PECAM-1靶向性诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用

ch水溶液，向该溶液中滴加氯仿，边滴加边超声，旋蒸除去氯仿，将得到的hcnps水溶液离心，弃沉淀并充分冻干得到hcnps纳米粒粉末。
13.本发明第二方面涉及前述方法制备而得的αpecam-1_at@hcnps纳米粒子。本条所述的纳米粒子虽然可由前述的方法制备而得，但并不因此严格限定其必须采用前述的方法，而应当考虑纳米粒子的性质。
14.本发明第三方面涉及αpecam-1_at@hcnps纳米粒子在制备检测或抑制car-t治疗中发生crs风险的产品中的应用。其中，crs主要发生在嵌合抗原受体t细胞免疫疗法中，通过本发明的纳米粒子可以实现对crs进行检测，可以更好的监测car-t治疗过程，对风险进行排查。并且，还可通过纳米粒子抑制嵌合抗原受体t细胞免疫治疗中crs的发生。
15.本发明第四方面涉及αpecam-1_at@hcnps纳米粒子在制备crs内皮损伤的显影剂中的应用。其中，αpecam-1_at@hcnps纳米粒子还可对发生crs时产生的内皮损伤等进行监测，可以更为直观的确定内皮损伤发生的位置。
16.本发明第五方面涉及αpecam-1_at@hcnps纳米粒子在制备抑制crs系统性炎症反应疾病的药物中的应用，其中，所述crs系统性炎症反应疾病包括血管内皮损伤、血管屏障功能障碍。通过以胞外断裂点作为靶点递送相关药物和核素探针有助于促进内皮重建、减轻crs，而本发明则提供该种可以实现促内皮重建、减轻crs的pecam-1诊疗一体化纳米探针。
17.本发明的有益效果是：利用具有适合car-t治疗时间窗半衰期(6～8天)的核素标记单链抗体4g6早期捕捉crs靶器官微血管显影；同时引导具有良好生物相容性的纳米粒装载at，在crs损害局部精准释放，抑制过渡凝血活化并减轻炎症，该策略能够早期监测与干预crs，具有较大的临床转化价值。
附图说明
18.图1为car-t治疗相关crs内皮损伤模型。
19.图2为以小动物活体成像检测淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷情况。(a)elisa检测发现给予car-t后，小鼠外周血il-1β(b)和il-6(c)明显升高；凝血指标检测揭示crs过程中aptt延长并有统计学差异(d)，pt和对照组无明显差异(e)；免疫组织化学显示经治疗后，大量car-t归巢到肿瘤中，且招募了大量巨噬细胞(f)；crs模型小鼠体内各脏器的h&e染色图(g)。
20.图3为
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lu-αpecam-1-at@hcnps纳米探针的表征。(a)tem观察纳米探针的形貌；(b)dls检测纳米探针的粒径分布情况。
21.图4为以dir替代性标记纳米粒检测
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lu-αpecam-1-at@hcnps纳米探针在crs小鼠模型的体内分布情况。(a)小动物活体成像检测αpecam-1-dir@hcnps在crs小鼠心、肝、脾、肺和肾中的生物分布；(b)定量分析αpecam-1-dir@hcnps在各个脏器中的荧光强度；
22.图5为经
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lu-αpecam-1-at@hcnps干预后，检测上述各组模型鼠血浆炎症因子水平；
23.图6为比较肝、肺等脏器白细胞浸润情况；评估干预措施对体内炎性反应的影响；
24.图7为利用免疫荧光技术评估大分子渗漏情况；
25.图8为
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lu-αpecam-1-at@hcnps纳米探针涉及研究思路模型。
具体实施方式
26.下面对本发明做进一步说明：
27.(一)实验方法
28.1.建立car-t治疗相关crs内皮损伤模型
29.a.制备cd19 car-t细胞：单采健康人外周血，分离pbmc，使用磁珠分选出cd4
+
t细胞及cd8
+
t细胞，分别加入预包被cd3、cd28因子的细胞培养瓶，并使用il-2、ifn-γ进行刺激，让其更快生长和分裂。根据一定的moi值加入慢病毒进行转染，五天后洗去病毒。取少量细胞进行细胞因子释放检测、杀伤检测、pcr检测、流式检测转染率，确定car-t细胞功能是否完善；
30.b.car-t回输后诱导小鼠crs：d0准备雌性、6-8周龄的scid beige小鼠若干只，每只腹腔种植5
×
106荧光素酶标记的raji细胞；于d3、d7、d10、d14行活体荧光成像，评估肿瘤负荷，排除极端负荷小鼠。d14对每只实验组小鼠腹腔注射30
×
106car-t，对照组等量生理盐水，d16实验组小鼠可检测到crs。
31.2.pecam-1诊疗一体化纳米探针的制备和表征
32.a.通过经典的pickering乳溶剂挥发法制备载药纳米粒(hcnps)，即将50mg hes-ch溶于50ml去离子水中，使用超声破碎仪超声促溶10min(频率为50hz，超2s，停1s)，得到1mg/ml的hes-ch水溶液，随后向该溶液中缓慢滴加5ml氯仿，边滴加边用超声破碎仪超声5min，得到乳白色的均匀油/水混合溶液，随后以旋转蒸发仪在45℃条件下充分旋蒸以除去氯仿，其后将得到的hcnps水溶液离心(5000rpm，10min)，弃沉淀并充分冻干，得到hcnps纳米粒粉末。同样，按照上述方法制备dir@hcnps纳米粒：在得到1mg/ml的hes-ch水溶液后，向该溶液中缓慢滴加5ml1,1-二十八烷基-3,3,3,3-四甲基-吲哚三羰花菁碘化物(dir)的氯仿溶液(1mg/ml)，余步骤相同；
33.b.放射性核素
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lu标记抗体：首先将肼基烟酰胺(hynic)与pecam-1-4g6在酸性环境下反应2h；再将产物过滤后在还原剂条件下与新鲜
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lu洗液反应30min。取少量反应产物做放射薄层层析测量标记率；使用pd-10柱子进行纯化，并用放射薄层层析法测量放化纯；
34.c.
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lu-αpecam-1-at@hcnps的制备和表征：室温条件下，向1mg/ml hcnps水溶液中加入足量n,n'-碳酸二琥珀酰亚胺基(dsc)，搅拌过夜，随后透析24h，再加入25ug核素标记的pecam-1-4g6 mab，室温下搅拌反应3h，最终得到pecam-1-hcnps纳米粒水溶液；同样，按照上述方法制备pecam-1-dir@hcnps(利用荧光素标记探针，并研究纳米探针体内分布)。将抗凝血酶(at)与上述纳米粒子等比例共同溶解于超纯水，搅拌2小时，at通过静电作用吸附负载至纳米粒上。所得的αpecam-1-at@hcnps纳米粒通过超滤，除去未包载负载的at，得到纯化的αpecam-1-at@hcnps。该纳米探针微观形貌通过动态光散射(dls)和透射电镜(tem)观察(结果如图3中所示)。
35.3.
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lu-αpecam-1-at@hcnps的显像特异性
36.177
lu-αpecam-1-at@hcnps在crs小鼠体内靶向炎性内皮成像功能检测：从模型小鼠尾静脉注射
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lu-αpecam-1-at@hcnps，采用spect分析采集的图像，定量分析找出高显影部位，评价纳米探针的成像灵敏度较高。完成spect检查后，取脑、心、肝、脾、肺、肾等脏器组织分别检测各脏器中的核素量，了解其生物分布。
37.4.
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lu-αpecam-1-at@hcnps的内皮重建与抗炎功能评价
38.a.crs模型小鼠经
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lu-αpecam-1-at@hcnps干预后，应用血细胞分析仪检测各组模型小鼠血细胞比容，以衡量液体渗漏情况；尾静脉输注荧光标记的低/高分子右旋糖酐，利用免疫荧光技术评估大分子渗漏情况(结果图图7所示)；
39.b.经
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lu-αpecam-1-at@hcnps干预后，检测上述各组模型鼠血浆炎症因子水平(结果如图5所示)，比较肝、肾、肺等脏器白细胞浸润情况，评估干预措施对体内炎性反应的影响，如图6所示
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lu-αpecam-1-at@hcnps干预后可有效的干预缓解体内炎性反应；
40.c.组织、器官炎症程度评估：经
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lu-αpecam-1-at@hcnps干预后，将小鼠麻醉后取肝、肺、肾，通过h&e染色观察组织、器官炎症反应程度，利用免疫组化观察组织器官粒细胞浸润情况。
41.(二)分析：car-t细胞因子风暴(crs)是由促炎因子作用于肺、肝等脏器微血管内皮引起的急性炎症综合征，其机制与crs导致血管屏障受损，内皮细胞表面血管内皮黏附因子1(pecam-1)断裂致血浆可溶性pecam-1(specam-1)增加有关。以pecam-1胞外断裂点为靶点检测crs对内皮系统的破坏程度，能否实现对crs的早期监测和干预还未明确。本发明提出以pecam-1为靶点，并通过核素标记靶向pecam-1igd6的单抗(4g6)并修饰载at纳米粒，实现crs局部显像及炎症抑制，为crs早期监测与干预提供新技术。如图8中，本发明通过制备靶向性pecam-1诊疗一体化纳米探针，将利用具有适合car-t时间窗示踪半衰期(6～8天)的核素
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lu标记可靶向pecam-1上igd6区的抗体4g6，构建
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lu-αpecam-1连接的纳米粒(hcnps)，并吸附大分子药物(抗凝血酶at)。
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lu-αpecam-1-at@hcnps在核素
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lu标记单链抗体4g6引导下实现早期捕捉crs靶器官显影；同时纳米粒在crs损害局部精准释放所装载的at，抑制过渡凝血活化并减轻炎症，均证明了本发明涉及的纳米粒子对crs监测和治疗的有效性。
42.本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

技术特征：
1.pecam-1靶向性诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，包括下述步骤s1、获取放射性核素标记的pecam-1_4g6mab：将肼基烟酰胺与pecam-1-4g6在酸性环境下反应，将反应所得产物过滤后在还原剂条件下与放射性核素洗液反应，获得核素标记的pecam-1_4g6mab；s2、获取αpecam-1-at@hcnps：向hcnps纳米粒的水溶液中加入足量n,n'-碳酸二琥珀酰亚胺基，混匀，透析，加入核素标记的pecam-1_4g6mab，室温反应，得到αpecam-1-hcnps纳米粒水溶液，然后将αpecam-1-hcnps纳米粒子与抗凝血酶等比例共同溶解，使抗凝血酶通过静电作用吸附负载至pecam-1-hcnps纳米粒子上，纯化获得αpecam-1-at@hcnps。2.根据权利要求1所述的pecam-1靶向性诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，所述放射性核素为
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lu；所述还原剂为碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺。3.根据权利要求1所述的pecam-1靶向性诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤s2中：加入
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lu标记的pecam-1_4g6mab，室温搅拌反应后获得
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lu-αpecam-1-hcnps纳米粒水溶液。4.根据权利要求1所述的pecam-1靶向性诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤s2中，抗凝血酶静电吸附负载至抗凝血酶后：进行超滤，出去未包载负载的抗凝血酶，获得纯化的αpecam-1-at@hcnps。5.根据权利要求1所述的pecam-1靶向性诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，步骤s2中：αpecam-1-hcnps纳米粒子与抗凝血酶等比例共同溶解于超纯水，搅拌反应，使抗凝血酶静电负载。6.根据权利要求1所述的pecam-1靶向性诊疗一体化纳米探针的制备方法，其特征在于，所述hcnps纳米粒的制备方法为：将hes-ch溶于水中，超声，得hes-ch水溶液，向该溶液中滴加氯仿，边滴加边超声，旋蒸除去氯仿，将得到的hcnps水溶液离心，弃沉淀并充分冻干得到hcnps纳米粒粉末。7.权利要求1-6任一方法制备而得的αpecam-1-at@hcnps纳米粒子。8.权利要求7中的αpecam-1-at@hcnps纳米粒子在制备检测或抑制car-t治疗中发生crs的产品中的应用。9.权利要求7中的αpecam-1-at@hcnps纳米粒子在制备crs内皮损伤的显影剂中的应用。10.权利要求7中的αpecam-1-at@hcnps纳米粒子在制备抑制crs系统性炎症反应疾病的药物中的应用，其中，所述crs系统性炎症反应疾病包括血管内皮损伤、血管屏障功能障碍。

技术总结
本发明属于纳米探针技术领域，具体公开PECAM-1靶向性诊疗一体化纳米探针及其制备方法和应用。包括获取PECAM-1_4G6mAb：将肼基烟酰胺与PECAM-1_4G6在酸性环境下反应，将反应所得产物过滤后在还原剂条件下与放射性核素洗液反应，获得PECAM-1_4G6mAb；获取αPECAM-1_AT@HCNPs：向HCNPs纳米粒的水溶液中加入足量N,N'-碳酸二琥珀酰亚胺基，加入PECAM-1_4G6mAb，室温反应，得到αPECAM-1-HCNPs纳米粒水溶液，然后将αPECAM-1_HCNPs纳米粒子与抗凝血酶等比例共同溶解，使抗凝血酶通过静电作用吸附负载至PECAM-1_HCNPs纳米粒子上，纯化获得αPECAM-1_AT@HCNPs。本发明：利用具有适合CAR-T治疗时间窗半衰期(6～8天)的核素标记单链抗体4G6早期捕捉CRS靶器官微血管显影。单链抗体4G6早期捕捉CRS靶器官微血管显影。单链抗体4G6早期捕捉CRS靶器官微血管显影。


技术研发人员：梅恒 胡豫 陈钊钊 罗丽丽
受保护的技术使用者：华中科技大学同济医学院附属协和医院
技术研发日：2023.03.24
技术公布日：2023/7/7