一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法与流程

1.本发明涉及一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，属于生物
技术领域：
：。2.背景研究3.黄原胶又称黄胶、汉生胶，是一种由纯培养的野油菜黄单孢菌分泌到胞外的水溶性多糖。黄原胶酶水解黄原胶生成的黄原胶寡糖，是一种潜在的可商业化的功能性寡糖。黄原胶寡糖具有清除羟基自由基的功能，激活因子的活性，以及抑菌活性。同时，黄原胶寡糖在农业、食品、医药等方面具有广泛的应用。4.降解黄原胶的方法包括物理法、化学法、生物法。物理法降解黄原胶需要较多的仪器设备。化学法降解黄原胶会对破坏黄原胶的活性基团，对环境也有影响。生物法是一种对环境友好的方法，绿色环保。5.黄原胶主链与纤维素相似，由β-1,4糖苷键相连的葡萄糖构成，侧链由甘露糖、葡萄糖、甘露糖三个相连的单糖构成。黄原胶的二级结构是侧链绕主链骨架反向缠绕，通过氢键维系形成棒状双螺旋结构，具有极强的稳定性。在常温条件下，黄原胶的结构非常的致密，酶的可及性低。在高温的条件下，黄原胶的结构会发生变化，会从有序的双螺旋构象变为单螺旋构象，酶的可及性提高，更有利于水解黄原胶。技术实现要素：6.本发明为了高效制备黄原胶寡糖，利用耐热纤维素酶切割黄原胶。在高温条件下，黄原胶的结构变的疏散，提高酶对黄原胶的切割效率，生成更多的黄原胶寡糖。同时，高温条件更有利于工业生产。7.本发明发现了一种耐高温的纤维素酶cel12e，在高温条件下能有效的切割黄原胶，切割效率高。耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶的酶活为568±1.69u/g，是常温黄原胶酶mixen的9倍，是耐热纤维素酶cel8a的5.6倍，如图2所示。8.本发明发现的耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶的最适温度为90℃，温度稳定的范围非常广泛，在90℃的条件下有80％以上的活性，如图3所示。本发明发现的耐热纤维素酶cel12e降解黄原胶生成的黄原胶寡糖含量较高，如图6所示。附图说明9.图1是本发明的耐热纤维素酶cel12e的sds-page电泳图，其中泳道1为空载，泳道2位粗酶液，泳道3为纯化后的cel12e，m为marker蛋白。10.图2是黄原胶酶mixen、耐热纤维素酶cel8a、耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶的酶活对比图。11.图3是耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。12.图4是黄原胶酶mixen作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。13.图5是耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶的最适温度、温度稳定性表征。14.图6是原始黄原胶，黄原胶酶mixen、耐热纤维素酶cel8a、耐热纤维素酶cel12e降解黄原胶生成黄原胶寡糖的液相色谱图。15.在高温条件下，耐热纤维素酶cel12e能有效的切割黄原胶，切割效率高。具体实施方式16.下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。17.实施例1：18.一种利用耐热纤维素酶cel12e降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，包括如下步骤：19.(1)通过基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司全基因合成了含有耐热纤维素酶cel12e的甘油菌，耐热纤维素酶cel12e的基因序列来源于文献(benediktl,simonh,angela,etal.functionalscreeningofhydrolyticactivitiesrevealsanextremelythermostablecellulasefromadeep-seaarchaeon[j].frontiersinbioengineeringandbiotechnology,2015,3.)，将含有耐热纤维素酶cel12e的基因片段导入大肠杆菌中；[0020](2)培养含有耐热纤维素酶基因的大肠杆菌；[0021](3)将步骤(2)所得的大肠杆菌菌液离心弃上清，保留沉淀菌体，沉淀菌体依次用去离子水和缓冲液清洗，利用细胞破碎仪破碎菌体，破碎后离心取上清，上清即为耐热纤维素酶cel12e的粗酶液；[0022](4)将步骤(3)所得的粗酶液进行ni柱(生工生物工程(上海)股份有限公司家的6ml的ni-nta6ff琼脂糖纯化树脂填料)结合并纯化，最终得到纯化的耐热纤维素酶cel12e；[0023](5)将步骤(4)所得的纯化后的蛋白透析到缓冲溶液中；[0024](6)将步骤(5)所得的纯化后的耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶底物，检测酶活；[0025](7)将步骤(5)所得的纯化后的耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶底物，进行最适温度、温度稳定性的测定；[0026](8)在步骤(7)的条件下，将耐热纤维素酶cel12e与黄原胶底物反应一段时间，将反应液煮沸，离心取上清，上清即为黄原胶寡糖；[0027](9)将步骤(8)得到的黄原胶寡糖进行液相色谱的分析。[0028]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中耐热纤维素酶cel12e导入大肠杆菌的方法包括如下步骤：[0029]a、将全基因合成的甘油菌在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素抗性的lb固体培养基平板中进行划线，放在37℃培养箱中，培养12h；[0030]b、先在10mllb(于水中的质量浓度：0.5％nacl1％蛋白胨1％酵母浸粉)液体培养基中加入10μl终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，再挑单菌落到液体培养基中，200rpm，37℃摇床培养12h；[0031]c、质粒提取：1)在室温下，取8ml过夜培养的菌液，在8,000g，2min条件下进行离心，倒掉上清；2)在沉淀中加入250μlbufferp1(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，b518191，100次)，悬浮菌体；3)加入250μlbufferp2(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，100次)，立即温和颠倒离心管混匀，室温静置2min，使细胞裂解完全；4)加入350μlbufferp3(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，b518191，100次)，轻柔地上下颠倒混匀，液体呈现白色絮状，12,000g，10min离心，；5)将上清液用移液枪吸入到质粒提取柱(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，b518191，100次)，8,000g，离心30s，倒掉收集的液体；6)向质粒提取柱中加入500μlwashbuffer(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，b518191，100次)，9,000g，离心30s，倒掉收集的液体；7)再向质粒提取柱加入500μlwashbuffer，9,000g，离心30s，倒掉收集的液体；8)将上述步骤7)的质粒提取柱转移到干净的1.5ml离心管中，9,000g，离心1min，；9)室温下打开离心管的盖子，静置10min，使吸附柱上的乙醇充分挥发；10)在吸附柱膜上均匀加入80μlelutionbuffer(来自生工生物工程(上海)股份有限公司质粒提取试剂盒，b518191，100次),55℃温浴5min，9,000g，离心1min，收集液体质粒；[0032]d、将步骤c提取的质粒加入到热转的大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，在冰上放置15min，将其在42℃水浴锅中放置60s，并迅速转至冰上10min，热转结束后，向其中加入800μllb液体培养基，于37℃，200rpm摇床中培养45min，取80μl转化液涂布在含终浓度为100μg/mlamp抗性的lb固体培养表面，37℃培养箱中培养12h，挑单菌落到10mllb液体培养基中，37℃，200rpm培养12h。取700μl的菌液加入300μl的60％甘油，制作甘油菌保存菌种。[0033]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中将步骤(1)得到的含有耐热纤维素酶cel12e基因的大肠杆菌进行培养的方法包括如下步骤：[0034]a、将-80℃冻存的含有耐热纤维酶cel12e基因大肠杆菌于10mllb(于水中的质量浓度：0.5％nacl1％蛋白胨1％酵母浸粉)ph7.0含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素固态平板上划线培养，在37℃培养箱中培养12h；[0035]b、挑取单菌落于10mllb液体培养基中，37℃200rpm摇床中培养12h得到菌液；[0036]c、将菌液扩培至500mlllb(于水中的质量浓度：0.5％nacl、1％蛋白胨、0.5％酵母浸粉)ph7.0液体培养基中，在37℃200rpm摇床中培养1.5h，其中菌液和llb培养基的体积比例为1:50；[0037]d、扩培结束后，在500ml的菌液中加入500μl终浓度为1m的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导剂，放入37℃200rpm摇床中诱导4h。进一步地，上述技术方案中，所述步骤(3)中将步骤(2)得到的含有耐热纤维素酶cel12e基因的大肠杆菌进行收菌破碎得到粗酶的方法包括如下步骤：[0038]a、先将tgl-21离心机进行4℃预冷，将菌液放入250ml的离心杯中，菌液体积不能超过离心杯容积的2/3，配平；[0039]b、在4℃条件下，8000rpm，离心5min，倒掉上清，保留沉淀的菌体；[0040]c、将步骤b得到的沉淀菌体用50ml去离子水进行重悬，8000rpm，离心5min，倒掉上清，保留沉淀的菌体；[0041]d、将步骤c得到的沉淀菌体用50mlph＝8的缓冲溶液bindingbuffer(配方为：于水中，500mmnacl、50mmnah2po42h2o)进行重悬，8000rpm，离心5min，倒掉上清，保留沉淀的菌体；[0042]e、将清洗后的菌体进行破碎，将步骤d离心得到的沉淀菌体用30mlph＝8的缓冲溶液bindingbuffer重悬；[0043]f、利用超声破碎仪对菌液进行破碎，功率为550w，在超声5s停2s的交替操作条件下，破碎20min；[0044]g、破碎完成后使用tgl-21离心机10000rpm，4℃，离心20min，取上清，上清即为粗酶。[0045]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(4)中将步骤(3)得到的粗酶与ni柱结合纯化的方法包括如下步骤：[0046]a、将粗酶蛋白先过孔径0.45μm的滤膜，除去杂质，保留过膜后的蛋白；[0047]b、蛋白进行循环上样，ni柱(生工生物工程(上海)股份有限公司家的6ml的ni-nta6ff琼脂糖纯化树脂填料)一端进蛋白，另一端接收蛋白，流速为0.8ml/min，蛋白循环进样3次，使蛋白与ni柱充分结合；[0048]c、蛋白与ni柱充分结合后，将ni柱连接到aktra蛋白纯化仪器上，对粗酶进行纯化；[0049]d、先用ph＝8bindingbuffer(配方为：于水中，500mmnacl、50mmnah2po42h2o))缓冲液冲洗蛋白，流速为2ml/min，在显示器中有峰出现，峰出现后，冲平基线，等到基线平稳后再冲20min；[0050]e、再用ph＝8washbuffer(配方为：于水中，500mmnacl、50mmnah2po42h2o、30mm咪唑)缓冲液冲洗蛋白，流速为2ml/min，峰出现后，冲平基线，等到基线平稳后再冲20min；[0051]f、最后用ph＝8elutionbuffer(配方为：于水中，500mmnacl、50mmnah2po42h2o、250mm咪唑)缓冲液冲洗，流速为2ml/min，在显示器中有峰出现，收集整个峰，该峰为目的蛋白，将目的蛋白放置在冰上，等到基线平稳后再冲20min；[0052]g、将得到的目的蛋白进行sds-page电泳检测，如图1所示，m泳道为蛋白marker，1泳道为空载，2泳道为粗酶，3泳道为纯化后的蛋白，蛋白的大小约为59kda；[0053]h、纯化结束后，用过0.22μm滤膜的去离子水冲洗ni柱，20min，流速为2ml/min；[0054]i、再用过0.22μm滤膜的体积浓度20％无水乙醇冲洗ni柱，20min，流速为2ml/min，ni柱要用保存在过0.22μm滤膜的体积浓度20％无水乙醇中，纯化结束。[0055]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(5)中将步骤(4)所得的目的蛋白进行透析的方法包括如下步骤：[0056]a、采用孔径3500d的透析袋进行透析；[0057]b、将蛋白放入到透析袋中，透析袋置于缓冲溶液(ph＝5.550mmnah2po412h2o、50mmk2hpo4)中，蛋白和缓冲溶液的体积比例为1:50；[0058]c、将其放在4℃冰箱中进行透析；[0059]d、隔2h、4h、10h将含有蛋白的透析袋转移放入到新的透析液中(同体积的上述缓冲溶液)于4℃进行透析。[0060]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(6)中将步骤(5)所得的目的蛋白检测酶活的方法包括如下步骤：[0061]酶活定义：酶反应体系中每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量为1u。[0062]a、称取0.02g的黄原胶溶于40ml的去离子水中，得到2mg/ml的黄原胶底物；[0063]b、将上述步骤(5)得到的透析后的蛋白稀释至0.1mg/ml。将稀释后的蛋白分成两份，一份用作实验组，一份用作对照组。实验组的蛋白放在冰上待用，实验组对应的黄原胶底物放入90℃水浴锅中，预热15min；[0064]对照组的蛋白煮沸2h，灭活蛋白，蛋白灭活好后，10000g离心10min，取上清，然后放在冰上待用；对照组对应的黄原胶底物放入90℃水浴锅中，预热15min。其中，所述实验组对应的黄原胶底物和对照组对应的黄原胶底物均为步骤a制备得到的黄原胶底物；[0065]c、取100μl实验组的蛋白加入至步骤b所述预热好的实验组对应的100μl2mg/ml的黄原胶底物中，用混匀仪充分混匀，然后用离心机2000g离心两秒，最后放入90℃水浴锅中反应20min；[0066]d、向步骤b所述对照组的2mg/ml的黄原胶底物中加入100μl灭活好的蛋白，混匀，然后用离心机2000g离心两秒，最后放入90℃水浴锅中反应20min；将反应结束后的实验组与对照组从水浴锅中取出，移至冰上，放置10min以终止反应；分别向实验组和对照组中加入200μl冰冷(0-4℃)的0.971mg/ml的2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(bca)溶液，充分混匀。最后放入75℃水浴锅中，显色反应30min；[0067]e、30min显色反应结束后，将实验组与对照组取出，分别用离心机2000g离心2s。取200μl上清液加入到96孔板中，在od562下测其od值，代入标准曲线(取200μl0-100μmol/l不同浓度的葡萄糖溶液与200μlbca溶液液加入到2ml离心管中，颠倒混匀，75℃反应30min。吸取200μl反应液于96孔板中，用酶标仪在od562处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制还原糖含量标准曲线，r2须大于0.999)中，得到还原糖浓度，根据酶活公式计算其酶活。结果如图2所示，耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶底物的酶活为568±1.69u/g。[0068]酶活公式：[0069]还原糖浓度：通过2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(bca)溶液测定还原糖的浓度，单位为μmol/l；[0070]反应体积：蛋白与底物的总体积，单位为ml；[0071]蛋白浓度：酶反应时蛋白的浓度，单位为mg/ml；[0072]蛋白体积：酶反应时蛋白的体积，单位为ml；[0073]时间：酶反应时间，单位为min。[0074]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(7)中将步骤(5)所得的目的蛋白的最适反应温度测定的方法包括如下步骤：[0075]a、通过上述步骤(5)获得纯化透析后的蛋白；[0076]b、将蛋白等分成2份，一部分蛋白放在冰上待用，作为实验组；另一部分蛋白煮沸2h，离心去上清，作为对照组；将实验组和对照组的底物等分成8份，8份一一对应地放在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的不同水浴锅中预热15min；[0077]c、分别将100μl实验组和100μl对照组的蛋白加入到100μl的2mg/ml黄原胶底物中，混匀，实验组和对照组分别有3个平行样(3个平行样的结果取数学平均值)；[0078]d、实验组和对照组的酶和底物分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃不同的条件(实验组反应温度与上述实验组的底物预热温度一一相对应且相匹配)下反应20min；[0079]e、将反应好的实验组与对照组从水浴锅中取出，移至冰上放置10min，终止反应；[0080]f、迅速向实验组和对照组中分别加入200μl冰冷(0-4℃)的bca溶液，充分混匀。最后放入75℃水浴锅中，显色反应30min；[0081]g、30min显色反应结束后，将在不同温度下进行反应的实验组与对照组取出，分别用离心机2000g离心2s。分别取200μl反应液加入到96孔板中，在od562下测其od值并计算在不同温度下的相对酶活，绘制折线图。如图3所示，横坐标为温度，纵坐标为相对酶活，●表示耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶的最适温度曲线，结果可以看到，耐热纤维素酶cel12e的最适温度为90℃。[0082]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(7)中将步骤(5)所得的目的蛋白温度稳定性测定方法包括如下步骤：[0083]a、通过上述步骤(5)获得纯化透析后的蛋白；[0084]b、将蛋白等分成2份，一部分蛋白放在冰上待用，作为实验组，另一部分蛋白煮沸2h，离心去上清，作为对照组；实验组和对照组的底物等分成8份，8份一一对应地放在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的不同水浴锅中预热15min；[0085]c、将等分的实验组和对照组蛋白分别一一对应在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的不同条件下孵育2h；[0086]d、分别将孵育好的100μl实验组和100μl对照组的蛋白分别加入到100μl的2mg/ml黄原胶底物(实验组蛋白孵育温度与上述实验组的底物预热温度一一相对应且相匹配)中，混匀，实验组和对照组分别有3个平行样(3个平行样的结果取数学平均值)；[0087]e、酶和底物分别在90℃的条件下反应20min；[0088]f、将反应好的实验组与对照组从水浴锅中取出，移至冰上放置10min，以终止反应；[0089]g、向实验组和对照组中分别加入200μl冰冷(0-4℃)的bca溶液，充分混匀。最后放入75℃水浴锅中，显色反应30min；[0090]h、30min反应结束后，将在不同温度下进行酶反应的实验组与对照组取出，分别用离心机2000g，离心2s。分别取200μl反应液加入到96孔板中，在od562下测其od值并计算在不同温度下的相对酶活，绘制折线图。如图3所示，横坐标为温度，纵坐标为相对酶活，■表示耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶的温度稳定性曲线，结果可以看到，耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶在较宽的温度范围(30℃-100℃)内具有较高的活性和稳定性。进一步地，上述技术方案中，所述步骤(8)中将步骤(5)所得的目的蛋白制备黄原胶寡糖的方法包括如下步骤：[0091]a、将500μl0.5mg/ml的黄原胶底物在蛋白的最适温度90℃条件下温育20min；[0092]b、将1ml0.5mg/ml的纯化透析后的耐热纤维素酶cel12e加入到黄原胶底物中，反应30min；[0093]c、酶反应结束后，将反应产物在沸水浴中煮沸30min，为了除去未反应的蛋白；[0094]d、将反应液10000g离心20min，取上清液，上清液即为黄原胶寡糖。进一步地，上述技术方案中，所述步骤(9)中将步骤(8)所得的黄原胶寡糖进行液相色谱的分析方法包括如下步骤：[0095]a、将酶反应后的黄原胶寡糖使用安捷伦lc1260(g4260b)配备elsd检测器对黄原胶寡糖进行分析；[0096]b、色谱柱条件：acchromxamide(5μm100a，4.6mm×250mm)；[0097]c、分析条件：流速1.0ml/min，进样量20μl，柱温35℃；[0098]d、检测器条件：漂移管温度(80℃)，雾化器温度(60℃)，氮气流速(1.60slm)，led强度(100％)；[0099]e、洗脱方法为线性梯度洗脱，具体方法见下表。[0100]高效液相色谱线性梯度洗脱方法(v/v)[0101]f、耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶生成的黄原胶寡糖的液相色谱。结果如图6所示，横坐标为时间，纵坐标为响应值。在图中可以看到7.5min和15min左右有峰出现。[0102]综上所述，如图3所示，该耐热纤维素酶cel12e在温度为90℃的条件下酶的活性最佳，在较宽的温度范围(30℃-100℃)内具有较高的活性和稳定性。如图2所示，该酶在最适的反应体系中，作用于黄原胶的酶活为568±1.69u/g，是常温黄原胶内切酶mixen的9倍，是耐热纤维素酶cel8a的5.6倍，可以看出耐热纤维素酶cel12e对黄原胶有着较高的降解效率，因此可以证明其能够很好的切割黄原胶主链。根据液相色谱，该耐热纤维素酶cel12e能产生较多的黄原胶寡糖。如图6所示，原始的黄原胶是没有寡糖峰出现的，添加耐热纤维素酶cel12e后，观察到在7.5min和15min出现寡糖峰，在15min左右的寡糖峰信号值比黄原胶内切酶mixen和耐热纤维酶cel8a的信号值要强，说明在高温条件下，黄原胶的结构打开，提高了酶与黄原胶的结合能力，进而增加了酶对黄原胶的可及性，从而提高寡糖产量。[0103]对比例1[0104]一种利用黄原胶内切酶mixen降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，包括如下步骤：[0105](1)培养含有黄原胶内切酶mixen[(孙杰.microbacteriumsp.xt11中黄原胶内切酶mixen酶学性质的研究[d].大连工业大学,2019.doi:10.26992/d.cnki.gdlqc.2019.000007.)的大肠杆菌；[0106](2)将步骤(1)所得的菌液离心取上清，沉淀用水和缓冲液冲洗，在利用细胞破碎仪进行破碎，破碎后离心取上清，上清即为耐热纤维素酶的粗酶液；[0107](3)将步骤(2)所得的粗酶液进行ni柱(生工生物工程(上海)股份有限公司家的6ml的ni-nta6ff琼脂糖纯化树脂填料)结合纯化，得到纯化的黄原胶内切酶mixen；[0108](4)将步骤(3)所得的纯化后的蛋白透析到缓冲溶液中；[0109](5)将步骤(4)所得的纯化后的黄原胶内切酶mixen作用于黄原胶底物，检测酶活；[0110](6)将步骤(4)所得的纯化后的黄原胶内切酶mixen作用于黄原胶底物，进行最适温度、温度稳定性的测定；[0111](7)在步骤(6)的条件下，将耐热纤维素酶与黄原胶底物反应一段时间后，将反应液煮沸后离心，取上清，上清液即为黄原胶寡糖；[0112](8)对(7)得到的黄原胶寡糖进行液相色谱的分析。[0113]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)得到的含有黄原胶内切酶mixen的大肠杆菌进行培养的方法包括如下步骤：[0114]黄原胶内切酶mixen的抗性为终浓度为30μg/ml的卡那霉素，在10ml的lb培养基中加入3μl终浓度为30μg/ml的卡那霉素抗生素，黄原胶内切酶mixen的诱导条件为16℃，16h，除了抗生素种类不同和诱导温度时间不同，其余步骤与实施例1中的步骤(2)中的步骤a、b、c、d相同。进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中将步骤(1)得到的含有黄原胶内切酶mixen的大肠杆菌进行收菌破碎得到粗酶的方法包括如下步骤：[0115]黄原胶内切酶mixen先用去离子水清洗菌体，再用nbb缓冲溶液清洗菌体，其余步骤与实施例1中的步骤(3)中的步骤a、b、c、d、e、f、g相同。[0116]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(3)中将步骤(2)的粗酶与ni柱结合纯化的方法包括如下步骤：[0117]a、黄原胶内切酶mixen与ni柱结合的方式是将蛋白通过超滤浓缩至20mg；[0118]b、依次用0.1medta(ph8.0)，ddh2o，0.5mnaoh，ddh2o，0.1mnicl2，ddh2o冲洗ni柱。然后，用100mlnbb平衡填料；[0119]c、打开纯化柱的上部，缓慢将填料柱表面的缓冲液吸出至填料上表面即将露出，沿着纯化柱内壁用枪头缓慢均匀加入约20mg(体积＜2ml)细胞破碎上清，再次打开纯化柱下部，待破碎上清完全进入填料中以后，室温结合2h；[0120]d、其余纯化步骤与实施例1中步骤(4)中步骤c、d、e、f、g、h、i的相同。[0121]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(4)中将步骤(3)所得的目的蛋白进行透析的方法包括如下步骤：[0122]黄原胶内切酶mixen利用10mmph7.5pb缓冲液进行透析置换缓冲液，其余步骤与实施例1中的步骤(5)中的步骤a、b、c、d、e、f、g相同。[0123]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(5)中将步骤(4)所得的目的蛋白检测内切酶酶活力方法包括如下步骤：[0124]黄原胶内切酶mixen检测酶活的方式与实施例1中步骤(6)中步骤a、b、c、d、e、f、g、h。结果如图2所示，黄原胶内切酶mixen作用于黄原胶底物的酶活为63.85±0.57u/g。[0125]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(6)中将步骤(4)所得的目的蛋白的最适反应温度测定的方法包括如下步骤：[0126]黄原胶内切酶mixen分别在20℃-70℃条件下反应20min，其余步骤与实施例1中步骤(7)中步骤a、b、c、d、e、f、g。结果如图4所示，横坐标为温度，纵坐标为相对酶活，●表示黄原胶内切酶mixen作用于黄原胶的最适温度曲线，结果可以看到，黄原胶内切酶mixen的最适温度为40℃。[0127]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(6)中将步骤(4)所得的目的蛋白的温度稳定性测定方法包括如下步骤：[0128]黄原胶内切酶mixen分别在20℃-70℃条件下孵育30min，其余步骤与实施例1中步骤(7)中步骤a、b、c、d、e、f、g。结果如图4所示，横坐标为温度，纵坐标为相对酶活，■表示黄原胶内切酶mixen作用于黄原胶的温度稳定性曲线，结果可以看到，黄原胶内切酶mixen作用于黄原胶在温度范围(20℃-45℃)内具有较高的活性和稳定性。[0129]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(7)中将步骤(4)所得的目的蛋白制备黄原胶寡糖的方法包括如下步骤：[0130]黄原胶内切酶mixen作用于黄原胶制备黄原胶寡糖的步骤与实施例1中步骤(8)中步骤a、b、c、d相同。[0131]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(8)中将步骤(7)所得的黄原胶寡糖进行液相色谱分析方法包括如下步骤：[0132]黄原胶内切酶mixen作用于黄原胶生成黄原胶寡糖的液相色谱分析的步骤与实施例1中步骤(9)中步骤a、b、c、d、e相同。结果如图6所示，横坐标为时间，纵坐标为响应值。在图中可以看到8min和17min左右有峰出现。[0133]综上所述，如图2所示，黄原胶酶mixen的酶活为63.85±0.57u/g。耐热黄原胶酶cel12e的酶活与常温的黄原胶酶mixen比，耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶的酶活是mixen的9倍。耐热纤维素酶cel12e能更好的作用于黄原胶。在高温条件下黄原胶的结构打开，酶的可及性提高。如图4所示，黄原胶酶mixen的最适温度为40℃。温度升至70℃，黄原胶酶mixen的酶活降低到最高酶活的20％，而耐热纤维素酶cel12e具有80％以上的活性。黄原胶酶mixen在一系列温度条件下温育30min，黄原胶酶mixen在20-55℃时酶活较稳定。黄原胶酶mixen的温度稳定范围没有耐热纤维素酶cel12e的广泛。根据液相色谱，如图6所示，黄原胶酶mixen在7.5min和19min处有寡糖峰出现，有寡糖产生，但没有耐热纤维素酶cel12e的寡糖峰高。[0134]对比例2[0135]一种利用耐热纤维素酶cel8a降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，包括如下步骤：[0136](1)全基因合成了含有耐热纤维素酶的甘油菌，将含有耐热纤维素酶cel8a(纤维素酶ctcel8a的异源表达及其降解黄原胶性能.大连工业大学学报,2021,40(02):79-84.)的基因片段导入大肠杆菌中；[0137](2)培养含有耐热纤维酶基因的大肠杆菌；[0138](3)将步骤(2)所得的菌液离心取上清，沉淀用水和缓冲液冲洗，在利用细胞破碎仪进行破碎，破碎后离心取上清，上清即为耐热纤维素酶cel8a的粗酶液；[0139](4)将步骤(3)所得的粗酶液进行ni柱(生工生物工程公司家的6ml的ni柱填料)结合纯化，得到耐热纤维素酶cel8a；[0140](5)将步骤(4)所得的纯化后的蛋白透析到缓冲溶液中；[0141](6)将步骤(5)所得的纯化后的耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶底物，检测酶活；[0142](7)将步骤(5)所得的纯化后的耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶底物，进行最适温度、温度稳定性的测定；[0143](8)在步骤(7)的条件下，将耐热纤维素酶cel8a与黄原胶底物反应一段时间后，将反应液煮沸后离心，取上清，上清液即为黄原胶寡糖；[0144](9)对步骤(8)得到的黄原胶寡糖进行液相色谱的分析。[0145]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(1)中耐热纤维素酶cel8a导入大肠杆菌的方法包括如下步骤：[0146]耐热纤维素酶cel8a的抗性是终浓度为30μg/ml的卡那霉素，其他步骤与实施例1中步骤(1)中步骤a、b、c、d相同。[0147]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(2)中将步骤(1)得到的含有耐热纤维素酶cel8a基因的大肠杆菌进行培养的方法包括如下步骤：[0148]耐热纤维素酶cel8a的抗性为终浓度为30μg/ml的卡那霉素，10ml的lb培养基中加入3μl终浓度为30μg/ml的卡那霉素抗生素，耐热纤维素酶cel8a的诱导条件为16℃，16h，其余步骤与实施例1中步骤(2)中步骤a、b、c、d相同。[0149]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(3)中将步骤(2)得到的含有耐热纤维素酶cel8a基因的大肠杆菌进行收菌破碎得到粗酶的方法包括如下步骤：[0150]耐热纤维素酶cel8a的步骤与实施例1中步骤(3)中步骤a、b、c、d、e、f、g相同。[0151]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(4)中将步骤(3)所得的粗酶与ni柱结合纯化的方法包括如下步骤：[0152]耐热纤维素酶cel8a的步骤与实施例1中步骤(4)中步骤a、b、c、d、e、f、g、h、i相同。[0153]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(5)中将步骤(4)所得的目的蛋白进行透析的方法包括如下步骤：[0154]耐热纤维素酶cel8a利用50mmph5.5naac-ha缓冲液进行透析置换缓冲液，其余步骤与实施例1中步骤(5)中步骤a、b、c、d相同。[0155]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(6)中将步骤(5)所得的目的蛋白检测酶活力方法包括如下步骤：[0156]耐热纤维素酶cel8a检测酶活的方式与实施例1中步骤(6)中步骤a、b、c、d、e、f、g、h相同。结果如图2所示，耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶底物的酶活为98.26±0.77u/g。[0157]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(7)中将步骤(5)所得的目的蛋白最适反应温度测定方法包括如下步骤：[0158]耐热纤维素酶cel8a分别在20℃-80℃条件下反应20min，其余步骤与实施例1中步骤(7)中步骤a、b、c、d、e、f、g相同。结果如图5所示，横坐标为温度，纵坐标为相对酶活，●表示耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶的最适温度曲线，结果可以看到，耐热纤维素酶cel8a的最适温度为70℃。[0159]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(7)中将步骤(5)所得的目的蛋白温度稳定性测定方法包括如下步骤：[0160]耐热纤维素酶cel8a分别在20℃-80℃条件下孵育1h，其余步骤与实实施例1中步骤(7)中步骤a、b、c、d、e、f、g。结果如图4所示，横坐标为温度，纵坐标为相对酶活，■表示耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶的温度稳定性曲线，结果可以看到，耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶在温度范围(20℃-70℃)内具有较高的活性和稳定性。[0161]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(8)中将步骤(5)所得的目的蛋白制备黄原胶寡糖的方法包括如下步骤：[0162]耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶生成黄原胶寡糖的方法与实施例1中步骤(8)中步骤a、b、c、d相同。[0163]进一步地，上述技术方案中，所述步骤(9)中将步骤(8)所得的黄原胶寡糖进行液相色谱分析方法包括如下步骤：[0164]耐热纤维素酶cel8a作用于黄原胶生成黄原胶寡糖的液相色谱分析的步骤与实施例1中步骤(7)中步骤a、b、c、d、e。结果如图6所示，横坐标为时间，纵坐标为响应值。在图中可以看到8min和17min左右有峰出现。[0165]综上所述，如图2所示，耐热纤维素酶cel8a的酶活为98.26±0.77u/g。耐热纤维素酶cel12e的酶活与耐热纤维素酶cel8a比，耐热纤维素酶cel12e作用于黄原胶的酶活是耐热纤维素酶cel8a的5.6倍。如图5所示，耐热纤维素酶cel8a的最适温度为70℃。在80℃的条件下，耐热纤维素酶cel8a的酶活降低到最高酶活的20％，而耐热纤维素酶cel12e具有90％以上的活性。耐热纤维素酶cel8a在一系列温度条件下温育1h后，耐热纤维素酶cel8a在20-70℃时酶活较稳定，但耐热纤维素酶cel8a的温度稳定范围没有耐热纤维素酶cel12e的广泛。根据液相色谱，如图6所示，耐热纤维素酶cel8a在7.5min和19min处有寡糖峰出现，有寡糖产生，但没有耐热纤维素酶cel12e的寡糖峰高。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，其特征在于：所述耐热纤维素酶为耐热纤维素酶cel12e。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：于黄原胶水溶液中加入耐热纤维素酶进行黄原胶降解制备黄原胶寡糖；其降解条件为：温度30-100℃，优选温度50-90℃，更优选80-90℃；时间10-30min，优选时间15-25min，更优选20-25min；耐热纤维素酶与黄原胶的质量比1:1-4:1，优选1:1-3:1，更优选1.5-2:1；黄原胶于水溶液中的浓度1-5mg/ml，优选2-4mg/ml，更优选2-2.5mg/ml。3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：用耐热纤维素酶cel12e在90℃条件下切割黄原胶可生成更多的黄原胶寡糖。

技术总结
本发明涉及一种利用耐热纤维素酶降解黄原胶制备黄原胶寡糖的方法，所述耐热纤维素酶为耐热纤维素酶Cel12E。在高温条件下能有效的切割黄原胶，切割效率高。切割效率高。切割效率高。


技术研发人员：杨帆 张丽伟 李宪臻
受保护的技术使用者：李宪臻
技术研发日：2023.05.12
技术公布日：2023/7/7