机层用饱和食盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩，得到化合物3(30mg，63％产率)。
[0256]
将美登醇(20mg,0.038mmol)和化合物3(42mg,0.178mmol)溶解在二氯甲烷(32ml)中并在氩气下搅拌。添加溶解于二氯甲烷(1ml)中的dcc(40mg，0.194mmol)溶液。1分钟后，加入1m zncl2的乙醚溶液(0.038ml，0.038mmol)。将混合物在室温搅拌4小时，然后加入乙酸乙酯(5ml)并将混合物过滤。滤液用nahco3和饱和食盐水洗涤。有机层经na2so4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(50-100％乙酸乙酯/己烷)，得到所需产物化合物4(13mg，47％产率)。
[0257]
将化合物4(30mg，0.038mmol)和alkyne-peg4-mal(30mg，0.078mmol)溶解在二氯甲烷(3ml)中。向混合物中加入0.1m的cuso4
·
5h2 o水溶液(0.38ml，0.038mmol)和0.1m的抗坏血酸钠水溶液(4.8ml，0.48mmol)。然后将得到的混合液在室温下剧烈搅拌过夜，用水稀释，用10％异丙醇的氯仿溶液萃取。有机层用饱和食盐水洗涤，经na2 so4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物bi-p2o3(33mg，74％产
率)。c55 h77 cln8 o18的esi ms计算值1173.70(m)观察值1173.94(m)。示例3化合物bi-p205的合成
[0258]
向2ml dmf中的5-叠氮基-戊酸2,5-二氧代-吡咯烷-1-酯(100mg，0.42mmol)添加2-甲基氨基-丙酸(45mg，0.45mmol)。将混合物冷却至0℃并加入三乙胺(90mg，0.90mmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后用水稀释，用1n hcl酸化至ph～3，萃取到乙酸乙酯(3x5ml)中。合并的有机层用饱和食盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩，得到化合物5(70mg，77％产率)。
[0259]
将美登醇(20mg，0.038mmol)和化合物5(40mg，0.176mmol)溶解在二氯甲烷(32ml)中并在氩气下搅拌。添加溶解于二氯甲烷(1ml)中的dcc(40mg，0.20mmol)溶液。1分钟后，加入1m zncl2的乙醚溶液(0.038ml，0.038mmol)。将混合物在室温搅拌4小时，然后加入乙酸乙酯(5ml)并将混合物过滤。滤液用nahco3溶液和饱和食盐水洗涤。有机层经na2so4干燥并浓缩。残余物通过硅胶柱色谱法纯化(50-100％乙酸乙酯/己烷)，得到所需产物化合物6(12mg，41％产率)。
[0260]
化合物6(20mg，0.026mmol)和alkyne-peg4-mal(10mg，0.026mmol)溶解在二氯甲烷(3ml)中。向混合物中加入0.1m的cuso4
·
5h2 o水溶液(0.27ml，0.027mmol)和0.1m的抗坏血酸钠水溶液(1.56ml，0.156mmol)。然后将最终混合物在室温下剧烈搅拌过夜，用水稀释，用10％异丙醇的氯仿溶液萃取。有机层用饱和食盐水洗涤，经na2so4干燥并浓缩。残余
物通过硅胶柱色谱法纯化(0-7％甲醇/二氯甲烷)，得到化合物bi-205(12mg，42％产率)。c53 h73 cln8 o16的esi ms计算值1113.64(m)，观察值：1113.89(m)。
[0261]
化合物bi-p209以与化合物bi-p203类似的程序制备。化合物bi-p209的c53 h73 cln8o18 esi ms计算值：1128.48(m)观察值：1130.03(m+1)。示例4化合物bi-p206的合成
[0262]
将美登醇(56mg，0.1mmol)和n-boc-哌啶-4-羧酸(207mg，0.9mmol)溶解在二氯甲烷(3ml)中。向混合物中加入dic(141μl,0.9mmol)和dmap(9mg,0.09mmol)。将混合物搅拌3小时并蒸发溶剂得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(30-100％乙酸乙酯/己烷)得到产物7(38mg，49％产率)。
[0263]
化合物7(19mg,0.0245mmol)溶解在二氯甲烷和tfa(v/v＝1:1,2ml)的混合物中。将混合物搅拌10分钟并在真空下除去挥发物，得到粗品化合物8。
[0264]
将粗品8(0.0245mmol)溶解在二氯甲烷(1ml)中。向混合物中加入diea(0.035ml，0.2mmol)和mal-peg4-nhs(13mg，0.0245mmol)。将混合物搅拌30分钟并用二氯甲烷(10ml)稀释。加入水并分离有机层。有机层用饱和食盐水洗涤，经无水na2so4干燥并过滤。蒸发滤
液得到残余物，将其用硅胶柱色谱纯化(2-8％甲醇/二氯甲烷)得到化合物bi-p206(7.7mg,29％产率)。c56h79cln8o17的esi ms计算值：1074.60(m)；观察值：1074.3(m)。示例5化合物bi-p207的合成
[0265]
将粗品8(0.0245mmol)溶解在二氯甲烷(1ml)中。向混合物中加入diea(0.035ml，0.2mmol)和mal-peg6-nhs(15mg，0.0245mmol)。将混合物搅拌30分钟并用二氯甲烷(10ml)稀释。加入水并分离有机层。有机层用饱和食盐水洗涤，经无水na2so4干燥并过滤。蒸发滤液得到残余物，将其通过硅胶柱色谱纯化(2-8％甲醇/二氯甲烷)得到化合物bi-p207(8.8mg,31％产率)。c56h80cln5o19的esi ms计算值：1162.71(m)；观察值：1162.3(m)。示例6化合物bi-p208的合成
[0266]
将美登醇(40mg，0.071mmol)和4-n-boc-胺甲基-环己烷-1-羧酸(91mg，0.3mmol)溶解在二氯甲烷(3ml)中。向混合物中加入dic(55μl,0.35mmol)和dmap(4.3mg,0.035mmol)。将混合物搅拌3小时并蒸发溶剂得到残余物，将其通过硅胶柱色谱法纯化(30-100％乙酸乙酯/己烷)得到产物9(18mg,32％产率)。
[0267]
化合物9(18mg,0.0245mmol)溶解在二氯甲烷和tfa(v/v＝2:1,0.75ml)的混合物
中。混合物搅拌10分钟，真空除去挥发物，得到粗品化合物10。
[0268]
将粗制的10(0.0245mmol)溶解在二氯甲烷(1ml)中。向混合物中加入diea(0.035ml，0.2mmol)和mal-peg4-nhs(16mg，0.0245mmol)。将混合物搅拌30分钟并用二氯甲烷(10ml)稀释。加入水并分离有机层。有机层用饱和食盐水洗涤，经无水na2so4干燥并过滤。蒸发滤液得到残余物，将其通过硅胶柱色谱纯化(2-8％甲醇/二氯甲烷)得到化合物bi-208(8.8mg,31％产率)。c54h76cln5o17的esi ms计算值：1102.65(m)观察值：1102.3(m)。
[0269]
化合物bi-p210和bi-p211以与化合物bi-p206相似的程序制备。化合物bi-p210的c54h70cln5o17 esi ms计算值：1096.61(m)；观察值：1096.8(m)。化合物bi-p211的c50h68cln5o17 esi ms计算值：1046.55(m)；观察值：1046.8(m)。示例7美登素衍生物有效载荷的表征
[0270]
计算有效载荷的亲脂性和表征adc的聚集率。最常用的亲脂性度量是logp，它是分子在水相和油脂相之间的分配系数，通常是用辛醇和水体系。logp用于预测水相溶解度和渗透性，这已成为药物相似性的替代指标。在本实验中，anti-trop-2 bi-p203和anti-trop-2-smcc-dm1的logp使用chemdraw软件计算。分子排阻色谱(sec)用于表征adc单体及其聚集体。聚集百分比是由峰面积确定的较高分子量物质(mw高于抗体单体)的百分比。表2总结了logp、dar和聚体含量数据。与smcc-dm1有效载荷相比，bi-p203有效载荷显示出水相溶解度增加，聚集速率降低。即使dar为7，anti-trop-2-bi-p203的聚集率仍低于dar为4的anti-trop-2-smcc-dm1。表2
示例8anti-trop-2-adc的产生
[0271]
人源化抗trop-2抗体与dm1衍生物偶联形成adc，并评估其对表达不同trop-2水平的多种癌细胞系生长抑制的能力。dm1是美登素的化学衍生物；它通过抑制微管生成动力学来抑制细胞分裂。dm1已被证明是临床有效的adc有效载荷。
[0272]
本发明的一些实施方案涉及通过不可切割的连接子与抗体连接的dm1类似物。在这个例子中，通过将抗体添加到溶解在调节了ph值的pbs edta缓冲液中的tcep(tris(2-羧乙基)膦)中来还原抗trop-2抗体。将抗体/tcep溶液在37o c下孵育2-3小时。将还原的抗体缓冲液交换到偶联反应缓冲液中。将溶解在dmso中的bi-p203有效载荷添加到还原的抗trop-2单克隆抗体溶液中，有效载荷/抗体比率为7-30:1，以实现不同的药物与抗体比率(dar)。有效载荷/抗体溶液在20o c下孵育1-2小时，此时还原的抗体的半胱氨酸巯基通过与bi-p203的马来酰亚胺基团反应进行偶联。偶联完成后，将反应混合物脱盐并浓缩以产生抗trop-2-bi-p203adc。使用分子排阻色谱高效液相色谱(sec-hplc)确定纯度和聚集物含量，并使用疏水相互作用色谱hplc(hic-hplc)确定载药量(dar)，表征得到adc的生化特性。偶联过程如图12所示。最终的adc产物由四个或六个或七个dm1类似物-连接子分子组成。与赖氨酸偶联方法相比，偶联过程中使用的半胱氨酸偶联方法产生更多同质adc。示例9抗trop-2 adc对不同的trop-2表达水平的癌细胞系的体外细胞毒性
[0273]
anti-trop-2抗体与不同dm1衍生物偶联产生具有相似dar值的adc，将它们与抗trop-2-smcc-dm1 adc和anti-trop-2-vc-mmae adc头对头进行了细胞毒性测试。bxpc-3胰腺癌细胞代表trop-2高表达癌细胞，mda-mb-468乳腺癌细胞，n87胃癌细胞和sk-br-3卵巢癌细胞代表trop-2中度表达癌细胞，colo205结肠癌细胞代表trop-2低表达癌细胞，a549肺癌细胞和mda-mb-231乳腺癌细胞trop-2表达检测不到。进行体外细胞毒性测定。简而言之，所有细胞系均在合适的培养基中于37℃在5％ co2的加湿培养箱气氛中培养。将细胞接种
在96孔平底板中。细胞接种数范围为500个细胞/100μl/孔到6,000个细胞/100μl/孔。使细胞在37℃在5％ co2的湿润气氛中贴壁过夜。adc由储备溶液制备，并在细胞接种后24小时稀释至适当的工作浓度。用培养基连续十倍稀释七个点。最终浓度范围为10,000nm至0.001nm。将细胞与adc一起孵育72小时。将细胞计数试剂盒-8溶液(dojindo china co.,ltd,lot#pl701)加入孔中，在37oc下放置1-4小时，并使用酶标仪(spectramax m5，molecular devices)测量450nm波长处的吸光度和softmax pro5.4.1软件。生成剂量反应曲线并使用graphpad prism 7三参数曲线拟合计算ic50。
[0274]
图13
–
图19分别显示了含有有效载荷smcc-dm1、bi-p203、bi-p204、bi-p205、bi-p206、bi-p207、bi-p208的adc对bxpc-3(图13)，mda-mb-468(图14)、n87(图15)、sk-br-3(图16)、colo205(图17)、a549(图18)和mda-mb-231(图19)癌细胞的代表性杀伤曲线。总体而言，所有含有各种dm1衍生物有效载荷的adc在trop-2高或中等细胞中表现出与adc-dm1相似的体外杀伤活性。它们对trop-2表达低或没有表达的细胞不如adc-dm1有效。
[0275]
在mda-mb-468、sk-br-3、colo205和a549单元中分别测试了adc-bi-p209和自由有效载荷以及adc-bi-p203及其自由有效载荷。如图20所示，adc-bi-p209显示出与adc-bi-p203相当的活性，而bi-p209在所有测试细胞中的细胞毒性略高于bi-p203。
[0276]
adc-bi-p203的抗体与药物比率为7(dar＝7)，并测试其与dar4的adc-smcc-dm1在trop-2阳性mda-mb-468中和trop-2阴性a549中的细胞毒性活性。如图21所示，与adc-smcc-dm1相比，adc-bi-p203对trop-2高表达mda-mb-468细胞的毒性作用更强，而bi-p203有效载荷的活性低于scmm-dm1有效载荷。在trop-2阴性a549细胞中，adc-bi-p203在所有测试的3个adc中最弱。
[0277]
表3总结了体外细胞毒性试验的结果，其中测试了在不同dar下含有各种dm1衍生物有效载荷的adc。结果表明，具有dar7的adc-bi-p203具有与adc-vc-mmae(dar4)相当的细胞杀伤活性，并且在具有高/中度trop-2表达(bxpc-3、mda-mb-468、nci-n87)的肿瘤细胞中，两种adc都比adc-smcc-dm1(dar4)更有效。另一方面，在低表达trop-2(colo-205)的肿瘤细胞中，adc-bi-p203的体外细胞毒性与adc-smcc-dm1相似，但不如adc-vc-mmae。在trop-2阴性a549和mda-mb-231细胞中，adc-smcc-dm1和adc-vc-mmae的ic50约为100nm，而用adc-bi-p203 ic50无法计算(》500nm)，表明没有达到特定的杀灭活性。总之，这些在体外细胞毒性结果表明，含有bi-p203的adc保持与mmae adc或dm1 adc等效的抗肿瘤活性，特别是针对高抗原表达肿瘤，而对低或无抗原表达细胞(即正常细胞)的影响较小，因此提供了一种更宽的治疗窗口。
表3示例10anti-trop-2-bi-p203 adc体内抗肿瘤活性评估
[0278]
使用trop-2阳性mda-mb-468和trop-2阴性colo205异种移植模型在小鼠中评估抗trop-2-bi-p203 adc的抗肿瘤活性。从培养瓶中收获500万个细胞并皮下植入6至7周龄balb/c裸鼠的右侧。当肿瘤形成时开始给药。anti-trop-2-bi-p203以1.5和5.0mg/kg单剂量给药。在整个实验过程中每周测量两次肿瘤，使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm 3)＝(长x宽2)/2。
[0279]
图22a显示体内mda-mb-468异种移植肿瘤模型药效研究的结果。如图所示，单次给药5.0mg/kg adc可诱导肿瘤完全消退。1.5mg/kg adc给药剂量控制疾病稳定。与对照载体或对照igg adc相比，抗trop-2-bi-p203对小鼠体重变化没有明显影响，如图22b所示。
[0280]
图23描述了体内colo205异种移植肿瘤模型药效研究的结果。结果表明抗trop-2-bi-p203在trop-2阴性肿瘤模型中在1、3和10mg/kg的所有测试剂量下均无药效(图23a)，并且确实影响小鼠体重变化(图23b)。
[0281]
根据本发明，本文公开和要求保护的所有物品和方法可以在不进行过度实验的情况下制造和执行。尽管本发明的物品和方法已根据优选实施例进行了描述，但对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对物品和方法应用变化是显而易见的。对本领域技术人员来说显而易见的所有这些变化和等效物，无论是现在存在的还是以后开发的，都被认为在所附权利要求限定的本发明的精神和范围内。说明书中提及的所有专利、专利申请和出版物都表明了本发明所属领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物出于所有目的以引用的方式整体并入本文，并且其程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示以引用的方式整体并入用于任何和所有目的一样。此处示例性描述的本发明可以在没有此处未具体公开的任何元素的情况下实施。因此，应当理解，虽然本发明已经通过优选实施例和可选特征具体公开，但是本领域技术人员可以对这里公开的概念进行修改和变化，并且这些修改和变化被认为是在所附权利要求限定的本发明范围内。序列表如37cfr 1.822中定义的，随附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用标准字母缩写表示核苷酸碱基，使用三字母代码表示氨基酸。seq id no：1是包含抗trop-2抗体轻链的氨基酸序列。seq id no：2是包含抗trop-2抗体重链的氨基酸序列。seq id no：3是抗trop-2抗体中轻链cdr1的氨基酸序列。seq id no：4是抗trop-2抗体中轻链cdr2的氨基酸序列。seq id no：5是抗trop-2抗体中轻链cdr3的氨基酸序列。seq id no：6是抗trop-2抗体中重链cdr1的氨基酸序列。seq id no：7是抗trop-2抗体中重链cdr2的氨基酸序列。seq id no：8是抗trop-2抗体中重链cdr3的氨基酸序列。序列表seq id no:1
–
抗trop-2抗体轻链氨基酸序列divmtqspdslavslgeratinckssqsllnsgtrknylawyqqkpgqppklliswassresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqaedvavyyckqsynlftfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvclnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec*
seq id no:2
–
抗trop-2抗体重链氨基酸序列qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgfsltsygvnwirqppgkglewigvmwaggstnynsalmsrltiskdtsknqfslklssvtaadtavyycardenwdgawfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqayicnvnhkpsntkvdkkvgpkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiertiskakgqprepqvytlppsrdelaknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk*seq id no:3
–
抗trop-2抗体轻链cdr1氨基酸序列kssqsllnsgtrknylaseq id no:4
–
抗trop-2抗体轻链cdr2氨基酸序列wassresseq id no:5
–
抗trop-2抗体轻链cdr3氨基酸序列kqsynlftseq id no:6
–
抗trop-2抗体重链cdr1氨基酸序列sygvnseq id no:7
–
抗trop-2抗体重链cdr2氨基酸序列vmwaggstnynsalmsseq id no:8
–
抗trop-2抗体重链cdr3氨基酸序列denwdgawfay

技术特征：
1.一种抗体药物偶联物(adc)，包含一个抗体通过化学键连接至如下式(i)表示的美登醇衍生物或美登醇类似物：[mayo-l-]x-ab (i)其中x为约1至约10；ab是抗体或其抗原结合片段；其中mayo是美登醇或美登醇类似物；l是包含下式表示的n-甲基丙氨酸部分的二价连接子：其中*表示与mayo的连接点，**表示与ab的连接点；y选自其中m为0-8，n＝2-12。2.如权利要求1所述的一种具有式i的adc，其中抗体能够结合的肿瘤相关抗原选自trop-2、her2、her3、her4、egf、egfr、cd2、cd3、cd5、cd7、cd13、cd19、cd20、cd21、cd23、cd30、cd33、cd34、cd38、cd46、cd55、cd59、cd69、cd70、cd71、cd97、cd117、cd123、cd127、cd134、cd137、cd138、cd146、cd147、cd152、cd154、cd174、cd195、cd200、cd205、cd212、cd223、cd227、cd253、cd272、cd274、cd276、cd278、cd279、cd309、cd319、cd326、cd340、dr6、kv1.3、5e10、muc1、upa、mage3、muc16、klk3、k-ras、间皮素、p53、生存素、g250、psma、内质素、bcma、gpnmb、epha2、ephb2、tmeff2、整合素beta 6、5t4、ca9、igf-1r、axl、b7h3、b7h4、cdh6、havcr1、steap-1、steap-2、upk2和cldn18。3.如权利要求1所述的一种具有式i的adc，其中ab是抗trop-2抗体或trop-2结合片段。4.一种如下式(ii)表示的衍生的美登醇或美登醇类似物：mayo-l'(ii)其中mayo是美登醇或美登醇类似物，l'是包含下式表示的n-甲基丙氨酸部分的二价连
接子：其中*表示与mayo的连接点；y'包含可与抗体连接的官能团。5.如权利要求4所属的一种式ii中的美登醇或美登醇类似物，y'包括吡咯啉-二酮。6.如权利要求4所述的一种式ii中的美登醇或美登醇类似物，y'选自m为0至8；n为2到12。7.一种如下式(vi)表示的美登醇衍生物或美登醇类似物残基：mayo-l 2'(vi)其中mayo是美登醇或美登醇类似物，l 2'是由下式表示的二价连接子：*-c(＝o)ry”，其中*表示与mayo的连接点；r是3-7元杂环基、芳基或环状烷基环；和y”包含可以连接于抗体的官能团。8.一种抗体药物偶联物(adc)，包含一个抗体通过化学键连接至下式(vii)表示的美登醇衍生物或美登醇类似物残基：[mayo-l 2-]x-ab (vii)其中x为约1至约10；ab是抗体或其抗原结合片段；其中mayo是美登醇或美登醇类似物；
l 2是由下式表示的二价连接子：*-c(＝o)ry
”‑
**，其中*表示与mayo的连接点，**表示与ab的连接点；r是3-7元杂环基、芳基或环状烷基环；而y”包含可以连接于抗体的官能团。9.如权利要求8所述的一种式vii的adc，其中ab能够结合的肿瘤相关抗原选自trop-2、her2、her3、her4、egf、egfr、cd2、cd3、cd5、cd7的肿瘤相关抗原(taa)、cd13、cd19、cd20、cd21、cd23、cd30、cd33、cd34、cd38、cd46、cd55、cd59、cd69、cd70、cd71、cd97、cd117、cd123、cd127、cd134、cd137、cd138、cd146、cd147、cd152、cd154、cd174、cd195、cd200、cd205、cd212、cd223、cd227、cd253、cd272、cd274、cd276、cd278、cd279、cd309、cd319、cd326、cd340、dr6、kv1.3、5e10、muc1、upa、mage3,muc16,klk3,k-ras,mesothelin,p53,survivin,g250,psma,endoplasmin,bcma,gpnmb,epha2,ephb2,tmeff2,integrin beta 6,5t4,ca9,igf-1r,axl,b7h3,b7h4,cdh6、havcr1、steap-1、steap-2、upk2和cldn18。10.如权利要求8所述的一种式vii的一种adc，其中ab是抗trop-2抗体或其结合片段。11.如根据权利要求8所述的一种式vii的adc，其中l 2是的二价连接子选自：2是的二价连接子选自：其中m＝0-3；和n＝2-12。12.如权利要求8所述的一种式vii的adc，其中l 2包括吡咯啉二酮。13.如权利要求7所述的一种式vi的美登醇或美登醇类似物，其中l 2'是具有式(viii)的连接子：
其中n＝2-12。14.如权利要求7所述的一种式vi的美登醇或美登醇类似物，其中l 2'是具有式(ix)的连接子：其中n＝2-12。15.如权利要求7所述的一种式vi的美登醇或美登醇类似物，其中l 2'是具有式(x)的连接子：其中m＝0-3，n＝2-12。16.如权利要求8所述的一种式vii的adc，l 2是不可切割的连接子。17.如权利要求8所述的一种式vii的adc，其中杂环选自饱和或不饱和的4-6元含氮杂环。18.一种药物组合物，包含权利要求1-3、8-12和16-17中任一项所述的adc。19.一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用如权利要求18所述的药物组合物。20.一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用如权利要求18所述的药物组合物以及选自下列的第二种疗法：细胞毒性化学疗法、免疫疗法、靶向小分子激酶抑制剂疗法、手术、放射疗法、干细胞移植、细胞疗法，包括car-t、car-nk、ips诱导的car-t或ips诱导的car-nk和疫苗，如bacille calmette-guerine(bcg)，有可能当共同施用adc药物和免疫疗法时会存在协同作用。21.如权利要求19-20中任一项所述的方法，其中所述癌症选自胰腺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、白血病、骨髓增生异常综合征、肺癌、前列腺癌、脑癌、膀胱癌、头颈癌和横纹肌肉瘤。22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有耐药性或难治性癌症。23.一种选自bi-p203、bi-p204、bi-p205、bi-p206、bi-p207、bi-p208、bi-p209、bi-p210和bi-p211的化合物。24.一种制备抗体药物偶联物的方法，包括选自化合物bi-p203、bi-p204、bi-p205、bi-p206、bi-p207、bi-p208、bi-p209、bi-p210、bi-p211与抗体偶联，从而获得抗体药物偶联物。

技术总结
本发明描述了新的类美登素和安丝菌素衍生物及其有效载荷的制备方法，该有效载荷含有能与细胞结合剂偶联的官能团的连接子，用以制备细胞毒性药物偶联物的。本发明还涉及与结合肿瘤相关抗原(TAA)的抗体偶联的抗体药物偶联物、制备方法、药物组合物及其用于治疗癌症的用途。与SMCC-DM1相比，类美登素衍生物药物有效载荷连接子显示出提升的溶解度，聚集率降低。与抗Trop-2-SMCC-DM1或抗Trop-2-vc-MMAE ADC相比，由美登素类药物衍生物有效载荷连接子和抗Trop-2抗体偶联得到的抗体药物偶联物(例如，抗Trop-2-BI-P203)对Trop-2高表达肿瘤具有更高或同等效力，对低抗原表达细胞或无抗原表达细胞显示更差的药效，表明治疗窗口增加。本文还提供了与使用新型ADC治疗癌症和免疫疾病中的抗原阳性细胞有关的方法。疫疾病中的抗原阳性细胞有关的方法。疫疾病中的抗原阳性细胞有关的方法。


技术研发人员：刘定国 包海峰 袁炜
受保护的技术使用者：博泰康医药公司
技术研发日：2021.07.02
技术公布日：2023/7/7