用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记

al.2015；du et al.2016；kang et al.2017；arimura et al.2018)。因此我们推测，ogura cmsr3虽然经过数次改良，但其细胞质中仍保留了许多萝卜细胞质成分，诸多不良性状可能是由于异源细胞质片段与核基因不协调导致的。
6.我们采用二代illumina hiseq结合三代ont测序技术，对甘蓝ogura cmsr3品种cmsr302-12及其保持系02-12的叶绿体和线粒体基因组进行测序和比对分析。我们发现cmsr302-12线粒体基因组中含有35,618bp的萝卜线粒体基因组片段，占线粒体dna(mtdna)的13.84％。虽然通过高通量测序技术能够准确地检测甘蓝ogura cms材料中的异源线粒体片段，但存在周期长、花费高等缺点。因此，有必要针对甘蓝ogura cms开发异源线粒体片段的特异性标记，用于快速准确鉴定甘蓝ogura cms材料中萝卜线粒体基因组片段的相对含量，以便更好地挖掘异源胞质含量更少的甘蓝细胞质雄性不育源。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是如何快速、准确并且经济地鉴定甘蓝ogura细胞质雄性不育系(简称cms)中异源萝卜线粒体片段的存在、缺失和/或序列。
8.为解决上述技术问题，本发明提供用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记，其特征在于，包括标记ac1～ac16中的一个或更多个或全部；所述ac1～ac16的核苷酸序列如seq id no：1～16所示。
9.本发明还提供用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的引物组，其特征在于，包括引物对ac1p～ac16p中的一对或更多对或全部；
10.所述ac1p～ac16p分别用于扩增核苷酸序列如seq id no：1～16所示的异源萝卜线粒体片段；
11.所述ac1p～ac16p的序列信息如下：
12.[0013][0014]
本发明还提供用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述引物组。
[0015]
优选地，所述引物组中的每一种引物均独立包装，为液态或粉末状。
[0016]
优选地，所述试剂盒还包含用于进行pcr和/或凝胶电泳的通用试剂。
[0017]
所述通用试剂可以是dna聚合酶、pcr缓冲液、tbe缓冲液、核酸染料等。
[0018]
上述scar标记或上述引物组或任一上述试剂盒在检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段中的应用也属于本发明的保护范围。
[0019]
本发明还提供一种检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的方法，其特征在于，包括：
[0020]
a)提取待测甘蓝ogura细胞质雄性不育系样品的基因组dna；
[0021]
b)以所述基因组dna为模板，利用上述引物对进行pcr；
[0022]
c)检测pcr产物以确定所述样品的基因组dna中是否包含相应的异源萝卜线粒体片段或者所包含的异源萝卜线粒体片段的序列。
[0023]
优选地，通过凝胶电泳或测序的方法来检测pcr产物。
[0024]
所述凝胶电泳可以是琼脂糖凝胶电泳。
[0025]
pcr产物经凝胶电泳后，若出现引物对扩增的相应大小的特征条带，则所述样品的基因组dna中包含相应的异源萝卜线粒体片段；若没有出现引物对扩增的相应大小的特征条带，则所述样品的基因组dna中不含相应的异源萝卜线粒体片段。进一步地，所述样品的基因组dna中包含的异源萝卜线粒体片段的序列可以通过测序确定。
[0026]
优选地，pcr体系包含：10μmol/l正反向引物各1μl，2
×
pcr mix 10μl，ddh2o 7μl，基因组dna 1μl；pcr程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火15～60s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。
[0027]
优选地，在待测甘蓝ogura细胞质雄性不育系的苗期进行异源萝卜线粒体片段的检测。
[0028]
本发明成功开发出用于快速准确鉴定甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac1～ac16，以及用于扩增ac1～ac16的引物对ac1p～ac16p。经实验证明，ac1p～ac16p在已知含有35,618bp萝卜线粒体基因组片段的甘蓝ogura cms品种“cmsr302-12”和萝卜品种“rfrs”中均扩增出相应的目的片段，而在不含萝卜线粒体基因组片段的自交系甘蓝品种“02-12”中无扩增产物。利用ac1p～ac16p检测96份甘蓝自交系材料，均无扩增产物。利用ac1p～ac16p检测8株甘蓝ogura细胞质雄性不育系，从7株中扩增出
全部16个scar标记，从1株中扩增出7个scar标记。因此，本发明的标记和引物具有特异性强、稳定性好的优点。
[0029]
采用引物对ac1p～ac16p进行甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的辅助鉴定，操作简便易行，在幼苗期就能够快速鉴定出目标株系中含有的萝卜线粒体基因组片段，从而有针对性地选苗定植和配制杂交组合。本发明的方法不需要等待漫长的植株生长阶段，不受环境条件和人为因素的影响，大大缩短了甘蓝细胞质雄性不育系的选育周期，提高了育种效率，降低了育种成本。
附图说明
[0030]
图1为引物对ac1p～ac16p在已知含有35,618bp异源萝卜线粒体片段的甘蓝ogura cms品种“cmsr302-12”中的扩增情况。泳道m为2000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增产物，其大小分别为737bp、564bp、790bp、898bp、587bp、729bp、988bp、789bp、774bp、779bp、788bp、669bp、897bp、902bp、1019bp、967bp。
[0031]
图2为引物对ac1p～ac16p在已知含有35,618bp异源萝卜线粒体片段的萝卜品种“rfrs”中的扩增情况。泳道m为2000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对aclp～ac16p的扩增产物，其大小分别为737bp、564bp、790bp、898bp、587bp、729bp、988bp、789bp、774bp、779bp、788bp、669bp、897bp、902bp、1019bp、967bp。
[0032]
图3为引物对ac1p～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“j34”中的扩增情况。泳道m为5000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增结果。
[0033]
图4为引物对ac1p～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“j35”中的扩增情况。泳道m为5000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增结果。
[0034]
图5为引物对ac1p～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“2177”中的扩增情况。泳道m为5000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增结果。
[0035]
图6为引物对ac1p～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“2183”中的扩增情况。泳道m为5000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增结果。
[0036]
图7为引物对aclp～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“2185”中的扩增情况。泳道m为5000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增结果。
[0037]
图8为引物对ac1p～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“2186”中的扩增情况。泳道m为5000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增结果。
[0038]
图9为引物对ac1p～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“2147”中的扩增情况。泳道m为5000bp的dna marker：泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增结果。
[0039]
图10为引物对ac1p～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“2202”中的扩增情况。泳道m为2000bp的dna marker；泳道1～16依次为引物对ac1p～ac16p的扩增结果。
[0040]
上述2000bp的dna marker的dna条带分别为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
[0041]
上述5000bp的dna marker的dna条带分别为：5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
具体实施方式
[0042]
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚和完整的描述。需要说明的是，以下实施例只是本发明的部分实施例，而不是全部实施例；并且以下实施例仅用于解释和说明本发明的技术方案，而不用于限制本发明的范围。
[0043]
以下实施例中使用的生物材料：
[0044]
甘蓝“cmsr302-12”为已知的甘蓝ogura cms品种，已在非专利文献(王庆彪，两种类型甘蓝雄性不育系开花结实性状及异源胞质分子差异的研究，2010年中国农业科学院硕士论文)中公开。
[0045]
甘蓝“02-12”为已知的甘蓝自交系品种，已在非专利文献(王庆彪，两种类型甘蓝雄性不育系开花结实性状及异源胞质分子差异的研究，2010年中国农业科学院硕士论文)中公开。
[0046]
萝卜“rfrs”为已知的萝卜品种，已在非专利文献(任文静，甘蓝高代回交ogura cms育性恢复材料的创制及其利用，2021年中国农业科学院硕士论文)中公开。
[0047]
96份甘蓝自交系材料：为甘蓝高代自交系，由本实验室创制，已在非专利文献(李志远，kasp标记用于甘蓝指纹图谱构建及杂种优势群划分，2018年中国农业科学院硕士论文)中公开，参见第二章2.1.1供试材料。
[0048]
8株甘蓝ogura细胞质雄性不育系：“j34”、“j35”、“2177”、“2183”、“2185”、“2186”、“2147”、“2202”均为本实验室创制的材料，已在非专利文献(任文静，甘蓝高代回交ogura cms育性恢复材料的创制及其利用，2021年中国农业科学院硕士论文)中公开。
[0049]
以上生物材料可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝青花菜课题组获得。
[0050]
以下实施例中使用的主要试剂：
[0051]2×
rapid taq master mix，购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，产品目录号：p222-03。
[0052]
若未特别说明，以下实施例中所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例中所使用的实验方法和条件均为本领域常规的实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。
[0053]
实施例1.用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记的开发
[0054]
我们采用二代illumina hiseq结合三代ont测序技术，对甘蓝ogura cms品种“cmsr302-12”及其保持系“02-12”的叶绿体和线粒体基因组进行测序和比对分析。我们发现cmsr302-12线粒体基因组中含有35,618bp的萝卜线粒体基因组片段，占线粒体dna(mtdna)的13.84％。然后我们针对甘蓝ogura细胞质雄性不育系中的异源萝卜线粒体序列开发scar标记并设计引物。委托苏州金唯智生物科技有限公司合成引物。利用本实验室保存的已知不含异源萝卜线粒体片段的甘蓝自交系品种“02-12”以及已知含有35,618bp异源萝卜线粒体片段的甘蓝ogura cms品种“cmsr302-12”和萝卜品种“rfrs”筛选scar标记和引物。筛选方法如下：
[0055]
用ctab(十六烷基三乙基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide)法分
别提取甘蓝自交系品种“02-12”、甘蓝ogura cms品种“cmsr302-12”、萝卜品种“rfrs”的叶片基因组dna。基因组dna提取方法参见murray mg，thompson wf(1980)rapid isolation of high molecular weight plant dna.nucleic acids res 8：4321-4325。以基因组dna为模板，使用设计的引物，按照下列体系和程序进行pcr反应。
[0056]
pcr体系(20μl)：10μmol/l正反向引物各1μl，2
×
rapid taq master mix 10μl，基因组dna 1μl，ddh2o7μl。
[0057]
pcr程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。
[0058]
使用l％琼脂糖凝胶对pcr产物进行电泳检测，150v恒压15min，利用紫外光凝胶成像仪拍照。
[0059]
最终筛选到16个用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的特异性scar标记，ac1～ac16，其具体信息如表1所示。这16个scar标记均匀地分布在35kb异源萝卜线粒体片段上。用于扩增ac1～ac16的引物对为aclp～ac16p，其序列信息如表2所示。这16个引物对在具备异源萝卜线粒体片段的植株中能够扩增出目的条带，而在不具备异源萝卜线粒体片段的植株中无扩增产物。
[0060]
表1用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记
[0061][0062][0063]
表2用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的引物对
[0064]
引物对正向引物的序列(5
’‑3’
)反向引物的序列(5
’‑3’
)ac1pgcaggaatgctgcacactctgggacgttcagattgcataccatac2pcatgaattagaataaagtaagggagcgcttttagcagtcttccgaaatac3pgcagattgaagcatgattgggcagaactcctaagattccttcac4ptcagacagtcttttatgccctctaagatcatacttggtcgggaa
ac5ptagtctatgtgccagttcaaatcttagaacccataggcaccggactac6ptgtgacaaaagtgattgggatgcttactagcccacggaactcatac7pagtcctgaccttcgttactagagcccttgactttcgtgtgtgcgtaac8pgcatctcccactcgcttactgcatccactaaacttctcaacggac9pttgagtttcagtggcataggacggattagaatcagttcggcgtac1opgcgtctgaataccactgtcctccagaacatccacctacttacggac11ptgaaaaaatccaccccctaacaagataaaacagagacggaaccac12pgagtccatacagggctacacgacccgagagttattttggctgac13ptaccgaggctgattggtttccttcaagacccaaccagtaccac14pccattcgcccagtctataaacataccaggaggcgaactatctaac15pgctagtttagagttcctatcctagcttggttgattcattttcttcctgac16pctctttctctgtctgacgctcgcgtatttagaagcctgctaccg
[0065]
结果显示，引物对ac1p～ac16p在不含异源萝卜线粒体片段的甘蓝品种“02-12”中无扩增产物，而在含有异源萝卜线粒体片段的甘蓝ogura cms品种“cmsr302-12”(图1)和萝卜品种“rfrs”(图2)中均扩增出相应大小的目的片段。此外，我们利用引物对ac1p～ac16p按照同样的方法检测本课题组保存的96份甘蓝自交系材料，均无扩增产物。因此，引物对ac1p～ac16p在甘蓝基因组中不存在非特异性扩增。本发明开发的scar标记对于甘蓝ogura细胞质雄性不育系中的异源萝卜线粒体片段具有很强的特异性。
[0066]
实施例2.利用scar标记辅助鉴定甘蓝ogura细胞质雄性不育系中的异源萝卜线粒体片段
[0067]
采用ctab法提取待测甘蓝材料的幼苗的基因组dna。使用引物对aclp～ac16p，分别以甘蓝自交系品种“02-12”(阴性对照)、萝卜品种“rfrs”(阳性对照)和8株甘蓝ogura细胞质雄性不育系(“j34”、“j35”、“2177”、“2183”、“2185”、“2186”、“2147”和“2202”)的基因组dna为模板，按照下列体系和程序进行pcr。
[0068]
pcr体系(20μl)：10μmol/l正反向引物各1μl，2
×
rapid taq master mix 10μl，基因组dna 1μl，ddh2o 7μl。
[0069]
pcr程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。
[0070]
反应结束后，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，150v恒压15min，利用紫外凝胶成像仪拍照。
[0071]
如图3～图9所示，引物对ac1p～ac16p在“j34”、“j35”、“2177”、“2183”、“2185”、“2186”和“2147”这7株甘蓝ogura细胞质雄性不育系中扩增出全部16个scar标记，表明它们都含有35kb的异源萝卜线粒体片段。如图10所示，引物对ac1p～ac16p在甘蓝ogura细胞质雄性不育系“2202”中只扩增出7个scar标记，表明该材料含有的异源萝卜线粒体片段远小于35kb。引物对ac1p～ac16p在甘蓝自交系品种“02-12”中无扩增产物，在萝卜品种“rfrs”中扩增出全部16个scar标记。将8株甘蓝ogura细胞质雄性不育系的pcr产物分别测序，然后将测序结果同scar标记ac1～ac16的核苷酸序列进行比对，发现pcr产物与scar标记的序列一致性为100％。
[0072]
实施例3.用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的试剂盒
的制备
[0073]
1.试剂盒组装
[0074]
将引物对ac1p～ac16p(表2)中的每一种引物(液态或粉末状)独立包装并贴好标签，然后与pcr通用试剂和/或电泳通用试剂以及试剂盒使用说明书一起装入试剂盒中，并在试剂盒的外壳上贴上标签。
[0075]
2.试剂盒使用说明书
[0076]
按照下列步骤检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中的异源萝卜线粒体片段：
[0077]
(1)提取待测甘蓝ogura细胞质雄性不育系样品的基因组dna；
[0078]
(2)以所述基因组dna为模板，采用引物对ac1p～ac16p分别进行pcr；
[0079]
pcr体系为：10μmol/l正反向引物各1μl，2
×
rapid taq master mix 10μl，基因组dna 1μl，ddh2o 7μl；
[0080]
pcr程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。
[0081]
(3)使用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，若出现引物对扩增的相应大小的特征条带(参见表1)，则所述样品的基因组dna中包含相应的异源萝卜线粒体片段；若没有出现引物对扩增的相应大小的特征条带，则所述样品的基因组dna中不含相应的异源萝卜线粒体片段。
[0082]
scar标记ac1～ac16的核苷酸序列
[0083]
seq id no：1
[0084]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac1(737bp)
[0085]
gcaggaatgctgcacactctgccgcaaaaggggaccactttcttcccccgaaaaatgccaatgccaacatcagggcccagcaagcggcataatgatgttccgattccagcaacagtagtatatggttcaaaacgccttgttccatccggcgcgaatcccctccatcactagtaaagtggaggtgttatttgtattgcaataatgaatcaatgtacgaacacaaataatgagcagacctgcccacttttctatgtggattcatttcataatatattattttttgaataaagaagcgcgcccctgttagtgtaacgtaggtgtctttctcggttgatggatgggataaatgcctatatcgctttgtaatgttattgtcatgttgatgctattgctattataaagaatataatcttctttgctttagtcccattctttataattgtctttctcgtactgtgtaaacgaacttcaagtcttaattgtgtactcccaggaagcgtcacagcctaggtttgggccacctccgatgtcgatctgcagtaagagtttgttttcgaaagtcgttttccgaggtaggttctattttcacctagagcgatttgcctgcgtctttctaggctatagtttacctgtatcatgcaaatgtccaacacttagtttctaagatcatcctatatgaaagatgtatgacatgtgtggataatgaatgacttgcatggtatgcaatctgaacgtcc
[0086]
seq id no：2
[0087]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac2(564bp)
[0088]
catgaattagaataaagtaagggagcacaccgatcgaaacctgtttactttcgaaagttgacccgccacctactacttgtagtcaaccaaaattgcttcgctaggagtgtgctattaaaagctgttgatcggcctatggcactttactaaacctaggagaggagaactgctactatctattgcatgggtgcctgcgtgtaagaggtgtaagagaaagaaagaaatttccgtcaacaggatgaatcccagcgaaaagaaggcggaaagcctatgaaaggtggaaagccctagcggagcaatcttaaagatggaaagctcttaaaggtggaaagccagcacaagcacactactgtgaaagctaagagtacttctatattaggaattttgctagtggcggatacgtactatcttctttatattgacattctgctacccgggaatccagttcgtaaaactcggagatatcaaacggaagtaaaaaaaagcagagaaggattaagactaaccactttttcgacatcccttcatgaa
gcgcagcaacatttcggaagactgctaaaagcg
[0089]
seq id no：3
[0090]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac3(790bp)
[0091]
gcagattgaagcatgattgggctctccgcttctcttcagatggaacttcgccatgtccatgtccctcgagtactgttcctagagtatagtagagtacggatcgattgaactggtttctgtcgtacccctaacggtacagttatgacctaatgcggggtctctctcaggcagaagatcaaccgatgtacgatgttggacctaatgagaggtccttctctgtcagggtttataggtcaactggttgcttcgctagagtaggacctaacccatgtactgtgagtgttgattagtcaccctgatatcgagtgagcattcgggggtgtagacttcacactttaacaggtcatctgtctttcgaagttttctgtaacacagagatgtagttgcaaggcaaaggtcaactagcttgcttcgctaggttgcttcgctagggacttaaggagaagtgattttctgtagcacagagatgactttagtaagttgcaaggcgaaggcctcaacgattgtggttaatctatcttggtatctttgtgatgaggtatggcttatctgtgctggggtgtgcttgggagtcaaatgctagggtcatgcgaaaagtcctatttccaattccgatctcatatctaaggaacgggagttcttaacagaagaaaggccatagactccgtttggtacgtatctgatatgtgacaaatcctaaatctgcaaggtatcttatctctctcagttattaatatggtgctggactagcgaagcaacccttttgaagaaggaatcttaggagttctgc
[0092]
seq id no：4
[0093]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac4(898bp)
[0094]
tcagacagtcttttatgccctcttttaggtttgttttttccttcccccaattctaggatgcgtagtagctctagtaagtccgtagctggatctggcaggatgcggagtttgagctgcggggtgagggatgggatagacatagccatctctcccttctccggctcttctcttatggtctctaatgatggcttatccactactacttgcttccttccctttatccttcctcacaacaacttgctcctcttccttatcatctctcacaactgcctcaatcagtttccctttcttcccaggtgcgcttgattgggaagaaagatctggggtggggaatctatcaacttgcagcagccccagtcttccttctcctttgagcaccggcttttaatgggtatgaaagaactagatgggaggccttttccgggtaagagaaatagtagtgagaggtagtgaaagccctttcgtcctttataactagtacattttatcgtgtagataacagaggcaagcaggacagacgatcaatccctcttctagtaatggcaccactcttcttaggttagaacccattcccattggcttcctacaggtatagtgagatgtacaggaagacggagaccttttgaattatagacgactagtagtgcgaagcaattccatccgattttcgagaaagaaaagagtgagttagcttatttttacgtcggatgaaagagataattctaactagccggagacagagatatagaaagtttgcagtgcggtatcgcccatgaccttctgcgagagtgagatagaaagctggaaggttggattgaatcggattatccattgagctagtccgttttcctagtaatgtaaaaaaataacaaaagattcccgaccaagtatgatctta
[0095]
seq id no：5
[0096]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac5(587bp)
[0097]
tagtctatgtgccagttcaaatctgtggcgagtcgctcacccgcctacgattgattggagacttattcaataggtcctccttcccgaattctagggcgtctagcttagatcgcatttgatttcccttactcttgaatagtgaaagattgagcctccttcggaccctcttctaagaaatgataggtaaagcgctctaaccgggggctcaattttccttcaaactgactttgtcttttcctttgcttctttatccatccaagcattgagtgatcaaagaatctctccttgaagctcaatgtaccctccttcctcatagaaatggtccctatactatagtaggaatagtctctattctattctgcttggagctgccctacataggataaaggagggggagcgacttcttttctttcttttttgagctctcacctttagccgatcttattcaatggattgtgactttctcagctttagttttctatcgaatttccatttgggctcattggactcttctatctaagcttgagcccgaagcgagtgaaactcgtccttcatttcatacctcagtccggtgcctatgggttcta
[0098]
seq id no：6
[0099]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac6(729bp)
[0100]
tgtgacaaaagtgattgggatgcccatctttggtccagaaggggttctccatgaaaagagtttccacctttctctactcgagaagccctatctaaaagggcttgtctggatgaatgcagtgtcggaagccgtgatcacatagtaacttccgcccacagtgctattacgacggcaggtcaccgggagtgaagtaaactcggctcctgatgtagcattcattcggaccattcgacgtttgattctttttatcagggataccgatgactctgtgagaggtgttcctcggccaagtttcccatgacgggttacccggttcaaggcttttctatataatgagaaatactactttctttctagcttaagtgttcacgtaggtaaaatagcttctatagctccatccaatagtaatcaacggagataatagagtccagcggttcaaccaacgcttctaaggagagcggggcaagcaagaaagcaggcaaagtcattgagcctattctattccgaaagttcaactgctggataaacaacgaaagccgtcggcattcttctcctactgtagctgctacaattgctttagcgcgagcagcaaggaggaggcagctcttactaaaaaagcaaaaagggaagggcatgacagaagggagatagacctcctattaagcattactctcttttgaggtaacttacttgcttactctgatatgatgagttccgtgggctagtaag
[0101]
seq id no：7
[0102]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac7(988bp)
[0103]
agtcctgaccttcgttactagagcacagaaaaagcaacagtgtgctgtacagagaacttgcttcgataggaaaagaaaagctgtatttctaagctgggaatgttgggtaagagtccgcctattacctctaaaaagtggaggaggtgagatccctgttggagtcaacttttgaatttaccggctttggagaaaccttttcagttgcttagtgcgaatcccacgtttcgagggtgggtaaggtctcagtacctcggatatagcacagaaaggcctatagcatccaataccacttttcaggttacttccttgtgagcttgtcagacaaagtaggcgacggtgtgctgcactacatctcctcagcagttgatcggtcaggttccttgccttgcttaacccagctcgagtattattcgaaacgaggaatatccttactctagaagctcagagttaagagttaagggaaggtgttagctaaggaattaggtcttcctcttcgaaaggagaactctagtctaccgtggtgggtagtagctactcccagtacatctatcatccgtgacatccatggcaactactacttttcattgctgtgctgtttaatcgatcgaacaaaactcctaaggtagagatcttaagaagaggacgagctcaactcccgattgttcaagcttagatacctctttgatttgggattgacgaaacagtataaacctttctaataggcctattttgtgcgtttaatcacctttctttcatctctgagccagctatcctttcagaatagggctttccgctttcttttaaggtgaggaatcttaggagttcagctttttcgattaaacgaagaattctgtcatttcagatgggattccaaagcaaggctagttatctatgttagcttcattcctgtgaagttggtttctagttttgatctttgagttggcagtaacatgactagcagcatagtacgcacacacgaaagtcaagg
[0104]
seq id no：8
[0105]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac8(789bp)
[0106]
gcatctcccactcgcttactggcagaaggtctgcaagcctagccccttctctttatcgagggcaactcatgcttatagggcactcccgggatggaaccagcgataattacttccactcaaagggatcggattatgaaccactcctagctgctttctttcaaacctttccatctgaagttgattctataggtgcagttgcagttctagctctttctttagttgctggagatgtaatacgactagcatcaagccttccttcttcagtaatagttccagtggaggaagaagaagagcagatcgctttagactgcctcccttactaaacaagataggctcgcttcatctgagccgtcgcccctttcaataggtgtaggcatcgggccgattctcctttgcctatcttcctgctctgccagtatacctccttgcaaacctcccttcccttagctttcaatctgtcttgtgccactccagctttcactcaagccattctttgaacatactttataggggcgaccttcactcttcttctcgcttcctaaccctaaaagctcacttcttttggtgttgctccacgatcttaaagtggaactacgagataaataagcggcgggctgatctgacctgcgcgtctgccttcctttcgtcactacgacttggtttcgaaagaaggaatgagcgctagcctagctaactagcatacctttccttgcctcttgctccgtaaaatgctatcacattttgattccaatcatctcatctttgtcccgttgagaagtttagtggatg
[0107]
seq id no：9
[0108]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac9(774bp)
[0109]
ttgagtttcagtggcataggaccttcgatcaaccatggggcggaggaacctagcttcttcagcgaagctggaagaacccctctgttgaatctatctctccgttcgatgggaattcctaggcatggtgggatcagttggtagcttccagtctgattcctgggattgcatggcgaagcggaggaaccccttacttcgttcattctattgaagcgtaacgtaaaaagctctttctcatgttgcatttctttggttttgattgaattggaagaactcttcttttctcatccaggatgaagacttcgatgtcaaatccaccgttccaacgagacaactctccaccgctagtgaataagtttatcgatctcaggtcaggctgagctgtagcactgatcgttgagtgatcacatagctgacgtcaacagatcttttccttttgtttgggaaccctctttcgactcccctaaaacggttttgtttctacgactactttccttactgaactgctcactggaactacttgaccttcacttactaaagcgggacaacaaagcaggaggtccgaaggactgtgttcaaaggttggattgccttctccttggtactctatctttagtaaggagggatcttccaactcggcaattctccgagtcattggatggaaaagaatagttccttctgtctttcccaactactaagcttgttaaaagcctttattaagtttagtaaggacttcttacgaaccgacttcccggaacgccgaactgattctaatcc
[0110]
seq id no：10
[0111]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac10(779bp)
[0112]
gcgtctgaataccactgtcctcggaaggtagaagtcccaggtacctatccgcttcttcttttctgacctcgatacatccgtcgtgtaaaaccatcaaaaggttaaggaagatctaccgacccgtgtccgtacgagggttcggcccttgaaagtccttctatctttcttacaacaacagaagtgatagcaggcgctttatacccacctagatcaacaaactcttttacagcaagccctcgtccttactcatctgcttgactcgactttcttctagtatgggaaggaaggccgctactcacttccatttctccgtcatagctataaggatgtttcctggccatacccttaccaataccctttcctggtcgagatagcccgggtgaggaacacttgaattacctttcggtgagtggctttttccttcctttacagggattgacctttcttacgaatcagacacttcactttcttaccctgaggaatcaaagacttctctttctacgttagcacacctatcagccttccgctcctccaccatcttcatcggagtctcctcgggggtatagaggtcgtgctgttccttgagctaggcagttggggctgccattccagcaaagtactcatctcagttgggactgccatcctagtgtatagcctgacttctaccctacaccttgaagctacacctgtagcctcccttccattggacacattagcggattcggttaatctaaggaagagataagtgaggggcggaccgtaagtaggtggatgttctg
[0113]
seq id no：11
[0114]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac11(788bp)
[0115]
tgaaaaaatccaccccctaactagactatagaagatcttctcgttttggctaaacggatcttccctgtactgtaacagggtcaacaccgccttttgaggttggtgtccgagctttccgcccagctttcttcgatcgtatgccacgaactatgtcttagatacgtaagggcccctgtccaagtttggctttcttagtacattgcctttgtactggaagctggatcatacgaaccagcaatggcctgaagctttcttgcagcaagatgatcagtccgagagtgctgggtattcatctctagcttttacaatggttatttcatttgccggatattcaccaaaagaaagtgctcgctagccataagcggaatgactttcttgatatggaccgatcgaagcccttaaggatagcttactatggtaaatagctagaccccgaacctattcccagtttccgagtaactatcattggtcagtttcctgtttcctatggtctatcattggtccggtccttcagaggcaggagaagtacaagatgcaagctcataaacgagacagtaggatggcgctaatgccagtcgatcattcgacttcggctaatggaaagtggaacttagaaatagcttcttaagaaacagatatatagtagtgcttccccctccttagaatggtaatggttcgttcttcgccaggatcatctccaggtagtgctgctccgtcttcgccttgaccttgtgctggccgcttttgtacagcatgaaggggggaaggttccgtctctgttttatctt
[0116]
seq id no：12
[0117]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac12(669bp)
[0118]
gagtccatacagggctacacgtggcgaagcgtatttgggcggcgttttctcgattgctttccaactggaatgaaaatcttcttatatacgtattattccaaggaggatcaacatcccattccattacaaatggttaaacagctatcccttaccatacatctcttcccgctacgcgcctcacagccggtattggcccttgctgtgctccccctggaactgtagttcactcccgtagggagctgcagctatcctcccaacaatcaactacccaatcttgttgctaatgtgcatgaagttgaagcaggtgttgcgaagctgccctgctgctttgattgcgtagctacctcccgcagggaaatgcagctaactccttaaaaagagtaaacagtttgttagtaggtatgagttgcaaggaagtgttgcgtagctgcccggctccttaataagcacgggaaccctcccgcagggagctgtagctagctccttattaacaactcccttgcttgttttgcctaagcatgagtagttcagttcgaaaatggatcctcaataaaaaaaatggaatatctgtgcggatatgttcagctttgggtggaaaggtaaggaatttgactccgactaagattattgtccatggtgtaacagacacagccaaaataactctcgggt
[0119]
seq id no：13
[0120]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac13(897bp)
[0121]
taccgaggctgattggtttcctttgccatcgcatctgcccctcgtcgtagcctctgtttaagctcttcccaactgtttggtggatctctatccctcagttccgaaatccaaatccctgttggtccctcgagacagaggtacacaaccggctctctctgattctcttggatgtgatactcccagaaatatgattccagatggttgatccatttttccaggactgtccctgagcagcccgaaatcttatacccagtattcactctcctgtctcgttctctaccagctgagagggatccttattactccatgtaatcctgttctgtgaagctaactgtctccattctgctatcacccctgtgtttcgaatccgtttgtctccaccagacctgttcaggaggtcagtttcttcccaagctctatcagatctggtccagtccatggctcctctttcgagccagctctctccgcctgaatcgagacatcaaacccatgacggagtgtcggatctcgggatggagttctagaatccaccgacgcagtaggggatctagattaccatgtttcacaaatggtcgtgccacttcagcaccgagtgatctgagagaagaggagtccgagccctttcctagaatgcaaactttctctttatatatcaggaaaagttagcaatcctattttccttcgtaagaggacagtaggaatccaaacctttcctttctagaacggaaggcaccagtcttaacggtaaacgtcggcagaagtgaaagtgatcccgggcaagggggagcagctttccagatctaaatacgaagagaatgcagctatgctactacgattccatagagttgcacggaaatgggaccataagaaaggttcggtactggttgggtcttgaag
[0122]
seq id no：14
[0123]
用于检测甘蓝细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记ac14(902bp)
[0124]
ccattcgcccagtctataaactcagtggatagagtagatcagtgagatccgaccatcttccacgccctcatccactaggccaactccagtctcagattaactcggaactactttccttattctggtcaaactctctattgggaaaaaacaacctttgtgacaagtggtcaaaagaagagaatatagagaccttgatgagctgacgcaggctcttacgtccattcctgataaggaataggataaggactttaggaaccaacatagcttcatctcaatgaagaacattcccagaacgagatgagaaagagatcgtaccaatgtctgaaatagagagtggggtgtggttaccggcttcgcgagcccatataggactactcttggctaagcaactttgggcggtggtttatcgattgctttctaactggaatgagaatcttcttatatatctatttttatgtgaggatatctaatgtactcctactcggtaactgttattctttctctaacgaataagagttccacattcttacttaaagtctatttagagttcgcggaaaagaggcactcggggatattcactgcctgtcatcttgtgtggtatagccaaattccttctgtcttcgaatttttaagagagccgtttccttgatataacccgaattagcttgctttttgccgaccttcaatgccttcgattagaactttcggggaatcgaaagtgtggcgtaggtcaaatgttgcttaacatcctacgaaccttccttccatccttccttggcttcctatggtgatagttataggtcttcctcttcctatggttcattggcttacttccttggttattagtacatgcgcacacacgtacacacacgttctttaatagatagttcgcctcctggtat
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19.murray mg，thompson wf.rapid isolation of high molecular weight plant dna.nucleic acids res.1980oct 10；8(19)：4321-4325.

技术特征：
1.用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的scar标记，其特征在于，包括标记ac1～ac16中的一个或更多个或全部；所述ac1～ac16的核苷酸序列如seq id no：1～16所示。2.用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的引物组，其特征在于，包括引物对ac1p～ac16p中的一对或更多对或全部；所述ac1p～ac16p分别用于扩增核苷酸序列如seq id no：1～16所示的异源萝卜线粒体片段；所述ac1p～ac16p的序列信息如下：引物对正向引物的序列(5
’‑3’
)反向引物的序列(5
’‑3’
)ac1pgcaggaatgctgcacactctgggacgttcagattgcataccatac2pcatgaattagaataaagtaagggagcgcttttagcagtcttccgaaatac3pgcagattgaagcatgattgggcagaactcctaagattccttcac4ptcagacagtcttttatgccctctaagatcatacttggtcgggaaac5ptagtctatgtgccagttcaaatcttagaacccataggcaccggactac6ptgtgacaaaagtgattgggatgcttactagcccacggaactcatac7pagtcctgaccttcgttactagagcccttgactttcgtgtgtgcgtaac8pgcatctcccactcgcttactgcatccactaaacttctcaacggac9pttgagtttcagtggcataggacggattagaatcagttcggcgtac10pgcgtctgaataccactgtcctccagaacatccacctacttacggac11ptgaaaaaatccaccccctaacaagataaaacagagacggaaccac12pgagtccatacagggctacacgacccgagagttattttggctgac13ptaccgaggctgattggtttccttcaagacccaaccagtaccac14pccattcgcccagtctataaacataccaggaggcgaactatctaac15pgctagtttagagttcctatcctagcttggttgattcattttcttcctgac16pctctttctctgtctgacgctcgcgtatttagaagcctgctaccg3.用于检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的引物组。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组中的每一种引物均独立包装，为液态或粉末状。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含用于进行pcr和/或凝胶电泳的通用试剂。6.权利要求1所述的scar标记或权利要求2所述的引物组或权利要求3-5任一所述的试剂盒在检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段中的应用。7.检测甘蓝ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的方法，其特征在于，包括：a)提取待测甘蓝ogura细胞质雄性不育系样品的基因组dna；b)以所述基因组dna为模板，利用权利要求2中所述的引物对进行pcr；c)检测pcr产物以确定所述样品的基因组dna中是否包含相应的异源萝卜线粒体片段或者所包含的异源萝卜线粒体片段的序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过凝胶电泳或测序的方法来检测pcr产物。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，pcr体系包含：10μmol/l正反向引物各1μl，2
×
pcr mix 10μl，ddh2o 7μl，基因组dna 1μl；pcr程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，58℃退火15～60s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸5min。10.根据权利要求7～9任一所述的方法，其特征在于，在待测甘蓝ogura细胞质雄性不育系的苗期进行异源萝卜线粒体片段的检测。

技术总结
本发明属于分子育种技术领域，具体涉及用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记。本发明提供用于检测甘蓝Ogura细胞质雄性不育系中异源萝卜线粒体片段的SCAR标记，其包括标记AC1～AC16中的一个或更多个或全部；所述AC1～AC16的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～16所示。本发明的SCAR标记特异性强、稳定性好，可准确鉴定待测甘蓝细胞质雄性不育系中是否含有相应的异源萝卜线粒体片段及其相对含量，有利于甘蓝细胞质雄性不育系的早期选育，提高育种效率，降低育种成本。降低育种成本。


技术研发人员：张扬勇 陈立 方智远 杨丽梅 庄木 吕红豪 王勇 季家磊
受保护的技术使用者：中国农业科学院蔬菜花卉研究所
技术研发日：2023.03.22
技术公布日：2023/7/7