一种用于提取原核生物总RNA的裂解缓冲液及其应用的制作方法

一种用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液及其应用
技术领域
1.本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液及其应用。


背景技术：

2.原核生物是指一类细胞核无核膜包裹，只存在称作核区的裸露dna的原始单细胞生物，包括细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体、支原体、蓝细菌和古细菌等。原核生物拥有细胞的基本构造并含有细胞质、细胞壁、细胞膜、以及鞭毛。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖构成，细胞表面整体带负电的部分原因在于磷壁酸带负电。革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，没有磷壁酸，其细胞壁中游肽桥、肽尾和双糖形成的网状结构较为疏松，而脂类物质含量高。
3.cn115595321a公开了一种用于提取rna的ctab裂解缓冲液及利用该ctab裂解缓冲液提取植物rna的方法，该发明提供的ctab裂解缓冲液，每百毫升含有如下组分：浓度为1mol/l的tris溶液10ml、浓度为2.8mol/l的nacl溶液50ml、浓度为0.25mol/l的edta溶液8ml、ctab 2g、pvp 2g和β-巯基乙醇2ml。将该ctab裂解缓冲液用于提取植物rna的方法中，能选择性沉淀dna和多糖多酚等杂质，能得到质量很好的rna。
4.cn107460190a公开了一种细菌rna的提取方法，包括：(1)收集菌体，并将该菌体置于离心管中；(2)向离心管中加入含有溶菌酶的eb缓冲液50-200μl，以彻底重悬菌体；(3)向离心管中加入200-600μl缓冲液a，并通过涡旋振荡混匀；若出现不溶性沉淀则对其进行离心，并将离心后得到的上清液转移至另一离心管中；(4)向离心管中加入200-600μl缓冲液b并混匀，接着再加入磁珠溶液，再振荡混匀。该发明提供了一种细菌rna的提取方法，可以快速裂解菌体，进而释放rna。
5.尽管目前已经有很多抽提rna的方案，但是大部分传统抽提方案很难做到裂解充分，如加热煮沸法、chelex-100萃取法、sds-naoh法、sds-酶裂解法、ctab法等。同时这些方法存在步骤复杂、试剂种类多、提取效率低等问题。
6.因此，提供一种快速高效提取原核生物总rna的方法，对解决现有技术中原核生物核酸提取步骤繁琐、试剂种类多和提取率低等问题具有重要意义。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液及其应用，所述裂解缓冲液成分简单，裂解效果好，有利于原核生物菌体中rna的释放。本发明还提供了一种基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，采用胍盐等离液剂与sds等表面活性剂共同裂解的方法，促进核蛋白体的解体，使细菌核酸内切酶灭活，使释放的核酸不会被降解，达到一步裂解释放核酸的目的，和磁珠结合，可以提取纯度高、完整性高和数量足够的原核生物核酸。
8.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
9.第一方面，本发明提供一种用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液，所述裂解缓冲液中包括以下组分：tris-hcl、edta、sds、氯化钠、胍盐和tritonx-100。
10.优选地，所述胍盐选自盐酸胍或硫氰酸胍中任意一种。
11.优选地，所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％ sds、0.5-2m氯化钠、3-6m胍盐、2-10％ tritonx-100，ph为5-7。
12.优选地，所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％ sds、0.5-2m氯化钠、3-6m盐酸胍、2-10％ tritonx-100，ph为5-7。
13.优选地，所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％ sds、0.5-2m氯化钠、3-6m硫氰酸胍、2-10％ tritonx-100，ph为5-7。
14.本发明中，所述裂解缓冲液成分简单，裂解效果好，有利于原核生物菌体中rna的释放。
15.本发明中，所述裂解缓冲液中tris-hcl提供一个合适的裂解的环境；所述裂解缓冲液中edta螯合mg
2+
或mn
2+
离子，抑制rna酶活性；所述裂解缓冲液中sds使细胞中的蛋白质和核酸之间常借着静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，使染色体离析，蛋白变性，释放核酸；所述裂解缓冲液中氯化钠提供一个高盐环境，使核酸充分溶解于液相，维持核酸结构的稳定，同时也na
+
作为磁珠吸附核酸的盐桥；所述裂解缓冲液中盐酸胍作为蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，使核蛋白迅速与核酸分离；所述裂解缓冲液中tritonx-100为一种比较温和的表面活性剂，促进sds的溶解，维持裂解液的稳定。
16.本发明中的裂解缓冲液适用性广泛，对包括细菌、放线菌、立克次氏体、衣原体、支原体、蓝细菌和古细菌等在内的原核生物均具有良好的提取效果。
17.第二方面，本发明提供第一方面所述的用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液在制备提取原核生物总rna的产品中的应用。
18.第三方面，本发明提供一种基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，所述方法包括：采用低温研磨的方式处理原核生物细胞，采用第一方面所述的用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液裂解研磨产物，采用氯仿分离核酸与蛋白类杂质，采用异丙醇沉淀rna，采用磁珠吸附rna，收集吸附后的磁珠，依次进行漂洗和洗脱，获得总rna。
19.优选地，所述低温研磨为液氮研磨，所述低温研磨的频率为40-55hz，例如可以是40hz、42hz、45hz、48hz、50hz、52hz或55hz等，所述低温研磨的时间为15-20s，例如可以是15s、16s、17s、18s、19s或20s等。
20.优选地，所述裂解缓冲液与研磨产物混合后，静置并离心，收集上清液。
21.优选地，所述静置的时间为2-3min，例如可以是2min、2.5min或3min等，所述静置的温度为20-25℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等。
22.优选地，所述离心的离心力为14000-15000g，例如可以是14000g或15000g等，所述离心的时间为2-3min，例如可以是2min、2.5min或3min等。
23.优选地，所述磁珠包括硅羟基磁珠或羧基磁珠。
24.优选地，所述漂洗采用的漂洗缓冲液为70-80％vol的乙醇水溶液，例如可以是70％vol、72％vol、75％vol、78％vol或80％vol等。
25.优选地，所述洗脱采用的核酸洗脱液为0.1-0.2％的焦碳酸二乙酯水溶液，例如可
以是0.1％、0.15％或2％等。
26.优选地，所述方法包括如下步骤：
27.(1)将原核生物沉淀进行液氮研磨，在频率为40-55hz下研磨15-20s，加入裂解缓冲液混匀，20-25℃静置2-3min；所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％ sds、0.5-2m氯化钠、3-6m胍盐、2-10％ tritonx-100，ph为5-7；所述胍盐选自盐酸胍或硫氰酸胍中任意一种；
28.(2)14000-15000g离心2-3min收集上清；所得上清中加入氯仿混合，20-25℃静置3-4min；
29.(3)14000-15000g离心15-18min收集上清；所得上清中加入等体积异丙醇沉淀rna，加入磁珠吸附rna；收集吸附后的磁珠，采用70-80％vol的乙醇水溶液漂洗，采用0.1-0.2％的焦碳酸二乙酯洗脱，获得总rna。
30.本发明中所述基于磁珠法快速原核生物核酸的方案最大程度简化了实验操作步骤，保证了实验人员的安全。所述方案操作简单，可实现人工操作和半自动化化操作，便于集成多种自动化核酸提取仪，样品通量高，核酸提取质量好，满足核酸提取速度、通量和核酸质量要求。
31.作为本发明的优选技术方案，样本通量较低时，手动提取细菌rna，具体步骤如下：
32.(1)将原核生物沉淀进行液氮研磨，在频率为40-55hz下研磨15-20s，加入裂解缓冲液混匀，20-25℃静置2-3min；所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％ sds、0.5-2m氯化钠、3-6m盐酸胍、2-10％ tritonx-100，ph为5-7；
33.(2)14000-15000g离心2-3min收集上清；所得上清中加入氯仿混合，20-25℃静置3-4min；
34.(3)14000-15000g离心15-18min收集上清；所得上清中加入等体积异丙醇沉淀rna，加入磁珠吸附rna；收集吸附后的磁珠，采用70-80％vol的乙醇水溶液漂洗，采用0.1-0.2％的焦碳酸二乙酯洗脱，获得总rna。
35.作为本发明的优选技术方案，32样本通量时，半自动化提取细菌rna，具体步骤如下：
36.(1)将原核生物沉淀进行液氮研磨，在频率为40-55hz下研磨15-20s，加入裂解缓冲液混匀，20-25℃静置2-3min；所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％ sds、0.5-2m氯化钠、3-6m盐酸胍、2-10％ tritonx-100，ph为5-7；
37.(2)14000-15000g离心2-3min收集上清；所得上清中加入氯仿混合，20-25℃静置3-4min；
38.(3)在96孔深孔板的第1、7列加入异丙醇和20μl磁珠溶液，第2、3、8和9列和加入500μl漂洗缓冲液，第4、10列加50μl核酸洗脱液；14000-15000g离心15-18min收集上清；取上清加入96孔深孔板第1、7列，上清与异丙醇等体积，放入自动核酸提取器中，运行程序得到提取的原核生物rna；
39.程序设置为：异丙醇沉淀和磁珠吸附-第一次漂洗-第二次漂洗-洗脱。
40.作为本发明的优选技术方案，96样本通量时，半自动化提取细菌rna，具体步骤如下：
41.(1)将原核生物沉淀进行液氮研磨，在频率为40-55hz下研磨15-20s，加入裂解缓
冲液混匀，20-25℃静置2-3min；所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％ sds、0.5-2m氯化钠、3-6m盐酸胍、2-10％ tritonx-100，ph为5-7；
42.(2)14000-15000g离心2-3min收集上清；所得上清中加入氯仿混合，20-25℃静置3-4min；
43.(3)1号孔板中加入异丙醇和20μl磁珠溶液，2号孔板和3号孔板中加入500μl漂洗缓冲液，4号孔板加50μl核酸洗脱液；14000-15000g离心15-18min收集上清；取上清加入1号孔板中，上清与异丙醇等体积，放入自动核酸提取器中，运行程序得到提取的原核生物rna；
44.程序设置为：异丙醇沉淀和磁珠吸附-第一次漂洗-第二次漂洗-洗脱。
45.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
46.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
47.(1)本发明提供一种操作简单的基于磁珠法快速原核生物核酸方案，可实现人工操作和半自动化化操作，便于集成多种自动化核酸提取仪。最大程度简化了实验操作步骤，保证了实验人员的安全。满足核酸提取速度、通量和核酸质量要求。本发明提供方案，操作简单，样品通量高，核酸提取质量好。
48.(2)本发明的基于磁珠的原核生物核酸快速方法，采用盐酸胍等离液剂与sds等表面活性剂共裂解的方法，促进核蛋白体的解体，使细菌核酸内切酶灭活，使释放的核酸不会被降解，达到一步裂解释放核酸的目的，采用磁珠结合，可以提取纯度高，完整性高和量高的原核生物核酸。
附图说明
49.图1是使用磁珠法手动提取核酸rna的电泳结果图；
50.图2是通过32样本通量核酸提取仪，使用磁珠法提取核酸rna的电泳结果图；
51.图3是通过96样本通量核酸提取仪，使用磁珠法提取核酸rna的电泳结果图；
52.图4是实施8-9中提取的核酸rna的电泳图。
具体实施方式
53.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
54.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
55.以下在提取原核生物中总rna的方法中所用到的塑料离心管和研磨管均经过121℃高压灭菌30min后，烘干备用；移液抢头(无菌无酶，购自axygen)；移液抢及实验操作台均经过30min紫外照射，并用rnazap擦拭；depc水是在去离子水中加入终浓度为0.1％的depc处理并经高温高压灭菌的。
56.磁珠：购自美吉逾华，rna吸附磁珠。
57.实施例1使用磁珠法快速从大肠杆菌样本中提取核酸rna
58.裂解缓冲液中各组分的浓度为：100mm tris-hcl、50mm edta、1％sds、1m氯化钠、5m盐酸胍、10％ tritonx-100，ph 6。
59.漂洗缓冲液为：75％乙醇(v/v)；
60.核酸洗脱液为：0.1％焦碳酸二乙酯(depc)，30min高压灭菌处理。
61.实验1.1手动提取原核生物rna包括如下具体步骤：
62.(1)将取大肠杆菌菌体沉淀50mg在频率为50hz下研磨18s(液氮研磨)，加入700μl裂解缓冲液混匀，25℃静置2.5min；
63.(2)静置后4℃、15000g离心2min收集上清；所得上清中加入200μl氯仿混合，摇匀，25℃静置3min；
64.(3)静置后4℃、15000g离心15min收集上清；所得上清中加入等体积异丙醇沉淀rna和20μl磁珠溶液，涡旋混匀30秒，在磁力架上吸附1min，弃上清；收集吸附后的磁珠，加入500μl 75％vol的乙醇水溶液，涡旋混匀30秒，重复2次，加入50μl 0.1％的焦碳酸二乙酯洗脱，获得总rna，提取的rna可立即使用或-80℃保存。
65.实验1.2通过32样本通量核酸提取仪，使用磁珠法快速从大肠杆菌样本中提取核酸rna
66.裂解缓冲液为：100mm tris-hcl、50mm edta、1％sds、1m氯化钠、5m盐酸胍、10％ tritonx-100，ph 6。
67.漂洗缓冲液为：75％乙醇(v/v)；
68.核酸洗脱液为：0.1％焦碳酸二乙酯(depc)，30min高压灭菌处理。
69.实验1.2通过32样本通量核酸提取仪，使用磁珠法提取核酸rna包括如下具体步骤：
70.(1)将取大肠杆菌菌体沉淀50mg在频率为50hz下研磨18s(液氮研磨)，加入700μl裂解缓冲液混匀，25℃静置2.5min；
71.(2)静置后4℃、15000g离心2min收集上清；所得上清中加入200μl氯仿混合，摇匀，25℃静置3min；
72.(3)静置后4℃、15000g离心15min收集上清；在96孔深孔板的第1、7列加入异丙醇和20μl磁珠溶液，第2、3、8和9列和加入500μl漂洗缓冲液，第4、10列加50μl核酸洗脱液；取步骤(2)所得上清加入96孔深孔板第1、7列，上清与异丙醇等体积，放入自动核酸提取器中，运行程序得到提取的原核生物核酸；
73.程序设置为：异丙醇沉淀和磁珠吸附-第一次漂洗-第二次漂洗-洗脱。
74.实验1.3通过96样本通量核酸提取仪，使用磁珠法快速从大肠杆菌样本中提取核酸rna
75.裂解缓冲液为：100mm tris-hcl、50mm edta、1％sds、1m氯化钠、5m盐酸胍、10％ tritonx-100，ph 6。
76.漂洗缓冲液为：75％乙醇(v/v)；
77.核酸洗脱液为：0.1％焦碳酸二乙酯(depc)，30min高压灭菌处理。
78.通过96样本通量核酸提取仪，使用磁珠法提取核酸rna包括如下具体步骤：
79.(1)将取大肠杆菌菌体沉淀50mg在频率为50hz下研磨18s(液氮研磨)，加入700μl裂解缓冲液混匀，25℃静置2.5min；
80.(2)静置后4℃、15000g离心2min收集上清；所得上清中加入200μl氯仿混合，摇匀，25℃静置3min；
81.(3)静置后4℃、15000g离心15min收集上清；1号孔板中加入异丙醇和20μl磁珠溶液，2号孔板和3号孔板中加入500μl漂洗缓冲液，4号孔板加50μl核酸洗脱液；取步骤(2)所得上清加入1号孔板中，上清与异丙醇等体积，放入自动核酸提取器中，运行程序得到提取的原核生物核酸；
82.程序设置为：异丙醇沉淀和磁珠吸附-第一次漂洗-第二次漂洗-洗脱。
83.利用nanodrop测量核酸浓度和纯度，1.5％琼脂糖电泳检测完整性；实验1.1、实验1.2、实验1.3的方法提取的核酸纯度和得率见表1。
84.表1
[0085][0086]
注：每个提取方法设三个重复，质检结果为平均值。
[0087]
结果表明，本方法可以完全提取革兰阴性细菌核酸，且核酸得率、核酸纯度高。
[0088]
实施例2从芽孢杆菌样本中提取核酸rna
[0089]
本实施例分别采用实施例1中的方法提取芽孢杆菌总rna，具体实验步骤参照实施例1。
[0090]
实验2.1采用实验1.1中试剂和方案进行提取芽孢杆菌总rna。
[0091]
实验2.2采用实验1.2中试剂和方案进行提取芽孢杆菌总rna。
[0092]
实验2.3采用实验1.3中试剂和方案进行提取芽孢杆菌总rna。
[0093]
提取后利用nanodrop测量核酸浓度和纯度，1.5％琼脂糖电泳检测完整性；本实施例中提取的芽孢杆菌核酸纯度和得率见表2。
[0094]
表2
[0095][0096]
注：每个提取方法设三个重复，质检结果为平均值。
[0097]
结果表明，本方法可以完全提取革兰阳性细菌核酸，且核酸得率、核酸纯度高。
[0098]
实施例3从放线菌样本中提取核酸rna
[0099]
本实施例分别采用实施例1的方法提取放线菌总rna，具体实验步骤参照实施例1。
[0100]
实验3.1采用实验1.1中试剂和方案进行提取放线菌总rna。
[0101]
实验3.2采用实验1.2中试剂和方案进行提取放线菌总rna。
[0102]
实验3.3采用实验1.3中试剂和方案进行提取放线菌总rna。
[0103]
提取后利用nanodrop测量核酸浓度和纯度，1.5％琼脂糖电泳检测完整性；本实施例方法提取的核酸纯度和得率见表3。
[0104]
表3
[0105][0106][0107]
注：每个提取方法设三个重复，质检结果为平均值。
[0108]
结果表明，本方法可以完全提取放线菌核酸，且核酸得率、核酸纯度高。
[0109]
实施例4从念珠藻样本中提取核酸rna
[0110]
本实施例分别采用实施例1的方法提取念珠藻总rna，具体实验步骤参照实施例1。
[0111]
实验4.1采用实验1.1中试剂和方案进行提取念珠藻总rna。
[0112]
实验4.2采用实验1.2中试剂和方案进行提取念珠藻总rna。
[0113]
实验4.3采用实验1.3中试剂和方案进行提取念珠藻总rna。
[0114]
提取后利用nanodrop测量核酸浓度和纯度，1.5％琼脂糖电泳检测完整性；本方法提取的核酸纯度和得率见表4。
[0115]
表4
[0116][0117]
每个提取方法设三个重复，质检结果为平均值。
[0118]
结果表明，本方法可以用于提取蓝藻核酸，且核酸得率、核酸纯度高。
[0119]
实施例5从嗜盐菌样本中提取核酸rna
[0120]
本实施例分别采用实施例1的方法提取嗜盐菌总rna，具体实验步骤参照实施例1。
[0121]
实验5.1采用实验1.1中试剂和方案进行提取嗜盐菌总rna。
[0122]
实验5.2采用实验1.2中试剂和方案进行提取嗜盐菌总rna。
[0123]
实验5.3采用实验1.3中试剂和方案进行提取嗜盐菌总rna。
[0124]
提取后利用nanodrop测量核酸浓度和纯度，1.5％琼脂糖电泳检测完整性；实验例方法提取的核酸纯度和得率见表5。
[0125]
表5
[0126][0127]
注：每个提取方法设三个重复，质检结果为平均值。
[0128]
结果表明，本方法可以完全提取古细菌核酸，且核酸得率、核酸纯度高。
[0129]
1.5％琼脂糖电泳检测完整性的结果如图1-3所示，其中，图1中，泳道1.2、泳道2.2、泳道3.2、泳道4.2、泳道5.2分别为实验1.2、2.2、3.2、4.2、5.2提取的核酸的电泳结果，上样量为250ng；泳道m表示蛋白分子量标准(trans 2kplus dnamarker)，上样量为100ng。
[0130]
图2中，泳道1.1、泳道2.1、泳道3.1、泳道4.1、泳道5.1分别为实验1.1、2.1、3.1、4.1、5.1提取的核酸的电泳结果，上样量为250ng；泳道m表示蛋白分子量标准(trans 2k plus dna marker)，上样量为100ng。
[0131]
图3中，泳道1.3、泳道2.3、泳道3.3、泳道4.3、泳道5.3分别为实施例1.3、2.3、3.3、4.3、5.3提取的核酸的电泳结果，上样量为250ng；泳道m表示蛋白分子量标准(trans 2k plus dna marker)，上样量为100ng。
[0132]
琼脂糖凝胶电泳结果表明，本方法可以完全提取革兰阴性细菌、革兰阳性细菌、放线菌、蓝藻、古细菌的核酸，且核酸得率、核酸纯度和核酸琼脂糖凝胶电泳结果较好。
[0133]
实施例6使用磁珠法快速从大肠杆菌样本中提取核酸rna
[0134]
本实施例提供一种基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，所述裂解缓冲液中各组分的浓度为：500mm tris-hcl、10mm edta、0.1％ sds、0.5m氯化钠、3m盐酸胍、10％ tritonx-100，ph 5；其余步骤参照实施例1。
[0135]
实施例7使用磁珠法快速从大肠杆菌样本中提取核酸rna
[0136]
本实施例提供一种基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，所述裂解缓冲液中各组分的浓度为：50mm tris-hcl、100mm edta、1％ sds、2m氯化钠、6m盐酸胍、2％ tritonx-100，ph 7；其余步骤参照实施例1。
[0137]
实施例6-7中提取核酸rna的检测结果如表6所示。
[0138]
表6
[0139][0140]
注：每个提取方法设三个重复，质检结果为平均值。
[0141]
实施例8使用磁珠法快速从大肠杆菌样本中提取核酸rna
[0142]
本实施例提供一种基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，所述裂解缓冲液中各组分的浓度为：100mm tris-hcl、50mm edta、1％ sds、0.14m氯化钠、2m盐酸胍、10％ tritonx-100，ph 6。
[0143]
利用nanodrop测量核酸浓度和纯度，1.5％琼脂糖电泳检测完整性，对比例方法提取的核酸纯度和得率见表7。图4核酸提取的核酸琼脂糖凝胶电泳结果(泳道1)。
[0144]
表7
[0145][0146]
注：每个提取方法设三个重复，质检结果为平均值。
[0147]
结果表明，此方案提取的大肠杆菌rna得率低，核酸琼脂糖凝胶电泳结果显示rna完整性较差。
[0148]
实施例9使用磁珠法快速从大肠杆菌样本中提取核酸rna
[0149]
本实施例提供一种基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，所述裂解缓冲液的ph为8。
[0150]
利用nanodrop测量核酸浓度和纯度，1.5％琼脂糖电泳检测完整性，对比例方法提取的核酸纯度和得率见表8。图4核酸提取的核酸琼脂糖凝胶电泳结果(泳道2)。
[0151]
表8
[0152][0153]
注：每个提取方法设三个重复，质检结果为平均值。
[0154]
结果表明，此方案提取的大肠杆菌rna得率低、纯度差，核酸琼脂糖凝胶电泳结果显示rna完整性较差。
[0155]
实施例10使用磁珠法快速从大肠杆菌样本中提取核酸rna
[0156]
本实施例提供一种基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，所述方法与实施例1的区别仅在于，所述胍盐为异硫氰酸胍。
[0157]
利用nanodrop测量核酸浓度和纯度，1.5％琼脂糖电泳检测完整性，对比例方法提取的核酸纯度和得率见表9。
[0158]
表9
[0159][0160]
结果表明，此方案提取的大肠杆菌rna得率高、纯度好。
[0161]
综上，本发明提供了一种用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液及采用所述裂解缓冲液提取原核生物菌体中rna的方法，所述裂解缓冲液中包含盐酸胍等离液剂与sds等表面活性剂，能够促进核蛋白体的解体，使细菌核酸内切酶灭活，使释放的核酸不会被降解，达到一步裂解释放核酸的目的。本发明中所述提取原核生物菌体中rna的方法步骤简单且步骤少，可实现人工操作和半自动化化操作，便于集成多种自动化核酸提取仪，样品通量高，核酸提取质量好，满足核酸提取速度、通量和核酸质量要求。
[0162]
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

技术特征：
1.一种用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液，其特征在于，所述裂解缓冲液中包括以下组分：tris-hcl、edta、sds、氯化钠、胍盐和tritonx-100。2.根据权利要求1所述的用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液，其特征在于，所述胍盐选自盐酸胍或硫氰酸胍中任意一种；优选地，所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％sds、0.5-2m氯化钠、3-6m胍盐、2-10％tritonx-100，ph为5-7。3.权利要求1或2所述的用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液在制备提取原核生物总rna的产品中的应用。4.一种基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，其特征在于，所述方法包括：采用低温研磨的方式处理原核生物细胞，采用权利要求1或2所述的用于提取原核生物总rna的裂解缓冲液裂解研磨产物，采用氯仿分离核酸与蛋白类杂质，采用异丙醇沉淀rna，采用磁珠吸附rna，收集吸附后的磁珠，依次进行漂洗和洗脱，获得总rna。5.根据权利要求4所述的基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，其特征在于，所述低温研磨为液氮研磨，所述低温研磨的频率为40-55hz，所述低温研磨的时间为15-20s。6.根据权利要求4或5所述的基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，其特征在于，所述裂解缓冲液与研磨产物混合后，静置并离心，收集上清液；优选地，所述静置的时间为2-3min，所述静置的温度为20-25℃；优选地，所述离心的离心力为14000-15000g，所述离心的时间为2-3min。7.根据权利要求4-6中任一项所述的基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，其特征在于，所述磁珠包括硅羟基磁珠或羧基磁珠。8.根据权利要求4-7中任一项所述的基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，其特征在于，所述漂洗采用的漂洗缓冲液为70-80％vol的乙醇水溶液。9.根据权利要求4-8中任一项所述的基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，其特征在于，所述洗脱采用的核酸洗脱液为0.1-0.2％的焦碳酸二乙酯水溶液。10.根据权利要求4-9中任一项所述的基于磁珠法提取原核生物总rna的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将原核生物沉淀进行液氮研磨，在频率为40-55hz下研磨15-20s，加入裂解缓冲液混匀，20-25℃静置2-3min；所述裂解缓冲液按浓度计包括：50-500mm tris-hcl、10-100mm edta、0.1％-10％sds、0.5-2m氯化钠、3-6m胍盐、2-10％tritonx-100，ph为5-7；所述胍盐选自盐酸胍或硫氰酸胍中任意一种；(2)14000-15000g离心2-3min收集上清；所得上清中加入氯仿混合，20-25℃静置3-4min；(3)14000-15000g离心15-18min收集上清；所得上清中加入等体积异丙醇沉淀rna，加入磁珠吸附rna；收集吸附后的磁珠，采用70-80％vol的乙醇水溶液漂洗，采用0.1-0.2％的焦碳酸二乙酯洗脱，获得总rna。

技术总结
本发明提供了一种用于提取原核生物总RNA的裂解缓冲液及其应用，所述裂解缓冲液中包括以下组分：Tris-HCl、EDTA、SDS、氯化钠、胍盐和TritonX-100。所述裂解缓冲液中包含胍盐等离液剂与SDS等表面活性剂，能够促进核蛋白体的解体，使细菌核酸内切酶灭活，使释放的核酸不会被降解，达到一步裂解释放核酸的目的。所述裂解缓冲液成分简单，裂解效果好，有利于原核生物菌体中RNA的释放。本发明还提供了一种基于磁珠法提取原核生物总RNA的方法，可实现人工操作和半自动化化操作，便于集成多种自动化核酸提取仪。最大程度简化了实验操作步骤，满足核酸提取速度、通量和核酸质量要求。通量和核酸质量要求。通量和核酸质量要求。


技术研发人员：李桃 董亚晨
受保护的技术使用者：上海美吉生物医药科技有限公司
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/7/7