一种具有广谱抗菌活性的刺孢壳属真菌F-XTBG8在制备抗真菌活性物质中的应用

raphigera）f-xtbg8在制备抗真菌活性物质中的应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 40274 ，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
12.本发明的有益效果为：本发明孢壳属真菌f-xtbg8对多种病原真菌的防治具有高效性，对稻瘟菌、大斑刚毛座腔菌、细极链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和轮纹镰刀菌的制率分别为84.17%、45.36%、65.74%、60.28%、71.67%和52.90%；在植物叶片半离体接种实验中，对稻瘟菌、大斑刚毛座腔菌、细极链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和轮纹镰刀菌引起的病斑抑制效果显著，在用于植物或作物上的病害防治生物菌剂开发上具有较高的应用价值。其发酵菌液可以显著减轻玉米大斑病、烟草黑斑病和赤霉病的发生。本发明为微生物源农药的研制和开发提供了优秀的生防菌株，为植物病害的绿色防控提供了新思路。
附图说明
13.图1中a、b、c、d、e、f分别为刺孢壳属真菌f-xtbg8对稻瘟菌、大斑刚毛座腔菌、细极链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和轮纹镰刀菌的抑制效果对比图；图2中a、b、c、d、e、f分别为刺孢壳属真菌f-xtbg8代谢产物4-异丙基苯甲酸（50μg/ml）对稻瘟菌、大斑刚毛座腔菌、细极链格孢菌、禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和轮纹镰刀菌的抑制效果对比图；图3中a、b、c、d分别为刺孢壳属真菌f-xtbg8发酵菌液对大斑刚毛座腔菌、细极链格孢菌、禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌在玉米、烟草、玉米和番茄叶片的半离体抑菌实验情况对比图；图4为菌株f-xtbg8以its序列最大似然分析构建的系统发育分类树。
具体实施方式
14.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
15.本发明提供了具有广谱抗菌活性的刺孢壳属真菌（chaetomella raphigera）f-xtbg8在制备抗真菌活性物质中的应用，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 40274 ，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2022-8-17。
16.被拮抗真菌分属于绒毛多孔菌属（abundisporus）、链格孢属（alternaria）、曲霉属（aspergillus）、顶多毛孢属（bartalinia）、刺盘孢属（colletotrichum）、棒孢菌属（corynespora）、耙齿菌属（emmia）、镰刀菌属（fusarium）、梨孢菌属（pyricularia）、毛霉属（mucor）、新赤壳属（neocosmospora）、新拟盘多毛孢属（neopestalotiopsis）、新茎点霉属（neosetophoma）、青霉属（penicillium）、多年卧孔菌属（perenniporia）、phaeophlebiopsis、裂褶菌属（schizophyllum）、突脐蠕孢属（exserohilum）、篮状菌（talaromyces）、栓菌属（trametes）、木霉属（trichoderma）和山田氏酵母属（yamadazyma）。
17.所述抗真菌活性物质为4-异丙基苯甲酸。
18.本发明还提供了具有广谱抗菌活性的刺孢壳属真菌f-xtbg8在防治植物病害中的应用。
19.所述植物病害包括稻瘟病、玉米大斑病、烟草黑斑病、赤霉病或镰刀菌枯萎病。
20.本发明进一步提供了基于刺孢壳属真菌f-xtbg8的一种微生物制剂，所述微生物制剂的有效成分为所述刺孢壳属真菌f-xtbg8及其发酵产物或发酵菌液。
21.刺孢壳属真菌f-xtbg8的发酵培养基为以1l计，所述发酵培养基含马铃薯浸出粉12g，葡萄糖20g，ph为5.4-5.8；发酵条件为：培养温度为28-30℃，震荡速度为180-200转/分钟，培养时间为120-170h。
22.本发明更进一步提供了所述的微生物制剂在防治植物病害中的应用，所述微生物制剂应的用方式为叶面喷施或灌根。
23.实施例1 菌株f-xtbg8的分离纯化与筛选1、菌株f-xtbg8的分离与纯化从西双版纳热带植物园（云南，勐腊）内采集蔓性野牡丹的气生根粘液于离心管中（采集时间：2020年5月），低温避光保存带回实验室处理。在超净工作台中用无菌枪头吸取200μl粘液置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（pda）平板中，用涂布棒涂板后密封置于恒温培养箱30℃培养72h。后挑取单菌落再次置于pda培养基中扩繁备用。
24.2、菌株f-xtbg8的筛选1、菌株生防功能初筛采用平板对峙实验进行菌株生防功能初筛，具体步骤如下：在pda培养基中接种稻瘟菌（magnaporthe oryzae）、大斑刚毛座腔菌（setosphaeria turcica）、细极链格孢菌（alternaria tenuissima）、禾谷镰刀菌（fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）和轮纹镰刀菌（fusarium concentricum）等常见病原菌（无菌枪头制成d=5mm的菌饼，接种在培养基中心）。将分离纯化得到的不同真菌用无菌枪头制成d=5mm的菌饼接种到到病原菌菌饼四周2cm位置，四个菌株呈十字形。以不接种真菌菌株的平板作为对照，30℃培7-10天，当空白平板长满时，观察接种来源于蔓性野牡丹气生根粘液真菌的平板的菌落状态，记录并选取具有抑菌效果的真菌进一步备用。
25.2、菌株生防功能复筛筛选方法同上，但每个平板接种病原菌后四周接种同一个候选菌株，对照不接菌且长满平板后，开始统计菌落直径，采用十字交叉法测定菌落直径，重复三次，记录菌株直径（如图1）。待测菌的对照生长量（菌落直径）和处理生长量（接种拮抗菌后的生长直径 ），用抑制率表示：抑制率（％）＝（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径
×
100％；结果：经过两次平板筛选，通过第二步平板筛选后得到对六种病原菌均具有抑制效果的潜在生防菌菌株f-xtbg8，经平板对峙实验，如表1所示，菌株f-xtbg8对稻瘟菌（magnaporthe oryzae）、大斑刚毛座腔菌（setosphaeria turcica）、细极链格孢菌（alternaria tenuissima）、禾谷镰刀菌（fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）和轮纹镰刀菌（fusarium concentricum）具有良好的抑制效果，抑制率分别为：84.17%、45.36%、65.74%、60.28%、71.67%和52.90%，因此选其为筛选的目标菌株。
26.表1 菌株f-xtbg 8对六种病原菌的抑制效果
27.实施例2 菌株f-xtbg8的抗菌谱确定采用平板对峙实验进行菌株f-xtbg8的抗菌谱确定，具体步骤如下：将分活化后的菌株f-xtbg8用无菌枪头制成d=5mm的菌饼接种到pda培养基中央，然后将活化后的常见病原真菌、真菌杂菌约100个菌株制成d=5mm的菌饼接种到f-xtbg8菌饼四周2cm位置，四个菌株呈十字形。30℃培10天，观察并记录常见病原菌、杂菌的菌落状态，记录菌落边缘变平直的菌株，即为被菌株f-xtbg8拮抗的菌株。
28.结果：经过平板对峙实验，我们发现如表2所示，被f-xtbg8显著抑制的菌株有77个，为60个种，分属于22个属。显然，f-xtbg8具有广谱的抗真菌活性。
[0029][0030]
表2 菌株f-xtbg 8的抗菌谱（部分）实施例3 菌株f-xtbg8的鉴定1、将菌株f-xtbg8挑单孢接种到pda培养基中培养，后刮取菌落边缘菌丝加入pdb液体培养基培养5d后沉淀离心，对菌体进行基因组dna提取，使用solarbio公司的 fungi genomic dna extraction kitd2300-100t（含rnase a)提取试剂盒按说明书中方法提取样品dna。
[0031]
2、以提取的dna为模板，对内部转录间隔区（internaltranscribedspacer，its）rrna基因序列和核糖体大亚基（ribosomal large subunit，lsu）rrna基因序列进行pcr序列扩增，引物序列分别为its1f（5
′‑
cttggtcatttagaggaagtaa-3
′
）与its4r（5
′‑
tcctccgcttattgatatgc-3
′
）、lsuf（5
′‑
acccgctgaacttaagc-3
′
）与lsur（5
′‑
tcctgagggaaacttcg-3
′
）由北京擎科生物科技有限公司合成，具体操作步骤参考该试剂盒说明书。
[0032]
3、用电泳仪检测菌pcr产物，用北京全式金生物有限公司的dna胶回收试剂盒切胶回收条带，回收的dna样品送至北京擎科生物科技有限公司测序确定its rrna和lsurrna基因序列，如seqid no.1和seq id no.2所示。
[0033]
4、将测序产生的dna序列通过于公共数据库ncbi的真菌its rdna进行blast (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/blast.cgi)比对，通过同源性检测、构建系统发育分
类树以及结合形态鉴定，如图4所示，最后确定菌株f-xtbg8为chaetomellaraphigera。
[0034]
实施例4 菌株 f-xtbg8发酵菌液的制备将刺孢壳属真菌菌株f-xtbg8等的单孢子在pda培养基中（马铃薯浸出粉：12g/l，葡萄糖20g/l，琼脂：20g/l，ph 5.6，121℃高温灭菌15分钟）中在30℃的恒温培养箱5天，长出菌落后挑取边缘新鲜菌丝转接入含有50ml pdb液体培养基的锥形瓶中，放置于恒温摇床中30℃、180转/分钟培养10d，得到发酵菌液。经测定，该发酵菌液中含有抗菌物质4-异丙基苯甲酸。
[0035]
实施例5菌株 f-xtbg8发酵菌液的制备将刺孢壳属真菌菌株f-xtbg8等的单孢子在pda培养基中（马铃薯浸出粉：12g/l，葡萄糖20g/l，琼脂：20g/l，ph 5.8，121℃高温灭菌15分钟）中在28℃的恒温培养箱7天，长出菌落后挑取边缘新鲜菌丝转接入含有50ml pdb液体培养基的锥形瓶中，放置于恒温摇床中30℃、200转/分钟培养10d，得到发酵菌液。经测定，该发酵菌液中含有抗菌物质4-异丙基苯甲酸。
[0036]
实施例6 菌株 f-xtbg8发酵菌液的制备将刺孢壳属真菌菌株f-xtbg8等的单孢子在pda培养基中（马铃薯浸出粉：12g/l，葡萄糖20g/l，琼脂：20g/l，ph 5.4，121℃高温灭菌15分钟）中在29℃的恒温培养箱6天，长出菌落后挑取边缘新鲜菌丝转接入含有50ml pdb液体培养基的锥形瓶中，放置于恒温摇床中30℃、190转/分钟培养10d，得到发酵菌液。
[0037]
实验例1 化合物4-异丙基苯甲酸的抑菌效果鉴定1、称取1g4-异丙基苯甲酸（购于麦克林，纯度为98%）溶于10ml甲醇溶液中，配置成浓度为100mg/ml工作母液。
[0038]
2、取250μl工作母液加入到499.75mlpda培养基中（55℃，混匀），每皿20ml倒平板，制成浓度为50μg/ml的含药平板。
[0039]
3、使用灭菌枪头分别将f-xtbg8、稻瘟菌（magnaporthe oryzae）、大斑刚毛座腔菌（setosphaeria turcica）、细极链格孢菌（alternaria tenuissima）、禾谷镰刀菌（fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）和轮纹镰刀菌（fusarium concentricum）边缘新鲜菌落制成d=5mm的菌饼，接种在50μg/ml的含药平板上，以接种在加入相同体积甲醇的平板作为空白对照（如图2），培养条件为：恒温培养箱30℃、10d。
[0040]
4、采用十字交叉法测定菌落直径，重复三次，记录菌株直径。待测菌的对照生长量（菌落直径）和处理生长量（接种于含药平板的生长直径 ），用抑制率表示：抑制率（％）＝（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径
×
100％；结果如表3所示，50μg/ml的4-异丙基苯甲酸对稻瘟菌（magnaporthe oryzae）、大斑刚毛座腔菌（setosphaeria turcica）、细极链格孢菌（alternaria tenuissima）、禾谷镰刀菌（fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）和轮纹镰刀菌（fusarium concentricum）的抑制率分别为：9.75%、38.60%、28.08%、16.94%、39.83%、29.98%。
[0041]
表3 4-异丙基苯甲酸对六种病原菌的抑制效果
[0042]
实验例2 菌株f-xtbg8的发酵菌液对4种病原菌的半离体防效实验一、试验方法：1、试验设计对照组和处理组。选取健康、长势一致的玉米、烟草、番茄叶片，用无菌水冲洗后，用吸水纸吸干表面水分，在超净工作台中用灭菌手术剪将叶片裁剪成3cm
×
3cm的叶块，用无菌针头在叶块中间刺破一个创口。对照组：将叶块在空白pdb（加入0.1% 吐温20）中浸泡30s，将生长一致的病原菌饼（d=5mm）接种到创口处；处理组：再将叶块在实施例4中制备的f-xtbg8发酵菌液（加入0.1% 的吐温20）中浸泡30s，再将生长一致的病原菌饼（d=5mm）接种到创口处。然后将叶块放置于垫有单层滤纸并加入5ml无菌水的直径为14cm的无菌玻璃培养皿中。每个培养放置10个叶块。
[0043]
2、放置完成后盖上皿盖，置于30℃恒温培养箱中，隔天观察叶片发病情况。
[0044]
3、待生长至3天后统计发病情况。
[0045]
1级：无病症、病原菌菌丝不生长；3级：叶块少量部位轻微黄化、创口处轻微坏死、病原菌菌丝基本不生长；5级：叶块一半颜色黄化、创口处坏死较少、病原菌菌丝少量生长；7级：叶块超过3/4部分黄化、创口处坏死某些、病原菌菌丝生长较多；9级：叶块整体黄化失绿，创口水渍状大量坏死，菌丝生长旺盛。
[0046]
病情指数＝[σ(各级发病叶块数
×
相对级数值)/(总叶块数
×
最高级数代表值)]
×
100。
[0047]
本实验例中每个处理的叶块数为10，最高级数代表值为9。
[0048]
二、结果分析：由图3可知，对于大斑刚毛座腔菌、细极链格孢菌和禾谷镰刀菌，处理组的叶块在实施例3中制备的f-xtbg8发酵菌液处理后，症状有明显缓解，相对于对照组，叶块无明显黄化、坏死，病原菌菌丝生长受到抑制。而对于番茄叶片上的尖孢镰刀菌，处理组和对照组差异不明。
[0049]
表4菌株f-xtbg8对四种病原菌的发病抑制情况
[0050]
由表4可知，对照组由大斑刚毛座腔菌、细极链格孢菌和禾谷镰刀菌致使的叶片病变的病情指数分别为56、58、62，而施用f-xtbg8发酵菌液的处理组的叶片病变的病情指数分别为16、26、13，相较于对照组有显著降低。
[0051]
综上可知，本发明菌株f-xtbg8可以有效防止大斑刚毛座腔菌（setosphaeria turcica）、细极链格孢菌（alternaria tenuissima）和禾谷镰刀菌（fusarium graminearum）等引起的作物病害，此外，该菌株对大稻瘟菌（magnaporthe oryzae）、广谱病原菌尖孢镰刀菌（fusarium oxysporum）和轮纹镰刀菌（fusarium concentricum）也有代谢物和平板抑制效果，可以用于多种重要作物病害的生物防治。

技术特征：
1.具有广谱抗菌活性的刺孢壳属真菌（chaetomella raphigera）f-xtbg8在制备抗真菌活性物质中的应用，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no. 40274 ，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，被拮抗真菌分属于绒毛多孔菌属（abundisporus）、链格孢属（alternaria）、曲霉属（aspergillus）、顶多毛孢属（bartalinia）、刺盘孢属（colletotrichum）、棒孢菌属（corynespora）、耙齿菌属（emmia）、镰刀菌属（fusarium）、梨孢菌属（pyricularia）、毛霉属（mucor）、新赤壳属（neocosmospora）、新拟盘多毛孢属（neopestalotiopsis）、新茎点霉属（neosetophoma）、青霉属（penicillium）、多年卧孔菌属（perenniporia）、phaeophlebiopsis、裂褶菌属（schizophyllum）、突脐蠕孢属（exserohilum）、篮状菌（talaromyces）、栓菌属（trametes）、木霉属（trichoderma）和山田氏酵母属（yamadazyma）。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗真菌活性物质为4-异丙基苯甲酸。4.具有广谱抗菌活性的刺孢壳属真菌f-xtbg8在防治植物病害中的应用。5.根据权利要求4所述应用，所述植物病害包括稻瘟病、玉米大斑病、烟草黑斑病、赤霉病或镰刀菌枯萎病。6.基于刺孢壳属真菌f-xtbg8的一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂的有效成分为所述刺孢壳属真菌f-xtbg8及其发酵产物或发酵菌液。7.根据权利要求6所述微生物制剂，其特征在于，刺孢壳属真菌f-xtbg8的发酵培养基为以1l计，所述发酵培养基含马铃薯浸出粉12g，葡萄糖20g，ph为5.4-5.8；发酵条件为：培养温度为28-30℃，震荡速度为180-200转/分钟，培养时间为120-170h。8.权利要求6所述的微生物制剂在防治植物病害中的应用，其特征在于，所述微生物制剂应用方式为叶面喷施或灌根。

技术总结
本发明公开了一种广谱抗菌的生防刺孢壳属真菌F-XTBG8在制备抗真菌活性物质中的应用。本发明广谱抗菌的生防刺孢壳属真菌（Chaetomella raphigera）F-XTBG8的应用为在制备抗真菌活性物质中的应用。该菌株对100多种环境真菌和植物病原真菌包括稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）、大斑刚毛座腔菌（Setosphaeria turcica）、细极链格孢菌（Alternaria tenuissima）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和轮纹镰刀菌（Fusarium concentricum）有明显的拮抗作用，其发酵菌液可以显著减轻玉米大斑病、烟草黑斑病和赤霉病的发生。本发明为微生物源农药的研制和开发提供了优秀的生防菌株，为植物病害的绿色防控提供了新思路。供了新思路。供了新思路。


技术研发人员：徐鹏 毛新雨 庞志强 刘贵周
受保护的技术使用者：中国科学院西双版纳热带植物园
技术研发日：2023.04.04
技术公布日：2023/7/7