一种MDCK细胞无血清贴壁培养驯化的方法与流程

一种mdck细胞无血清贴壁培养驯化的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及一种用于生产生物制品的方法，具体为一种mdck细胞贴壁培养驯化的方法。


背景技术：

2.mdck细胞系是从犬肾组织中分离培养获得的上皮贴壁细胞，该细胞可以连续传代，可用于多种病毒的繁殖和纯化。近年来，大量研究表明，mdck细胞系可以替代鸡胚用于流感及禽流感病毒的监测、研究及其疫苗生产，主要用于mdck细胞无血清贴壁培养进行病毒扩增和纯化，特别是甲、乙型流感病毒疫苗的生产。
3.目前对mdck细胞进行无血清驯化的方法主要是逐步降血清法和一步降血清法，整个驯化周期长，驯化周期长达35周，且在降血清过程中会出现细胞结团等现象，无法支持高密度生长。
4.中国专利申请cn202010848242.1公开了mdck细胞系的悬浮培养驯化方法，先用含血清培养基贴壁培养mdck细胞，再经消化后，将所得细胞悬液置入摇瓶悬浮培养，传代3～4次后，将培养液离心，并使用化学限定培养基重悬细胞团，继续悬浮培养，传代至mdck细胞完全单个悬浮生长。该申请先将mdck贴壁细胞悬浮培养于含血清培养基中，在血清的支持下正常生长；然后去除血清将其悬浮培养于化学限定培养基中，从而获得全悬浮的mdck细胞。其在第二步化学限定培养基的培养过程中，所需要的化学限定培养基随便避免了动物源血清的使用，但其组分较多，配置较为复杂。
5.中国专利申请cn202010606522.1公开了一种全悬浮培养型mdck细胞系的驯化方法，通过将贴壁型mdck细胞驯化为低血清全悬浮培养型mdck细胞系以及无血清全悬浮培养型mdck细胞系，步骤二、复苏一支贴壁培养型mdck细胞，用步骤一所述含12％胎牛血清的dmem-f12-rpmi1640进行接种培养，按照常规方法传代培养2-3代；步骤三、将步骤二所获得的贴壁培养型mdck细胞分别用含胎牛血清8％、5％、3％的dmem f12-rpmi1640培养基依次各培养3代，得到了低血清贴壁培养型mdck细胞系；步骤五、用所述混合培养基3按1：3比例分瓶培养；连续传代五次后，驯化得到低血清全悬浮培养型mdck细胞系；步骤六、用无血清的dmem-f12-rpmi1640培养基将步骤五中最后一代低血清全悬浮培养型mdck细胞继续培养5-7代，驯化得到无血清全悬浮培养型mdck细胞系。该申请使用降血清培养法，mdck细胞系驯化成无血清全悬浮培养型mdck细胞系，但是其所需要的传代次数在20代以上，培养周期过长。
6.针对现有技术中对mdck细胞系的驯化，所需要的培养条件复杂，驯化周期较长的问题，本发明开发一套mdck无血清驯化平台，使用特定的培养基以及驯化培养条件，使mdck迅速适应无血清培养，进而生产禽流感病毒疫苗，是成为制备下一代安全有效、质量可控的流感疫苗的关键。


技术实现要素：

7.为实现上述目的，快速低成本地驯化出适应无血清培养的mdck细胞系，本发明采用的方案如下：
8.本发明第一个方面公开了一种mdck细胞贴壁培养降血清驯化方法，所驯化得到的mdck细胞可以适应在无血清培养基中培养；
9.驯化方法具体步骤如下：
10.s1：在含血清培养基中，将mdck细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s1中条件培养基中血清含量为1.5％，dmem培养含量为1.5％；
11.s2：待s1中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s2中条件培养基中血清含量为0.45％，dmem培养含量为0.45％；
12.s3：待s2中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s3中条件培养基中血清含量为0.135％，dmem培养含量为0.135％；
13.s4：待s3中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s4中条件培养基中血清含量为0.04％，dmem培养含量为0.04％；
14.s5：待s4中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s5中条件培养基中血清含量为0.012％，dmem培养含量为0.012％；
15.s6：待s5中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s6中条件培养基中血清含量为0.004％，dmem培养含量为0.004％；
16.s7：待s6中的细胞汇合度超过80％以上时，消化，收集细胞进行冻存，得到适应在无血清培养基中培养的mdck细胞。
17.本发明所称的“mdck”、mdck细胞或“mdck细胞系”具有相同的含义，包括来自自然界的野生型mdck，也包括通过人工手段将自然界中的mdck细胞中进行改造。比如：通过改造了细胞干扰素抗病毒应答能力，因此使得mdck细胞系具有更高的病毒扩增能力。通过驯化得到的新型细胞系同样保留了高产特性，还对病毒均有优秀的扩增能力，适用于大规模的流感疫苗生产中。
18.优选地，s1-s7中的mdck细胞培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度5％，静态贴壁培养。
19.优选地，s1-s7中的mdck细胞培养至细胞汇合度优选为80％-90％。
20.优选地，s1-s7中所述消化为利用胰酶溶液分散培养的mdck细胞。
21.更优选地，s7得到的mdck细胞冻存在90％am111+10％dmso的培养基中。
22.本发明第二个方面公开了在mdck细胞驯化前的预处理方法，s1所使用的mdck细胞在降血清驯化前先进行预处理，预处理方法具体步骤为：
23.a1：复苏在emem培养基中冻存的mdck细胞；
24.a2：待a1中的细胞汇合度达到80％以上时，消化后，将细胞传代至10％血清的dmem培养基进行驯化；
25.a3：待a2中的细胞汇合度达到80％以上时，消化后，将细胞传代至5％血清的dmem培养基进行驯化，并冻存细胞，得到预处理的mdck细胞。
26.优选地，a2-a3中消化的方法为为利用胰酶溶液分散培养的mdck细胞；a3中冻存细胞所采用的培养基为90％dmem(5％血清)+10％dmso。
27.与现有技术相比，本发明有如下有益效果：
28.本发明所公开mdck细胞降血清驯化方法，使用特定的培养基以及驯化培养条件，使得mdck细胞驯化时间在十代之内，即可以满足在无血清条件下的培养，进而利用驯化得到的mdck细胞生产禽流感病毒疫苗。
附图说明
29.图1为实施例2第一阶段10％fbs下mdck.stat1ko细胞镜检图。
30.图2为实施例2第二阶段0％fbs下mdck.stat1ko细胞镜检图。
31.图3为实施例2三个阶段下细胞培养的细胞密度图和细胞活力图。
具体实施方式
32.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
33.实施例1mdck.stat1ko细胞的驯化
34.细胞株：细胞株来源于atcc，细胞名称：mdck.stat1ko，atcc numbe：ccl-34-vhg
tm
，批号：70037292。冻存于含10％血清的emem培养基中。
35.本发明的技术方案经过降血清驯化，最终将mdck细胞驯化至无血清培养基am111中，并进行细胞冻存。细胞命名为：mdck ccl-34-vhg。
36.培养基：am111，具体物料信息如下：
37.物料信息厂家货号含量(g/l)am111dpm上海奥浦迈生物科技股份有限公司r202121417.86碳酸氢钠sigmas5761-100g1-4hypep1510kerry200707151-8
38.培养方式及驯化方法：温度37℃，二氧化碳浓度5％，静态贴壁培养，采用降血清驯化的方法，血清浓度在0％时添加30％的条件培养基，具体操作步骤如下：
39.步骤1：复苏在10％血清的emem培养基冻存的细胞mdck.stat1ko。
40.步骤2：待步骤1中的细胞汇合度达到80％时，消化、将细胞传代至10％血清的dmem培养基进行驯化。
41.步骤3：待步骤2中的细胞汇合度达到80％时，消化、将细胞传代至5％血清的dmem培养基进行驯化，并冻存细胞，冻存培养基为90％dmem(5％血清)+10％dmso。
42.步骤4：复苏步骤3中冻存的细胞。
43.步骤5：步骤4中的细胞汇合度超过80％时，消化、传代至70％am111(血清浓度0％)
+30％条件培养基(接种前收集的上清，含5％血清的dmem)本步骤血清含量约为1.5％，dmem培养含量约为1.5％。
44.步骤6：步骤5中的细胞汇合度超过80％时，消化、传代至70％am111(血清浓度0％)+30％条件培养基(接种前收集的上清，含1.5％血清的dmem)本步骤血清含量约为0.45％，dmem培养含量约为0.45％。
45.步骤7：步骤6中的细胞汇合度超过80％时，消化、传代至70％am111(血清浓度0％)+30％条件培养基(接种前收集的上清，含0.45％血清的dmem)本步骤血清含量约为0.135％，dmem培养含量约为0.135％。
46.步骤8：步骤7中的细胞汇合度超过80％时，消化、传代至70％am111(血清浓度0％)+30％条件培养基(接种前收集的上清，含0.135％血清的dmem)本步骤血清含量约为0.04％，dmem培养含量约为0.04％。
47.步骤9：步骤8中的细胞汇合度超过80％时，消化、传代至70％am111(血清浓度0％)+30％条件培养基(接种前收集的上清，含0.04％血清的dmem)本步骤血清含量约为0.012％，dmem培养含量约为0.012％。
48.步骤10：步骤9中的细胞汇合度超过80％时，消化、传代至70％am111(血清浓度0％)+30％条件培养基(接种前收集的上清，含0.012％血清的dmem)本步骤血清含量约为0.004％，dmem培养含量约为0.004％。
49.步骤11：细胞冻存，步骤10中的细胞汇合度超过80％时，消化，收集细胞进行冻存，冻存培养基为90％am111+10％dmso。
50.实施例2mdck.stat1ko细胞的驯化及培养
51.驯化时的培养基及培养条件参照实施例1，当培养汇合度达到80％进行传代换液培养。
52.第一阶段(d0-d7)：血清由10％降至5％，过程中进行扩种并冻存细胞。用t25方瓶进行细胞的复苏，复苏培养基使用10％fbs dmem，培养2-3天进行一次消化处理，用台盼蓝染色法监测细胞密度。按照1-2
×
106cells/t175(t175培养瓶)进行扩种，扩种培养基使用5％fbs dmem，待细胞活率恢复后进行细胞的冻存，在第三代进行冻存。
53.第二阶段(d7-d24)：血清由5％降至0％，过程中进行扩种并冻存细胞。先用t25方瓶复苏一支细胞(冻存血清含量5％)，复苏培养基使用5％血清的培养基am111，按照1-2
×
106cells/t175进行传代扩种，传代及扩种培养基使用的是无血清的am111完全培养基,传代过程中添加30％条件培养基，培养2-3天进行一次消化处理，用台盼蓝染色法监测细胞密度，传至第六代进行细胞的冻存。
54.第三阶段(d24-d38)：无血清贴壁细胞的复苏与验证，先用t25方瓶复苏一无血清冻存的细胞，复苏及传代培养基均使用无血清培养基am111完全培养基，按照1-2
×
106cells/t175进行传代，培养2-3天进行一次消化处理，用台盼蓝染色法监测细胞密度。三个阶段下的细胞生长密度表1。
55.表1
[0056][0057][0058]
由上述记载内容可知，本发明所开发一套mdck无血清驯化平台，在第一阶段和第
二阶段中，通过使用特定的培养基以及驯化培养条件，使mdck迅速适应无血清培养，第三阶段验证了驯化后的mdck细胞可以在无血清培养基中传代培养。

技术特征：
1.一种mdck细胞贴壁培养降血清驯化方法，其特征在于，具体步骤如下：s1：在含血清培养基中，将mdck细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s1中条件培养基中血清含量为1.5％，dmem培养含量为1.5％；s2：待s1中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s2中条件培养基中血清含量为0.45％，dmem培养含量为0.45％；s3：待s2中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s3中条件培养基中血清含量为0.135％，dmem培养含量为0.135％；s4：待s3中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s4中条件培养基中血清含量为0.04％，dmem培养含量为0.04％；s5：待s4中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s5中条件培养基中血清含量为0.012％，dmem培养含量为0.012％；s6：待s5中的细胞培养至细胞汇合度为80％以上时，消化，传代至70％am111培养基+30％条件培养基中继续培养；s6中条件培养基中血清含量为0.004％，dmem培养含量为0.004％；s7：待s6中的细胞汇合度超过80％以上时，消化，收集细胞进行冻存，得到适应在无血清培养的mdck细胞。2.根据权利要求1所述的一种mdck细胞贴壁培养降血清驯化方法，其特征在于，s1-s7中的mdck细胞培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度5％，静态贴壁培养。3.根据权利要求2所述的一种mdck细胞贴壁培养降血清驯化方法，其特征在于，s1-s7中的mdck细胞培养至细胞汇合度优选为80％-90％。4.根据权利要求3所述的一种mdck细胞贴壁培养降血清驯化方法，其特征在于，s1-s7中所述消化为利用胰酶溶液分散培养的mdck细胞。5.根据权利要求4所述的一种mdck细胞贴壁培养降血清驯化方法，其特征在于，s7得到的mdck细胞冻存在90％am111+10％dmso的培养基中。6.根据权利要求1所述的一种mdck细胞贴壁培养降血清驯化方法，其特征在于，s1所使用的mdck细胞在降血清驯化前先进行预处理，预处理方法具体步骤为：a1：复苏在emem培养基中冻存的mdck细胞；a2：待a1中的细胞汇合度达到80％以上时，消化后，将细胞传代至10％血清的dmem培养基进行驯化；a3：待a2中的细胞汇合度达到80％以上时，消化后，将细胞传代至5％血清的dmem培养基进行驯化，并冻存细胞，得到预处理的mdck细胞。7.根据权利要求6所述的一种mdck细胞贴壁培养降血清驯化方法，其特征在于，a3中冻存细胞所采用的培养基为90％dmem(5％血清)+10％dmso。8.如权利要求1中s7所得到mdck细胞在用于生产禽流感病毒疫苗的应用。

技术总结
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于生产生物制品的方法，具体为一种MDCK细胞贴壁培养驯化的方法；本发明开发一套MDCK无血清驯化平台，使用特定的培养基以及驯化培养条件，使MDCK迅速适应无血清培养，进而生产禽流感病毒疫苗，是成为制备下一代安全有效、质量可控的流感疫苗的关键。流感疫苗的关键。流感疫苗的关键。


技术研发人员：李娟 贾丰彬 肖志华
受保护的技术使用者：上海奥浦迈生物科技股份有限公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/7/7