脐带血干细胞用于制备治疗呼吸道疾病制剂的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及脐带血干细胞用于制备治疗呼吸道疾病制剂的应用。


背景技术：

2.呼吸道疾病主要包括哮喘病、炎症性疾病和慢性阻塞性肺病。哮喘病是由于淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症，患者可见喘息、气促、胸闷以及咳嗽等不适症状，部分患者对常规治疗效果不佳，具有病程长、易反复的特点，对患者的生活质量造成影响。炎症性疾病包括气管炎、支气管炎、肺炎等，是气管或者支气管黏膜及周围组织的非特异性炎症，多是由于细菌、病毒等微生物感染造成的。慢性阻塞性肺疾病是一种以持续性呼吸道症状和气流受限为特点的疾病，由有毒颗粒或气体导致的气道和或肺泡异常引起。呼吸系统症状包括呼吸困难、咳嗽和/或咳痰最为常见，其发生率和死亡风险均很高。
3.人脐带血干细胞，主要是由造血细胞、间叶细胞祖细胞、神经干细胞/祖细胞和内皮细胞组成。人脐带血干细胞可以产生大量的神经营养因子和血管生成因子，以及其所分泌的外泌体中的包含的微核酸。造血干细胞具有多项分化潜能，利用细胞标记(如cd34、cd14、cd133)从骨髓和外周血干细胞中选择出细胞亚群，可以从细胞亚群中诱导分化得到内皮细胞。
4.干细胞疗法，是将健康的干细胞移植到患者体内，进而达到组织再生修复和机体免疫调节的作用，其具有来源广泛，免疫原性低，有强大的再生和免疫调节潜力的特点。相比传统的治疗药物，干细胞治疗可通过下调t细胞分化、炎症因子表达、抑制il-17a分泌、促进treg分化等多条通路来抑制呼吸道疾病的气道炎症，改善气道重塑。
5.中国专利cn202110431148中公开了含干细胞囊泡的药物组合物及其在治疗急性和慢性呼吸道炎症中的用途。该专利中所述的干细胞胞外囊泡中含有与抗炎或组织损伤修复相关的生物活性因子，所述的生物活性因子包括基质蛋白金属酶1和肝细胞生长因子。该专利中公开了上述的干细胞胞外囊泡制剂和药学上可接受的载体组成的药物组合物在治疗呼吸道炎症时，能够抑制气道炎症反应、修复气道损伤，改善气道张力等作用。
6.中国专利cn202010365965.6中公开了一种用于治疗肺部疾病的脐带间充质干细胞及其制备方法。该发明提供了脐带间充质干细胞用于制备预防或治疗尘肺损伤及纤维化的药物，该药物应用于肺病治疗，尤其是尘肺肺损伤及纤维化时，安全性高，对对应病症的干预和治疗效果好，具有较好的应用前景。
7.中国专利cn202210704813.3中公开了牙髓间充质干细胞在制备治疗呼吸道痿药物中的应用。该发明通过构建大鼠气管痿模型，观察到牙髓间充质干细胞对呼吸道痿有明显的治疗作用，促进了痿口组织修复愈合，减轻肺部炎症，促进痿口处胶原纤维组织增生及新生血管生成，提供了一种取材方便、免疫原性低的干细胞治疗方法。
8.但目前提供一种治疗呼吸道系统疾病的效果较好的干细胞疗法仍是值得期待的。


技术实现要素：

9.为了解决上述问题，本发明提供了脐血造血干细胞的新用途，具体是用于制备治疗呼吸道疾病的制剂的应用。
10.一方面，本发明提供了脐带血造血干细胞用于制备治疗呼吸道疾病制剂的应用，所述的脐带血造血干细胞的制备方法包括向脐带血中加入干细胞分离液，所述的干细胞分离液按照重量份数计包括茶皂素0.1-0.5份、羟甲基纤维素2-10份、聚蔗糖4-8份和氯化铵0.1-1份。
11.优选地，所述的干细胞分离液按照重量份数计包括茶皂素0.2-0.4份、羟甲基纤维素4-6份、聚蔗糖5-7份和氯化铵0.5-1份。
12.进一步优选地，所述干细胞分离液按照重量份数计包括茶皂素0.3份、羟甲基纤维素5份、聚蔗糖6份和氯化铵0.8份。
13.优选地，所述的呼吸道疾病包括哮喘病、气管炎、支气管炎、肺炎和慢性阻塞性肺病。
14.优选地，所述的制剂中脐带血造血干细胞的浓度为10
5-108cell/ml。
15.进一步优选地，所述的脐带血造血干细胞为脐带血单个核细胞，其造血干细胞比例大于1％。
16.优选地，所述的脐血造血干细胞的制备包括以下步骤：
17.1)向脐带血中加入干细胞分离液；
18.2)离心，吸取血清层和分离层之间的白色云雾状有核细胞层。
19.3)缓冲液洗涤，离心，孵育细胞，得脐带血造血干细胞。
20.优选地，所述步骤(1)中脐带血的采集包括以下步骤：在产妇胎盘脱落后，使用含有抗凝液的采血袋，将采血袋上的针头插入脐静脉中，使抗凝液与脐带血充分混合，得到脐带血预处理样品。
21.进一步优选地，对采集的脐带血进行abo/rh血型、hla分型，微生物学检测。
22.优选地，所述步骤(1)还包括脐带血的前处理步骤，具体为取脐带血，在800-1000g条件下离心10分钟，取沉淀，用等量的生理盐水或dmem培养基洗出。
23.优选地，所述步骤(1)中脐带血与干细胞分离液的体积比为1：(1-2)；
24.进一步优选地，所述步骤(1)中脐带血与干细胞分离液的体积比为1：1。
25.优选地，所述步骤(2)中离心的温度为18-22℃；
26.进一步优选地，所述步骤(2)中离心的温度为20℃。
27.优选地，所述步骤(2)中离心是1500r/min条件下，离心15min。
28.优选地，所述的步骤(3)中的缓冲液包括但不限于pbs缓冲液。
29.优选地，所述步骤(3)中离心的温度为24-26℃；
30.进一步优选地，所述步骤(3)中离心的温度为25℃。
31.优选地，所述步骤(3)中离心的转速为600-900r/min；
32.进一步优选地，所述步骤(3)中离心的转速为800r/min。
33.优选地，所述步骤(3)中离心的时间为3-8min；
34.进一步优选地，所述步骤(3)中离心的时间为4min。
35.优选地，所述步骤(3)中孵育细胞的温度为35-40℃，在含有5-6％co2的培养箱中
进行孵育，孵育的时间为3-4h；
36.进一步优选地，所述步骤(3)中孵育细胞的温度为37℃，在含有5％co2的培养箱中进行孵育，所述孵育的时间为3.5h。
37.优选地，所述步骤(3)孵育结束后还包括用生理盐水悬浮细胞的步骤。
38.另一方面，本发明提供了一种治疗呼吸道疾病的药物制剂，所述的药物制剂包括上述的脐带血造血干细胞。
39.优选地，所述的脐带血造血干细胞的浓度为10
5-108cell/ml。
40.进一步优选地，所述的脐带血造血干细胞为脐带血单个核细胞，其造血干细胞比例大于1％。
41.优选地，所述的药物制剂还包括药学上可接受的载体。
42.进一步优选地，所述的药学上可接受的载体包括但不限于乳化剂、崩解剂、润湿剂、调节剂、增溶剂、稀释剂、粘合剂。
43.进一步优选地，所述的药物制剂的给药方式包括口服给药，注射给药。
44.所述的口服给药的药物剂型包括但不限于散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、混悬剂。
45.所述的注射给药的剂型包括但不限于静脉注射剂、肌内注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂、腔内注射剂。
46.本发明的有益效果：
47.本发明提供的脐带血干细胞对呼吸道疾病的治疗有效。本发明所提出的脐血造血干细胞的新用途对于治疗呼吸道疾病有较好的应用前景。
48.本发明所用的脐血单个核细胞制剂，用于呼吸道疾病的治疗，不需要配血型和hla配型。
附图说明
49.图1为不同乙酰甲胆碱浓度各组动物的气道阻力参数penh曲线图。
50.图2为不同乙酰甲胆碱浓度各组动物的penh％曲线图。
51.图3为各组大鼠的体重变化图，与正常对照组相比，*p＜0.05；与模型对照组相比，#p＜0.05。
52.图4为各组大鼠肺纤维化评分图，与正常对照组相比，*p＜0.05；与模型对照组相比，#p＜0.05。
53.图5为各组大鼠肺泡炎评分图，与正常对照组相比，*p＜0.05；与模型对照组相比，#p＜0.05。
54.图6为各组大鼠肺组织tgf-β1变化图，与正常对照组相比，*p＜0.05；与模型对照组相比，#p＜0.05。
55.图7为各组大鼠肺组织hyp变化图，与正常对照组相比，*p＜0.05；与模型对照组相比，#p＜0.05。
56.图8为各组大鼠肺组织mmp-2变化图，与正常对照组相比，*p＜0.05；与模型对照组相比，#p＜0.05；与bm-mscs移植组相比，
¤
p＜0.05。
57.图9为各组大鼠肺组织tmp-1变化图，与正常对照组相比，*p＜0.05；与模型对照组相比，#p＜0.05。
58.图10为各组大鼠肺组织mmp-2/tmp-1变化图，与正常对照组相比，*p＜0.05；与模型对照组相比，#p＜0.05；与bm-mscs移植组相比，
¤
p＜0.05。
具体实施方式
59.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
60.实施例1脐带血造血干细胞的制备
61.脐带血造血干细胞的制备包括以下步骤：
62.(1)选取新鲜的脐带血，800r/min离心8分钟，离心后收集全血，将全血放入新的离心管中，弃掉红细胞。
63.(2)将25ml干细胞分离液加入到50ml的离心管中，所述干细胞分离液中按照重量份包括茶皂素0.3份、羟甲基纤维素5份、聚蔗糖6份和氯化铵0.8份，所述脐带血与干细胞分离液的体积比为1:1，将步骤(1)中得到的血液缓缓加入到分离液的上层，将加好血液和分离液的离心管放入离心机中，温度为25℃，转速为1500r/min，离心时间为15分钟。
64.(3)离心之后取出离心管，可见离心管中分为4层，分别是：血浆层、细胞层、分离液层和红细胞层；吸取血清层和分离层之间的白色云雾状有核细胞层，将吸出的细胞放入干净的离心管中，加入pbs制成混悬液。
65.(4)提取的干细胞，用pbs溶液洗涤3次，800r/min离心4分钟。将洗涤离心后的细胞放入37℃，5％co2的培养箱中孵育2.5h。离心之后用生理盐水悬浮细胞，再进行细胞计数。
66.实施例2脐带血造血干细胞的制备
67.脐带血造血干细胞的制备与实施例1的区别在于，干细胞分离液中按照重量份包括茶皂素0.4份、羟甲基纤维素4份、聚蔗糖5份和氯化铵0.5份，所述脐带血与干细胞分离液的体积比为1:2，其余皆相同。
68.对比例1
69.与实施例1的区别在于，干细胞分离液中未添加茶皂素，其余皆相同。
70.对比例2
71.与实施例1的区别在于，干细胞分离液中未添加氯化铵，其余皆相同。
72.对比例3
73.与实施例1的区别在于，干细胞分离液中未添加羟甲基纤维素，其余皆相同。
74.1、对上述制得的脐带血造血干细胞进行细胞活率的检测；
75.2、测试方法：
76.将离心后的细胞悬液与台盼蓝溶液以9:1的比例混匀，取10μl滴到细胞计数板，计数活细胞和死细胞，然后统计细胞活率。
77.细胞活率＝活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)
×
100％。
78.检测结果如下表1。
79.表1.细胞活率
[0080] 细胞活率(％)
实施例193.6实施例293.3对比例185.9对比例287.1对比例386.4
[0081]
从上表1中可以看出，实施例1-2中的制备方法制得的脐带血造血干细胞的细胞活率高于对比例1-3，对比例1的干细胞分离液中未添加茶皂素，对比例2的干细胞分离液中未添加氯化铵和对比例3的干细胞分离液中未添加羟甲基纤维素，均会一定程度上影响造血干细胞的细胞活率。
[0082]
3、流式细胞仪检测：pbs洗涤细胞后，将pe-cd34，pe-cd133、pe-cd90，pe-cd44、pe-cd45、单克隆抗体分别加入pbs悬浮的细胞悬液中，4℃孵育40min，洗涤细胞，流式细胞仪检测。同时设pe-igg1及fitc-igg1标记的阴性对照抗体，并用加入单克隆抗体的干细胞作为空白对照。
[0083]
实验结果：
[0084]
细胞计数：
[0085]
计算公式：
[0086]
注：本实验中，每离心管所加脐血量为10ml。
[0087]
经计算后细胞计数结果，分离脐带血所获细胞数：每ml脐带血所获有核细胞数为3.46
×
105个。
[0088]
流式细胞仪检测表明，脐血单个核细胞(uc-mncs)中cd34+、cd133+细胞比例大于1.0％。
[0089]
实验例3脐带血单个核细胞治疗小鼠哮喘的药效学实验
[0090]
对哮喘模型balb/c小鼠尾静脉注射脐带血单个核细胞后，观察其治疗哮喘的效果，以确定脐带血单个核细胞治疗小鼠哮喘的有效性。
[0091]
1.实验材料和方法
[0092]
1.1.材料
[0093]
1.1.1卵清蛋白(ova，sigma)，注射用氢氧化铝佐剂(thermo fisher scientific)。磷酸缓冲液(pbs gibco)生理盐水(0.9％氯化钠溶液)，广西裕源药业有限公司。乙酰甲胆碱(mch，methacholine，sigma)。
[0094]
1.1.2.小鼠，品系：balb/c，spf级，雄性。试验时体重：20.1-23.0g，体重差异在平均体重的20％以内。来源及许可证：北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号为：scxk(京)2016-0006，北京市科学技术委员会颁发。实验动物合格证明号：1100112011009108。
[0095]
1.1.3试验的环境条件：检疫间和饲养室环境：室温为20℃-26℃，相对湿度为40％-70％。实验动物使用许可证号：syxk(粤)2016-0122，动物设施使用证明号：00233834。
[0096]
1.1.4小鼠哮喘模型的造模方法：分别于第1、7、14天腹腔注射致敏用抗原液0.2ml/只(抗原液为卵清蛋白和注射用氢氧化铝佐剂等体积混合溶液)，然后在第21、22、
23、24天采用异氟烷麻醉后左右2侧各滴鼻给予抗原液(卵清蛋白溶液)10μl/只进行激发，空白组按相同方法给予生理盐水。
[0097]
1.1.5人脐带血单个核细胞的制备包括以下步骤：取实验例2制备人脐带血造血干细胞。使用前37℃快速水浴解冻复苏，用氯化钠注射液洗涤后用氯化钠注射液重悬制成含106cells/ml的细胞混悬液。
[0098]
1.1.6鼠脐带血单个核细胞的制备包括以下步骤：取实验例3制备鼠脐带血造血干细胞。使用前37℃快速水浴解冻复苏，用氯化钠注射液洗涤后用氯化钠注射液重悬制成含106cells/ml的细胞混悬液。
[0099]
1.2.试验设计
[0100]
试验剂量设计及分组：选取经检疫合格的体重达标的balb/c小鼠140只，随机分为7组，分别为空白组(1组)、模型组(2组)、糖皮质激素组(3组)、低剂量组(4组)、中剂量组(5组)、高剂量组(6组)、鼠干细胞组(7组)，每组各20只(见表2)，其中4-6组中均为人脐带血单个核细胞。
[0101]
表2试验分组和剂量设置
[0102][0103]
1.3.检测方法
[0104]
气道反应性无创检测(在呼吸疾病国家重点实验室进行)：末次激发24h内每组各取1/2量动物进行无创肺功能检测，将待测小鼠放入buxco无创小动物肺功能检测系统体描箱中，小鼠依次雾化吸入0、1.56、3.125、6.25、12.5mg/ml乙酰甲胆碱溶液30s刺激，观察记录3min气道阻力正相关参数penh值，休息1min后继续下一浓度雾化刺激。40min内平行检测4-8只动物，完成后当天进行安乐死，取肺组织进行病理组织学检查。
[0105]
肺泡灌洗液的细胞计数及分类：每组各取各取1/2量动物经气管插管(不开锁骨，仅暴露胸腔)，使用0.7ml/次生理盐水对小鼠进行全肺灌洗，连续3次，合并回收的肺泡灌洗液(balf)，2000rpm离心10min后取下层液体0.3ml，摇匀后用动物专用血液分析仪进行总细胞及白细胞分类计数。
[0106]
细胞因子检测：取balf上清液，用液相芯片(luminx)检测il-4、il-5、il-6、il-10、il-12、il-13、il-17细胞因子水平，用elisa法(相关试剂盒)检测tslp，其检测方法及步骤均为本领域的常规操作。
[0107]
淋巴细胞亚群检测：取balf离心后的下层清液0.3ml，用流式细胞仪测定t细胞、th细胞(cd4+)、tc细胞(cd8+)、th1、th2、treg、th17。
[0108]
组织病理学检查：每组取进行无创肺功能检测后的动物肺组织，左右肺(含支气管)分别用10％中性福尔马林溶液和carnoy固定液灌注；然后取支气管和肺组织(两大肺叶)，制备病理组织切片，分别进行he染色和pas染色，在显微镜下进行组织病理学检查，并采用半定量进行评价，评分标准见表3。
[0109]
表3肺组织异常改变评分标准
[0110][0111]
1.4.数据统计处理方法
[0112]
对体重、气道反应性无创检测结果、肺泡灌洗液的细胞计数、细胞因子、淋巴细胞亚群等数据以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，使用spss统计软件25.0进行统计学分析，首先对各组数据采用homogeneity of variance进行方差齐性检验，若方差齐性，则进行单因素方差分析(one-way anova)，若anova有统计学意义时，进一步采用bonferoni法对数据进行统计分析。若方差不齐，采用welch的修正值，当p＜0.05时认为差异有统计学意义。
[0113]
2.实验结果
[0114]
2.1.气道反应性无创检测结果：无创的整体体积描记法是根据哮喘时呼气相时间延长、表现为呼气末暂停时间延长即为增强的呼气间歇(enhanced pause，penh)的现象来定量反映气流受限程度，penh值是反映气道阻力的间接指标。不同浓度乙酰甲胆碱(mch)溶液刺激的气道阻力正相关参数penh值见表4、表5和图1，penh％见图2。
[0115]
表4各组动物气道反应检测的penh结果(χ
±
s，n＝10)
[0116]
[0117]
注：1、与模型组比较，*表示差异显著p＜0.05，**表示差异极显著p＜0.01。
[0118]
2、糖皮质激素组和高剂量组动物数为9只、鼠干细胞组动物数为6只。
[0119]
表5各组动物气道反应检测动物的penh％结果(与pbs相比，χ
±
s，n＝10)
[0120]
注：与模型组比较，*表示差异显著p＜0.05，**表示差异极显著p＜0.01。
[0121]
糖皮质激素组和高剂量组动物数为9只、鼠干细胞组动物数为6只。
[0122]
从上表4-5和图1-2中可以看出，空白组、糖皮质激素组动物的penh值和penh％在不同乙酰甲胆碱浓度刺激下均显著低于模型组(p《0.01)；低剂量组动物的penh值和/或penh％在1.56-6.25mg/ml乙酰甲胆碱浓度刺激下均显著低于模型组(p《0.01或《0.05)，在更高乙酰甲胆碱浓度刺激下也有降低趋势；中剂量组、鼠干细胞组动物的penh值在不同乙酰甲胆碱浓度刺激下均低于模型组，但无显著差异；鼠干细胞组动物的penh％在1.56mg/ml乙酰甲胆碱浓度下显著低于模型组(p《0.05)；高剂量组动物的penh值和penh％在不同乙酰甲胆碱浓度刺激下与模型组相比均无显著差异(p》0.05)。
[0123]
2.2.细胞因子检测结果：与模型组相比，空白组和糖皮质激素组balf的il-5、il-6、il-10、il-13均显著降低(p《0.01或0.05)，中剂量组balf的il-5、il-13均显著降低(p《0.05或0.01)，低剂量组balf的il-5显著降低(p《0.05)；其余动物balf的各细胞因子水平均无显著差异(p》0.05)。空白组和糖皮质激素组血清il-5、il-13均显著降低(p《0.01)，空白组血清il-6、il-10、il-17均显著降低(p《0.01或0.05)结果见表6和表7。用elisa法检测各动物balf的tslp，各组均未测到。
[0124]
表6各组动物肺泡灌洗液的细胞因子水平结果(χ
±
s，n＝5，pg/ml)
[0125][0126]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05，**表示差异极显著p《0.01。
[0127]
表7.血清细胞因子浓度(χ
±
s，n＝5，pg/ml)
[0128][0129][0130]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05，**表示差异极显著p《0.01。
[0131]
表8各组动物肺组织病理学检查评分结果(均数
±
标准差(mean
±
sd)，n＝10)
[0132][0133]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05，**表示差异极显著p《0.01。
[0134]
balb/c小鼠在用卵清蛋白致敏3次，连续滴鼻给药激发4天，并在末次激发24h内进行无创肺功能检测(penh值)、肺泡灌洗液的细胞及细胞因子检测，安乐死后进行肺组织病理学检查，对结果进行综合分析得以下结论。
[0135]
1、人脐带血单个核细胞(4
×
105cell/只、2
×
106cell/只，第7、20天各给药一次)治
疗balb/c小鼠哮喘有效。
[0136]
2、作为同源细胞，胎鼠脐血单个核细胞(2
×
106cell/只，第7、20天各给药一次)治疗balb/c小鼠哮喘有效。
[0137]
实验例4脐带血干细胞对大鼠肺纤维化的治疗作用
[0138]
建立肺纤维化动物模型，观察脐带间充质干细胞和脐带血干细胞对大鼠肺纤维化的影响。
[0139]
2.材料与方法
[0140]
2.1受试药物：
[0141]
2.1.1人源脐血单个核细胞(cb-mncs)。
[0142]
2.1.2大鼠骨髓间充质干细胞(bm-mscs)。
[0143]
2.2生理盐水，生产单位：四川美大康华康药业有限公司
[0144]
2.3.试验动物和饲养条件
[0145]
3.1.试验动物：spf级sd大鼠，130-200g，雄性。由中山大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为：scxk(粤)2011-0029，广东省科学技术厅颁发。
[0146]
3.2.动物的饲养管理
[0147]
3.2.1动物的饲养环境：温度20-26℃；湿度40％-70％，换气次数：饲养室大于15次/小时。
[0148]
3.2.2饲料：spf级鼠灭菌饲料。
[0149]
3.2.3饮用水：经121℃(1.0kg/cm2)、30min灭菌自来水，给水方法：经饮水瓶自由摄取。
[0150]
2.4.主要仪器和试剂
[0151]
2.4.1.主要仪器：电热恒温水槽：dk-8d，haier立式超低温保存箱冰箱：dw-86l626，taylor-wharton低压液氮罐：dpl452-186-0.69i，bhc-1300ii a2生物安全柜：bhc1300 ii a2，赛默飞细胞培养箱：3111，赛默飞高速冷冻离心机：st 16r，倒置研究型显微镜：eclipse ti2-u，全自动生化分析仪，病理切片机。
[0152]
2.4.2.主要试剂：博来霉素(blm)，细胞因子elisa检测试剂盒：转化生长因子-β1(tgf-β1)，羟脯氨酸(hyp)，基质金属蛋白酶-2(mmp-2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(timp-1)。
[0153]
2.5.试验设计
[0154]
2.5.1造模：溶剂对照组12只，模型组39只。分组见表9。
[0155]
表9.造模期间动物分组安排
[0156][0157]
2.5.2.造模方法
[0158]
2％戊巴比妥溶液按50mg/kg体重对各组大鼠进行腹腔注射麻醉，颈正中切口显露气管，模型组大鼠分别于气管内注入0.1ml以5mg/kg体重配制的blm生理盐水溶液(溶剂对照组大鼠于气管内注入0.1ml生理盐水)，注射后立即直立旋转大鼠2min，使药物均匀分布
于两肺内。缝合皮肤，局部消毒后继续在原饲养环境下饲养。
[0159]
2.5.3.造模后检测：造模后随机取3只模型组动物采血，解剖，测定血生化和病理学指标。
[0160]
2.5.4试验分组和剂量设置：造模期结束后，溶剂对照组动物直接进入正式试验。模型组动物按体重随机分为3组，每组12只。具体实验分组及剂量设计见表10。
[0161]
表10试验分组与剂量设计
[0162][0163]
给药方法：尾静脉注射，106cells/只，建模后24h单次注射。
[0164]
2.5.5细胞制备：
[0165]
2.5.5.1.脐血单个核细胞：取实验例2制备脐带血造血干细胞。使用前37℃快速水浴解冻复苏，用氯化钠注射液洗涤后用氯化钠注射液重悬制成含106cells/ml的细胞混悬液。
[0166]
2.5.5.2.大鼠骨髓间充质干细胞：断颈处死大鼠，无菌条件下取后腿股骨，去除肌肉，从中间折断；用注射器吸取培养基吹入骨腔冲出骨髓，离心200g，5min；加培养基重悬后接种于10cm培养皿。每2-3天换液一次，细胞长至90％左右融合后传代。传至第三代收集细胞，洗涤后用氯化钠注射液重悬制成含106cells/ml的细胞混悬液。
[0167]
2.6.检查指标
[0168]
2.6.1.一般症状观察：观察时间：每天上午观察1次。观察内容：动物的死亡或濒死情况，精神状态、行为活动、粪便性状、饲料和饮水的供应情况等。
[0169]
2.6.2.体重：测定时间，造模后每周1次。
[0170]
2.6.3系统尸检
[0171]
试验结束后腹腔注射20％乌来糖0.7ml100g对动物进行麻醉。放血致死，进行系统解剖，观察肺脏的大小、色泽、质地、切面情况等病理改变。
[0172]
2.6.4标本采集
[0173]
采集时间：建模后28d及42d分别处死各组一半大鼠取样。
[0174]
操作步聚：取左肺用生理盐水冲洗后浸泡于4％多聚甲醛缓冲液固定备用；取1.000g右肺，剪碎；加入预冷的pbs溶液9ml吹匀；用高速匀浆机以15000rpm匀浆；所得匀浆液4℃，2000rpm，离心15min；收集上清500ul，于-80℃低温冻存。
[0175]
2.6.5检测肺组织中示踪细胞的分布：取新鲜肺组织用10％琼脂包埋后作振动切片，于荧光倒置显微镜下观察荧光细胞分布情况。
[0176]
2.6.6测定肺组织转化生长因子-β1(tgf-β1)、羟脯氨酸(hyp)、基质金属蛋白酶-2(mmp-2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(timp-1)水平：采用酶联免疫吸附试验(elisa)双抗体夹心法，同时批量检测各组大鼠肺组织tgf-β1、hyp、mmp-2、timp-1水平，大鼠肺组织tgf-β1、hyp、mmp-2、timp-1水平的检测使用本领域常规的步骤和方法进行检测。
[0177]
2.7.统计分析：
[0178]
在不同组别中，对各计量数据(动物体重、肺泡炎评分、纤维化评分及脏器系数)计算平均值
±
标准差，采用spss统计软件进行处理。根据不同的数据类型采用不同的处理方法，p＜0.05时认为差异具有统计学意义。病理学检查出现异常情况则需按其发生率和程度进行组间比较。各组均数比较使用单因素方差分析或kruskal-wallis秩和检验，组间两两比较采用t检验，两变量间关系使用spearman秩相关分析。
[0179]
3.结果
[0180]
3.1.一般症状观察：
[0181]
a组一般情况良好，无死亡。b、c、d组在造模及mscs移植后7d内分别死亡2只、1只、3只，c、d干细胞移植组大鼠精神、活动、饮食优于同期的b组，组间差异不明显。所有大鼠颈前伤口于造模3-4d后自然愈合，无红肿、化脓。
[0182]
3.2.体重
[0183]
造模后大鼠体重先下降后增加，28天时细胞移植组大鼠体重增加量与模型对照相比具有显著差异(p《0.05)(图3)，提示干细胞能够改善肺纤维化大鼠生存质量。
[0184]
3.3.大鼠肺泡炎与肺纤维化评分(表11、图4-5)：
[0185]
表11各组大鼠肺泡炎、肺纤维化程度评分比较(均数
±
标准差(mean
±
sd))
[0186][0187]
注：与a1比较，ap《0.05；与b1比较，bp《0.05；与c1比较，cp《0.05；与a2比较，dp《0.05；与b2比较，ep《0.05；与c2比较，fp《0.05。
[0188]
动物造模后，28天及42天其肺纤维化及肺泡炎评分均显著增高(p《0.05)，骨髓间充质干细胞治疗后，第28天肺纤维化程度与对照组相比具有显著差异(p《0.05)，其它时间点的肺纤维化及肺泡炎程度有所好转，但与模型对照组相比没有统计学显著差异(p》0.05)；脐血单个核细胞治疗后，第28天的肺纤维化程度、第42天的肺纤维化及肺泡炎评分与模型对照组相比均具有显著性差异(p《0.05)。提示骨髓间充质干细胞及脐血单个核细胞均能改善肺纤维化及肺泡炎程度，脐血单个核细胞效果明显，优于骨髓间充质干细胞。
[0189]
3.4.肺组织tgf-β1水平的测定：28d：a1最低，b1最高，c1、e1、d1、f1介于a1和b1之
间，数值呈依次下降；e1、d1、f1分别与b1比较，差异有统计学意义(p《0.05)。42d：a2最低，b2最高，c2、d2、e2介于a2和b2之间，数值呈依次下降；c2、d2、e2分别与b2组比较，差异有统计学意义(p《0.05)。42d各组大鼠肺组织tgf-β1均值均较其同组28d有所上升，但差异均无统计学意义(p》0.05)(表12，图6)。
[0190]
3.5.肺组织hyp水平的测定(表12)：28d：a1最低，b1最高，c1、d1、e1、f1介于a1和b1之间，数值呈依次下降；c1、d1、e1、f1分别与b1比较，差异有统计学意义(p《0.05)。42d：a2最低，b2最高，c2、d2、e2介于a2和b2之间，数值呈依次下降；e2组分别与b2、c2组相比，差异有统计学意义(p《0.05)。42d各组大鼠肺组织hyp均值均较其同组28d有所上升，但差异均无统计学意义(p》0.05)。(表12，图7)
[0191]
3.6.肺组织mmp-2水平的测定：28d：a1最低，b1最高，c1、d1、e1、f1介于a1和b1之间，数值呈依次下降，此4组分别与b1相比，差异有统计学意义(p《0.05)；d1、e1、f1分别与c1相比，差异有统计学意义(p《0.05)；f1分别与d1、e1相比，差异有统计学意义(p《0.05)。42d：a2最低，b2最高，c2、e2、d2介于a2和b2之间，数值呈依次下降，此3组分别与b2相比，差异有统计学意义(p《0.05)；d2、e2分别与c2相比，差异有统计学意义(p《0.05)。42d a、c、e组大鼠肺组织mmp-2均值较其同组28d有所上升，42d b、d组大鼠肺组织mmp-2均值较其同组28d有所下降(表12，图8)。
[0192]
表12各组肺组织tgf-β1、hyp、mmp-2、timp-1、mmp-2/timp-1比较(均数
±
标准差(mean
±
sd))
[0193][0194]
注：与a1比较，ap《0.05；与b1比较，bp《0.05；与c1比较，cp《0.05；与a2比较，dp《0.05；与b2比较，ep《0.05；与c2比较，fp《0.05。
[0195]
3.7.肺组织timp-1水平的测定：
[0196]
28d：a1最高，b1最低，f1、c1、d1、e1介于a1和b1之间，数值呈依次上升；d1、e1分别与b1相比，差异有统计学意义(p《0.05)；e1分别与c1、f1相比，差异有统计学意义(p《0.05)。42d：a2最高，b2最低，d2、c2、e2介于a2和b2之间，数值呈依次上升；e2分别与c2、d2相比，差异有统计学意义(p《0.05)。42d各组大鼠肺组织timp-1均值较其同组28d有所下降。(表12；图9)
[0197]
3.8.肺组织mmp-2/timp-1：28d：a1最低，b1最高，c1、d1、f1、e1介于a1和b1之间，数值呈依次下降，此4组分别与b1相比，差异有统计学意义(p《0.05)；d1、f1、e1分别与c1相比，差异有统计学意义(p《0.05)。42d：a2最低，b2最高，c2、d2、e2介于a2和b2之间，数值呈依次
下降，此3组分别与b2相比，差异有统计学意义(p《0.05)；d2、e2分别与c2相比，差异有统计学意义(p《0.05)。42d各组大鼠肺组织mmp-2/timp-1均值较其同组28d有所上升，但差异均无统计学意义(p》0.05)(表12；图10)肺组织tgf-β1、hyp、mmp-2/timp-1分别与肺泡炎程度评分、肺纤维化程度评分存在显著正相关(表13)。
[0198]
表13tgf-β1、hyp、mmp-2/timp-1分别与肺泡炎程度及肺纤维化程度评分相关性分析
[0199][0200]
3.9.振动切片观察荧光细胞：28天和42天处死的大鼠肺组织振动切片后均未发现有荧光细胞，提示干细胞的分化替换作用可能并非是治疗肺纤维化的主要作用机制。
[0201]
上述结果提示，mscs经静脉移植可延缓肺纤维化进展，下调tgf-β1水平及改善mmp/timp失衡可促进mscs对肺纤维化的修复作用，选择脐血干细胞可明显提高对大鼠肺纤维化的治疗效果。
[0202]
实验例5脐带血干细胞对老年人流行性感冒及重症肺炎的治疗作用
[0203]
流行性感冒是由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，经飞沫传播，临床典型表现为突起畏寒、高热、头痛、全身酸痛、疲弱乏力等全身中毒症状。流行病学最显著的特点是突然爆发、迅速蔓延、波及面广。流感常会在起病后2-4天或恢复期病情加重，出现高热、剧烈咳嗽、脓性痰、呼吸困难，肺部湿性啰音。婴幼儿、老年人、有心肺疾病及其他慢性疾病患者或免疫功能低下者可并发肺炎，预后较差。
[0204]
1、材料和方法
[0205]
1.1一般资料
[0206]
收集符合临床流感重症诊断标准的住院患者140例；其中男74例，女66例；年龄60-83岁，平均69岁。有流感高危因素的患者121例，占86.43％，其中有呼吸系统、心血管系统等慢性疾病者62例；肥胖者12例。以随机数字表法分为干细胞组(治疗组)70例、综合治疗组(对照组)70例。
[0207]
治疗组中男35例，女35例；年龄66-83岁，年龄中位数71岁；对照组中男39例，女31例；年龄60-82岁，年龄中位数70岁，性别与年龄组间均衡。
[0208]
1.2诊断标准
[0209]
1.2.1流行性感冒重症诊断：
[0210]
符合《流行性感冒诊断与治疗指南(2018年版)》中流行性感冒的诊断，同时具备以下重症标准之一：
[0211]
(1)呼吸频率快，呼吸困难，口唇紫绀；
[0212]
(2)反应迟钝、嗜睡、躁动、惊厥等神智改变；
[0213]
(3)严重呕吐、腹泻，出现脱水表现；
[0214]
(4)影像学检查有肺炎征象；
[0215]
(5)肌酸激酶(ck)、肌酸激酶同工酶(ck-mb)等心肌酶水平迅速增高；
[0216]
(6)原有基础疾病明显加重。
[0217]
1.2.2流感继发细菌性肺炎诊断
[0218]
流感重症患者持续高热》3天，伴剧烈咳嗽、脓性痰、呼吸困难，肺部湿性啰音及肺实变体征；下述任一检测指标超出正常值上限，可认为发生继发细菌性肺炎：(1)外周血白细胞总数；(2)外周血中性粒细胞；(3)c反应蛋白。
[0219]
1.3纳入标准
[0220]
符合流感细菌性肺炎诊断标准，年龄≥60岁；同意参加干细胞临床研究，并签署知情同意书者。
[0221]
1.4排除标准
[0222]
精神疾患者。近1个月参加其他流感药物临床研究者。符合危重症诊断标准之一：呼吸衰竭；感染中毒性休克；多脏器功能不全；出现其他需进行监护治疗的严重临床情况。妊娠妇女。
[0223]
1.6治疗方案
[0224]
1.6.1对照组
[0225]
参照《甲型h1n1流感诊疗方案(2010年版)》和《流行性感冒诊断与治疗指南(2018年版)》进行综合治疗，包括抗病毒(例如，奥司他韦)和对症支持，根据患者病情选用不同抗生素(例如，青霉素，阿齐霉素，左氧氟沙星，阿莫西林，头孢克洛)等。
[0226]
1.6.2治疗组：在综合治疗的基础上加用脐血干细胞(脐血干细胞应用前均不进行hla配型，2
×
106/kg体重，加入100ml生理盐水中静脉滴注)治疗。
[0227]
1.7观察指标
[0228]
检测肺部x光、血常规和c反应蛋白，以判断继发细菌性肺炎情况；记录抗流感病毒药物的使用情况。
[0229]
1.8统计学方法
[0230]
建立中心数据库录入系统，由双人分别录入资料，核定数据的准确性。运用sas9.1.3统计软件进行数据分析，计数资料以频数和百分比描述，采用秩和检验，p≤0.05为差异有统计意义。
[0231]
2、结果
[0232]
2.1二组抗流感病毒药物使用情况比较
[0233]
治疗组70例患者中，46例使用了抗病毒药物，占65.71％；对照组70例中54例使用，占77.14％。2组比较差异无统计学意义。说明2组患者抗病毒治疗水平一致。
[0234]
2.2二组继发细菌性肺炎情况比较
[0235]
140例重症流行性感冒患者中，发生继发细菌性肺炎45例，占32.14％。治疗组70例患者中，发生细菌性肺炎9例，占12.86％，对照组70例中，发生细菌性肺炎36例，51.42％。2组细菌性肺炎发生率比较，差异有统计学意义(p《0.01)。说明脐带血干细胞治疗可以促进重症流感的恢复，减少并发性肺炎的发生率。
[0236]
实验例6脐带血干细胞对难治性支气管哮喘的治疗作用
[0237]
难治性哮喘发生发展过程中有炎症细胞的持续浸润，气道平滑肌细胞的增生、肥大，气道口径的缩小，甚至部分出现狭窄或阻塞，发生不可逆气流受限，最终引起肺功能改变。难治性支气管哮喘的传统治疗药物较多，主要包括症状控制性药物和症状缓解性药物。
[0238]
重症哮喘是指哮喘急性发作或爆发性发作，经常规治疗无法改善，呈持续性，或短
时间进入危重状态并发展为呼吸衰竭，严重危及患者生命安全。重症哮喘发病机制复杂，药物治疗反应不佳，治疗难度大，死亡率居高不下。近年来，哮喘的干细胞治疗的动物实验取得了较大的进展，但多限于间充质干细胞。本发明利用脐带血干细胞治疗哮喘，取得了较好的临床效果，结果如下：
[0239]
1材料与方法
[0240]
1.1病例资料：选择重症哮喘患者126例，随机分为两组，各63例。干细胞组中男31例，女32例；年龄19-65岁，平均年龄(41.17
±
5.39)岁；病程4-16年，平均(6.18
±
2.74)年。对照组中男33例，女30例；年龄20-64岁，平均年龄(40.16
±
5.88)岁；病程3-14年，平均(5.63
±
3.17)年。两组间差异无统计学意义(p＞0.05)，具有可比性。
[0241]
1.2给药方案
[0242]
导入期为4周，导入期期间患者持续使用高剂量吸入型糖皮质激素(ics)常规治疗(ics剂量必须每日≥500ug/天，丙酸氟替卡松或等效物(对于ics/laba复方制剂，舒利迭50/250ug 2次/日及更高剂量或等效物将符合该ics标准))。
[0243]
干细胞组：导入完成后，在患者经皮血氧饱和度为92％以上且生命体征平稳时对患者静脉注射移植细胞，脐血干细胞应用前均不进行hla配型，单次植入人脐带血单个核细胞(huc-mncs)剂量为2.0-3.0
×
108(按60公斤成人体重计算为4.5
×
106/kg)。2周后进行第二次输注，在患者经皮血氧饱和度为92％以上且生命体征平稳时对患者静脉注射移植细胞，单次植入huc-mncs剂量为2.0-3.0
×
108(按60公斤成人体重计算为4.5
×
106/kg)。
[0244]
对照组：导入完成后，在患者经皮血氧饱和度为92％以上且生命体征平稳时对患者静脉注射0.9％氯化钠注射液。2周后进行第二次输注，在患者经皮血氧饱和度为92％以上且生命体征平稳时对患者静脉注射0.9％氯化钠注射液。
[0245]
(注：各组受试者每次输毕用生理盐水100ml冲管，以便将残留在输液管内的制剂全部输入患者体内。)
[0246]
1.3疗效评价指标：分别于治疗后1周，4周和12周观察以下指标。
[0247]
1.3.1临床症状(胸痛、气促、喘息、胸闷)基本或完全消失，1周内无哮喘发作，夜间睡眠质量良好为显效；临床症状有所好转，哮喘发作次数较前减少，次数≤2次/周，夜间睡眠质量得以提高为有效；临床症状与治疗前相比无任何改善，病情甚至出现加重趋势为无效。总有效率＝显效率+有效率。
[0248]
1.3.2生活质量：采用哮喘生活质量问卷(aqlq标准版本)进行评分。
[0249]
1.3.3采用血气分析检测患者治疗前及治疗后动脉血二氧化碳分压(paco 2)、动脉氧分压(paco2)。使用肺功能检测仪检测两组患者治疗前及治疗后第一秒呼气量(fev1)、第一秒用力呼气容积占用力肺活量的百分比(fev1/fvc％)及最大呼气流量(pef)变化。
[0250]
1.4统计学方法采用spss20.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数
±
标准差(mean
±
sd)表示，计数资料以％表示，组间率的比较采用t或χ2检验，p《0.05差异有统计学意义。
[0251]
2.结果
[0252]
2.1.治疗后12周，两组患者临床疗效比较：干细胞组，治疗总有效率为95.23％，其与对照组总有效率74.60％进行统计，干细胞组优于对照组(p《0.01)，见表14。
[0253]
表14.两组患者疗效比较(例数(％))
[0254][0255]
2.2.治疗后12周，两组患者生活质量比较结果见表15。
[0256]
表15.两组患者哮喘生活质量(aqlq)评分比较(均数
±
标准差(mean
±
sd)，n＝63)
[0257][0258]
两组治疗前比较，差别不明显：两组治疗后比较，同对照组相比，*p《0.05。
[0259]
2.3治疗后12周，两组患者血气分析指标比较结果见表16.
[0260]
表16.两组患者血气分析指标比较(均数
±
标准差(mean
±
sd)，n＝63)
[0261][0262][0263]
两组治疗前比较，差别不明显：两组治疗后比较，同对照组相比，*p《0.05。
[0264]
2.4.两组治疗后12周，肺功能指标，见表17。
[0265]
表17.两组患者治疗前后肺功能指标比较(均数
±
标准差(mean
±
sd)，n＝63)
[0266][0267]
两组治疗前比较，差别不明显：两组治疗后比较，同对照组相比，*p《0.05。
[0268]
重症哮喘分为急性严重哮喘和急性窒息性哮喘，发作时气体交换、血流动力学均有异常，气道阻力明显升高。低氧血症是导致重症哮喘死亡的主要原因，故持续吸氧是改善缺氧状态的直接途径。治疗常用广谱抗生素；茶碱类药物，能抑制磷酸二酯酶，提高平滑肌
细胞内的camp浓度，拮抗腺苷受体；糖皮质激素能抑制炎性过程及炎性介质释放，降低气道反应性，抑制嗜酸性粒细胞的趋化与活化，起到抗过敏的作用，同时减轻黏膜水肿，缓解起到阻塞。本发明提示，脐血干细胞对改善重症哮喘患者的临床症状，降低哮喘的发作次数，改善通气量和呼吸症状，生活质量明显改善，因此，脐血干细胞治疗重症哮喘效果明显。
[0269]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.脐带血造血干细胞用于制备治疗呼吸道疾病制剂的应用，其特征在于，所述的脐带血造血干细胞的制备方法包括向脐带血中加入干细胞分离液，所述的干细胞分离液按照重量份数计包括茶皂素0.1-0.5份、羟甲基纤维素2-10份、聚蔗糖4-8份和氯化铵0.1-1份。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的干细胞分离液按照重量份数计包括茶皂素0.2-0.4份、羟甲基纤维素4-6份、聚蔗糖5-7份和氯化铵0.5-1份。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述干细胞分离液按照重量份数计包括茶皂素0.3份、羟甲基纤维素5份、聚蔗糖6份和氯化铵0.8份。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的呼吸道疾病包括哮喘病、气管炎、支气管炎、肺炎和慢性阻塞性肺病。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的制剂中脐带血造血干细胞的浓度为10
5-108cell/ml。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的脐带血造血干细胞为脐带血单个核细胞，其造血干细胞比例大于1％。7.根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述的脐血造血干细胞的制备包括以下步骤：1)向脐带血中加入干细胞分离液；2)离心，吸取血清层和分离层之间的白色云雾状有核细胞层；3)缓冲液洗涤，离心，孵育细胞，得脐带血造血干细胞。8.一种治疗呼吸道疾病的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂包括权利要求1-7任一项所述的脐带血造血干细胞。9.根据权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述的脐带血造血干细胞的浓度为10
5-108cell/ml。10.根据权利要求8-9任一项所述的药物制剂，其特征在于，所述的脐带血造血干细胞为脐带血单个核细胞，其造血干细胞比例大于1％。

技术总结
本发明提供了脐带血干细胞用于制备治疗呼吸道疾病制剂的应用，属于生物技术领域。所述的脐带血造血干细胞的制备方法包括向脐带血中加入干细胞分离液，所述的干细胞分离液按照重量份数计包括茶皂素0.1-0.5份、羟甲基纤维素2-10份、聚蔗糖4-8份和氯化铵0.1-1份。本发明的研究结果表明干细胞治疗对呼吸道疾病有效，本发明所提出的脐血造血干细胞的新用途对于治疗呼吸道疾病有较好的应用前景。本发明所用的脐血单个核细胞制剂，用于呼吸道疾病的治疗，不需要配血型和HLA配型。不需要配血型和HLA配型。不需要配血型和HLA配型。


技术研发人员：邹清雁 李靖 李时悦 刘海霞 陈如冲 贾楠 时旭 邹奕君 杜少茵 梁海燕 丁先风 左万里
受保护的技术使用者：广州熙帝生物科技有限公司
技术研发日：2023.04.12
技术公布日：2023/7/7