高通量定量检测过敏原特异性IgE抗体试剂的制备方法与流程

高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法
技术领域
1.本发明涉及医疗器械技术领域，尤其涉及一种高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法。


背景技术：

2.ige介导的过敏性疾病是21世纪最严重的慢性病之一。过敏原测试是指对过敏性疾病患者进行过敏原检测，找到引发过敏的真正原因，从而进行有针对性的预防和治疗，很多过敏性疾病的发生都与接触过敏原有关，体外特异性ige检测是过敏性疾病最常见的检测方法。
3.目前已经发现1000余种过敏原，常见的过敏原检测包括:螨类、蟑螂、动物皮屑、真菌、花粉等。
4.目前过敏原特异性ige抗体试剂盒的主要检测方法为酶联免疫法（elisa）、免疫印迹法（ibt）、荧光酶联免疫分析法（feia）、化学发光免疫分析法（clia）、微阵列芯片法等，这些方法操作复杂，检测时间长，且价格昂贵，检测过敏原的时间及成本高；现有的检测方法操作复杂，检测时间长，且临床样本用量随检测项目增多而增多，不支持使用末梢血，因采血困难，儿科使用难度大；目前的检测试剂的灵敏度一般在0.35iu/ml左右，灵敏度低。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了解决上述背景技术提出的问题，而提出的一种高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，主要包括以下步骤：步骤一、选取五种量子点；步骤二、制备结合垫；a、使用同型双功能交联剂制备五种过敏原抗原多聚体；b、将五种量子点分别偶联五种过敏原抗原；步骤三、制备包被板；c、生物素标记鼠抗人ige抗体；
①
将生物素使用50mm pbs溶解至终浓度为20mm；取1mg鼠抗人ige抗体使用50mm pbs稀释至0.5mg/ml，作为生物素标记的缓冲体系；
②
在上述反应体系中加入10ul的20mm 生物素，室温孵育1小时；将反应液转移至50kd超滤管中，在4℃、10000rpm条件下离心15min，使用50mm pbs反复超滤5次，去除反应液中游离的生物素；
③
收集生物素标记鼠抗人ige抗体，并测算浓度；
d、包被板制备；
④
c线包被液：将羊抗鸡igy抗体使用包被缓冲液1（20mm pb+1%海藻糖）稀释至1.0mg/ml；t线包被液1：将sa8使用包被缓冲液2稀释至1-3.0mg/ml；t线包被液2：将生物素标记鼠抗人ige抗体使用包被缓冲液1稀释至1-3.0mg/ml；
⑤
先将pvc板nc膜位置的胶纸撕去，nc膜下沿要紧贴结合垫位置的分隔线，使nc膜均匀贴在pvc板上；
⑥
使用划膜喷金仪将上述t线包被液1均匀划膜在nc膜上的t线位置，37℃烘干6-8h；使用划膜喷金仪将上述t线包被液2均匀划膜在nc膜上的t线位置，c线包被液均匀划膜在nc膜上的c线位置，37℃烘干24h备用；步骤四、制备成过敏原特异性ige抗体检测试剂盒并在仪器上进行检测：将制备的结合垫、包被板、样品垫、吸水纸、组装成检测试纸条，将组装好的检测试纸条在多通道免疫层析分析仪上进行检测。
7.优选地，所述步骤a使用同型双功能交联剂制备过敏原抗原多聚体主要包括以下步骤：a、选取五种过敏原抗原（如尘螨、猫皮屑、狗皮屑、蛋白、牛奶），并分别将五种过敏原抗原使用ph为9.0的50mm bb缓冲液稀释至0.5-1mg/ml；b、每1mg的过敏原抗原中加入0.2mg-0.4mg的交联剂，37℃孵育30min；c、加入1ml的20mm tris封闭裸露位点并终止交联反应30min；d、使用20kd的透析袋将交联物透析至ph为7.0的10mm pb缓冲液（磷酸缓冲液）中，去除反应中游离交联剂；优选地，步骤a中的交联剂为bs3、dss、bs(peg)9、bs(peg)5中的一种。
8.优选地，所述步骤b将五种量子点分别偶联五种过敏原抗原主要包括以下步骤：e、将edc溶于纯化水中，稀释至终浓度为10mg/ml；用ph为7.4的0.2m硼酸盐缓冲液将待标记过敏原抗原稀释至5mg/ml；f、向反应容器中加入体积为1ml的ph为7.4的0.2m 硼酸盐缓冲液，再将体积为15ul、150ul的量子点、edc溶液分别加入上述缓冲液中，在室温下避光搅拌30min；g、向反应容器中加入体积为400ug的待标记过敏原抗原多聚体，在室温下避光搅拌，转速280r/min下反应2h；h、量子点标记过敏原转移至50kd透析袋中进行透析，透析液为ph8.4的0.2m硼酸盐缓冲液，室温下透析4h或2-8℃下透析8h；更换透析液再次重复上述透析过程；i、收集透析袋中的溶液，转移到离心管中，再加入量子点标记抗体复溶液至终体积为1ml，并混匀；j、将复溶后的量子点标记抗体用超声波清洗机超声5min；然后使用0.22μm水膜进行过滤；k、将鸡ig y使用相同的标记工艺标记cdse/zns-450-peg-cooh；l、将上述标记的各个量子点进行1:1混合后在2-8℃下保存备用；m、使用划膜喷金仪将上述标记的量子点均匀喷涂在裁剪好的聚酯膜6614上，37℃
烘干备用，作为结合垫使用。
9.优选地，所述步骤i中的抗体复溶液包括100mm tris、2%pvpk-30、10%蔗糖、1%酪蛋白、1%peg-200、1%tritonx-100、0.1%proclin-300 ph8.0。
10.优选地，所述步骤四的检测方式为：用移液器吸取20μl样本加到1000μl样本稀释液中混匀，取100μl稀释后的样本至检测卡加样孔，15分钟后读取检测卡的测试结果。
11.优选地，在检测模块激发光的照射下检测不同发射光信号，并进一步计算不同过敏原特异性ige抗体的含量。
12.优选地，所述样品垫为滤血膜。
13.优选地，所述步骤一中的五种量子点分别为：cdse/zns-450-peg-cooh，发射波长为450
±
10nm；cdse/zns-500-peg-cooh，发射波长为500
±
10nm；cdse/zns-545-peg-cooh，发射波长为545
±
10nm；inp/zns-600-peg-cooh，发射波长为600
±
15nm；cdse/zns-645-peg-cooh，发射波长为645
±
10nm。
14.优选地，所述步骤c中的nc膜为硝酸纤维素膜，划膜参数为：t线参数4ul/cm；c线参数1ul/cm。
15.与现有技术相比，本发明提供了一种高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，具备以下有益效果：1、该高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，将鼠抗人ige抗体和羊抗鸡ig y抗体分别包被在nc膜上，其中鼠抗人ige抗体用于捕获样本的ige,是该系统的检测线；羊抗鸡ig y用于结合结合垫中偶联量子点的鸡ig y，是该系统的质控线。
16.2、该高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，在包被膜的制备过程使用了放大系统，将链霉亲和素sa8预包被在nc膜上，后包被生物素标记的鼠抗人ige抗体，鼠抗人ige被充分的包被在nc膜上，降低了反应的空间位阻，提高了检测的灵敏度。
17.3、该高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，选择了5种量子点，其特点是具有统一的激发光，不同波段的发射光，因此可同时在特定检测系统下进行检测；将五种量子点分别偶联不同的过敏原抗原且按照一定比例混合作为识踪物，在同一检测系统下可定量提供不同过敏原ige的含量。
附图说明
18.图1为本发明提出的一种高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法的结构示意图。
具体实施方式
19.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
20.实施例1：参照图1，一种高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，主要包括
以下步骤：步骤一、选取五种量子点，五种量子点分别为：cdse/zns-450-peg-cooh，发射波长为450
±
10nm；cdse/zns-500-peg-cooh，发射波长为500
±
10nm；cdse/zns-545-peg-cooh，发射波长为545
±
10nm；inp/zns-600-peg-cooh，发射波长为600
±
15nm；cdse/zns-645-peg-cooh，发射波长为645
±
10nm；步骤二、制备结合垫；a、使用同型双功能交联剂制备五种过敏原抗原多聚体，具体的交联剂为bs3（双琥珀酰亚胺辛二酸酯钠盐）、dss（辛二酸二琥珀酰亚胺酯）、bs(peg)9（聚乙二醇化双（磺基琥珀酰亚胺）辛二酸酯）、bs(peg)5（聚乙二醇化二(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸）中的一种；选取五种过敏原抗原，分别为尘螨、猫皮屑、狗皮屑、蛋白、牛，并分别将五种过敏原抗原使用ph为9.0的50mmbb缓冲液（硼酸缓冲液）稀释至0.5-1mg/ml；每1mg的过敏原抗原中加入0.2mg-0.4mg的bs(peg)5，37℃孵育30min；加入1ml的20mm tris（三羟甲基氨基甲烷）封闭裸露位点并终止交联反应30min；使用20kd的透析袋将交联物透析至ph为7.0的10mm pb缓冲液（磷酸缓冲液）中，去除反应中游离交联剂；b、将五种量子点分别偶联五种过敏原抗原；将edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)溶于纯化水中，稀释至终浓度为10mg/ml；用ph为7.4的0.2m硼酸盐缓冲液将待标记过敏原抗原稀释至5mg/ml；向反应容器中加入体积为1ml的ph为7.4的0.2m 硼酸盐缓冲液，再将体积为15ul、150ul的量子点、edc溶液分别加入上述缓冲液中，在室温下避光搅拌30min。
21.向反应容器中加入体积为400ug的待标记过敏原抗原多聚体，在室温下避光搅拌，转速280r/min下反应2h。
22.量子点标记过敏原转移至50kd透析袋中进行透析，透析液为ph8.4的0.2m硼酸盐缓冲液，室温下透析4h或2-8℃下透析8h；更换透析液再次重复上述透析过程。
23.收集透析袋中的溶液，转移到离心管中，再加入量子点标记抗体复溶液至终体积为1ml，并混匀，具体的，抗体复溶液内主要包含100mm tris、2%pvpk-30（聚乙烯吡咯烷酮）、10%蔗糖、1%酪蛋白、1%peg-200、1%tritonx-100（聚乙二醇辛基苯基醚）、0.1%proclin-300 ph8.0。
24.将复溶后的量子点标记抗体用超声波清洗机超声5min；然后使用0.22μm水膜进行过滤。
25.将鸡ig y使用相同的标记工艺标记cdse/zns-450-peg-cooh。
26.将上述标记的各个量子点进行1:1混合后在2-8℃下保存备用。
27.使用划膜喷金仪将上述标记的量子点均匀喷涂在裁剪好的聚酯膜上，37℃烘干备用，作为结合垫使用，具体的，聚酯膜的尺寸为0.8*30cm；步骤三、制备包被板；c、生物素标记鼠抗人ige抗体；将生物素（sulf-lc-lc-biotin）使用50mm pbs溶解至终浓度为20mm；
取1mg鼠抗人ige抗体使用50mm pbs稀释至0.5mg/ml，作为生物素标记的缓冲体系；在上述反应体系中加入10ul的20mm 生物素，室温孵育1小时；将反应液转移至50kd超滤管中，在4℃、10000rpm条件下离心15min，使用50mm pbs反复超滤5次，去除反应液中游离的生物素；收集生物素标记鼠抗人ige抗体，并测算浓度；d、包被板制备；c线包被液：将羊抗鸡igy抗体使用包被缓冲液1（20mm pb+1%海藻糖）稀释至1.0mg/ml；t线包被液1：将sa（链霉亲和素）使用包被缓冲液2稀释至1-3.0mg/ml，其中，包被缓冲液2为ph8.0的0.2m碳酸钾溶液；t线包被液2：将生物素标记鼠抗人ige抗体使用包被缓冲液1稀释至1-3.0mg/ml，其中，包被缓冲液2为20mm；先将pvc板nc膜位置的胶纸撕去，nc膜下沿要紧贴结合垫位置的分隔线，使nc膜均匀贴在pvc板上，具体的，所述步骤c中的nc膜为硝酸纤维素膜，划膜参数为：t线参数4ul/cm，c线参数1ul/cm；使用划膜喷金仪将上述t线包被液1均匀划膜在nc膜上的t线位置，37℃烘干6-8h。
28.使用划膜喷金仪将上述t线包被液2均匀划膜在nc膜上的t线位置，c线包被液均匀划膜在nc膜上的c线位置，37℃烘干24h备用；步骤四、制备成过敏原特异性ige抗体检测试剂盒并在仪器上进行检测：将制备的结合垫、包被板、样品垫、吸水纸、组装成检测试纸条，将组装好的检测试纸条在多通道免疫层析分析仪上进行检测，具体的样品垫为滤血膜，尺寸为1.8*30cm，吸水纸尺寸为2*30cm。
29.检测方式为：用移液器吸取20μl样本加到1000μl样本稀释液（pbst）中混匀，取100μl稀释后的样本至检测卡加样孔，15分钟后读取检测卡的测试结果；在检测模块激发光的照射下检测不同发射光信号，并进一步计算不同过敏原特异性ige抗体的含量。
30.基于本工艺检测5项过敏原检测仅需要20ul血清样本，平均一个过敏原检测4ul的血清样本。
31.实施例2：s1、校准品的配制：取人ige，通过校准品稀释液配制成浓度分别为 0.35、3.5、17.5、50、100 iu/ml的校准品，具体的校准品稀释液包括磷酸二氢钾2mm、磷酸氢二钠8mm、氯化钠136mm、氯化钾2.6mm。
32.s2、用移液器吸取20μl样本加到1000μl样本稀释液（pbst）中混匀，取100μl稀释后的样本至检测卡加样孔，15分钟后读取检测卡的测试信号值。
33.s3、通过四参数模式拟合标准曲线，多通道量子点免疫层析分析仪的操作软件将信号带入四参数公式计算出待测样本中的ige的浓度值。
34.s4、取两份临床样本分别使用传统检测体系和本技术检测体系进行检测；传统检测体系1（5t1c）的方式为：使用一种量子点标记鼠抗人ige抗体用于制备结合垫，一个nc膜上包被5条t线和1条c线，其中，5t1c是指在nc膜上分别包被有5个独立的t线和1个独立的c
线；具体结果如下：
35.表1：传统检测体系1与本技术检测体系结果对比表。
36.参照表1结果显示：当对多个过敏原时，样本1表现为猫皮屑和蛋白过敏；样本2表
现为狗皮屑和牛奶过敏。分别使用传统检测体系和本技术检测体系进行检测，本技术检测体系检测结果和标示值偏差在
±
15%范围内；传统检测体系的第一捕获过敏原检测结果和标示值偏差在
±
15%范围内，但是第二捕获过敏原检测结果和标示值偏差大于
±
15%范围内。
37.进一步的分析，传统检测体系，结合垫中的量子点标记鼠抗人ige抗体会非特异的捕获样本中的ige；进一步的理解一个量子点的标记物上可能同时结合五种过敏原的ige抗体，而当nc膜上的t1-t5有两个以上的阳性反应时，前面的检测线会对后续的检测线的信号有阻断作用，进一步的影响检测的准确的，该发明无法定量，在一定情况下也影响定性检测。
38.s5、灵敏度比较：取两份临床样本分别使用传统检测体系和本技术检测体系进行检测，传统检测体系2（（1t1c*5）并联形式）：使用一种量子点标记鼠抗人ige抗体用于制备结合垫，nc膜上包被1条t线和1条c线。具体结果如下：
39.表2：传统检测体系2与本发明检测体系结果对比表。
40.从上表结果可以看出，采用传统检测体系检测过敏原的最低检出限（lod）为
0.4iu/ml左右，而采用本发明检测系统检测过敏抗原的最低检出限（lod）为0.1iu/ml左右，由此可以看出本发明能显著提高检测的灵敏度；本发明将鼠抗人ige抗体和羊抗鸡ig y抗体分别包被在nc膜上，其中鼠抗人ige抗体用于捕获样本的ige,是该系统的检测线；羊抗鸡ig y用于结合结合垫中偶联量子点的鸡ig y，是该系统的质控线，在包被膜的制备过程使用了放大系统，将链霉亲和素sa8预包被在nc膜上，后包被生物素标记的鼠抗人ige抗体。通过本工艺，鼠抗人ige被充分的包被在nc膜上，并且降低了反应的空间位阻，提高了检测的灵敏度。
41.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：步骤一、选取五种量子点；步骤二、制备结合垫；a、使用同型双功能交联剂制备五种过敏原抗原多聚体；b、将五种量子点分别偶联五种过敏原抗原；步骤三、制备包被板；c、生物素标记鼠抗人ige抗体；
①
将生物素使用50mm pbs溶解至终浓度为20mm；取1mg鼠抗人ige抗体使用50mm pbs稀释至0.5mg/ml，作为生物素标记的缓冲体系；
②
在上述反应体系中加入10ul的20mm 生物素，室温孵育1小时；将反应液转移至50kd超滤管中，在4℃、10000rpm条件下离心15min，使用50mm pbs反复超滤5次，去除反应液中游离的生物素；
③
收集生物素标记鼠抗人ige抗体，并测算浓度；d、包被板制备；
④
c线包被液：将羊抗鸡igy抗体使用包被缓冲液1稀释至1.0mg/ml；t线包被液1：将sa8使用包被缓冲液2稀释至1-3.0mg/ml；t线包被液2：将生物素标记鼠抗人ige抗体使用包被缓冲液1稀释至1-3.0mg/ml；
⑤
先将pvc板nc膜位置的胶纸撕去，nc膜下沿要紧贴结合垫位置的分隔线，使nc膜均匀贴在pvc板上；
⑥
使用划膜喷金仪将上述t线包被液1均匀划膜在nc膜上的t线位置，37℃烘干6-8h；使用划膜喷金仪将上述t线包被液2均匀划膜在nc膜上的t线位置，c线包被液均匀划膜在nc膜上的c线位置，37℃烘干24h备用；步骤四、制备成过敏原特异性ige抗体检测试剂盒并在仪器上进行检测：将制备的结合垫、包被板、样品垫、吸水纸、组装成检测试纸条，将组装好的检测试纸条在多通道免疫层析分析仪上进行检测。2.根据权利要求1所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤a使用同型双功能交联剂制备过敏原抗原多聚体主要包括以下步骤：a、选取五种过敏原抗原，并分别将五种过敏原抗原使用ph为9.0的50mm bb缓冲液稀释至0.5-1mg/ml；b、每1mg的过敏原抗原中加入0.2mg-0.4mg的交联剂，37℃孵育30min；c、加入1ml的20mm tris封闭裸露位点并终止交联反应30min；d、使用20kd的透析袋将交联物透析至ph为7.0的10mm pb缓冲液（磷酸缓冲液）中，去除反应中游离交联剂。3.根据权利要求2所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，步骤a中的交联剂为bs3、dss、bs(peg)9、bs(peg)5中的一种。4.根据权利要求1所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤b将五种量子点分别偶联五种过敏原抗原主要包括以下步骤：e、将edc溶于纯化水中，稀释至终浓度为10mg/ml；用ph为7.4的0.2m硼酸盐缓冲液将待
标记过敏原抗原稀释至5mg/ml；f、向反应容器中加入体积为1ml的ph为7.4的0.2m 硼酸盐缓冲液，再将体积为15ul、150ul的量子点、edc溶液分别加入上述缓冲液中，在室温下避光搅拌30min；g、向反应容器中加入体积为400ug的待标记过敏原抗原多聚体，在室温下避光搅拌，转速280r/min下反应2h；h、量子点标记过敏原转移至50kd透析袋中进行透析，透析液为ph8.4的0.2m硼酸盐缓冲液，室温下透析4h或2-8℃下透析8h；更换透析液再次重复上述透析过程；i、收集透析袋中的溶液，转移到离心管中，再加入量子点标记抗体复溶液至终体积为1ml，并混匀；j、将复溶后的量子点标记抗体用超声波清洗机超声5min；然后使用0.22μm水膜进行过滤；k、将鸡ig y使用相同的标记工艺标记cdse/zns-450-peg-cooh；l、将上述标记的各个量子点进行1:1混合后在2-8℃下保存备用；m、使用划膜喷金仪将上述标记的量子点均匀喷涂在裁剪好的聚酯膜上，37℃烘干备用，作为结合垫使用。5.根据权利要求4所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤i中的抗体复溶液包括100mm tris、2%pvpk-30、10%蔗糖、1%酪蛋白、1%peg-200、1%tritonx-100、0.1%proclin-300 ph8.0。6.根据权利要求1所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤四的检测方式为：用移液器吸取20μl样本加到1000μl样本稀释液中混匀，取100μl稀释后的样本至检测卡加样孔，15分钟后读取检测卡的测试结果。7.根据权利要求6所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，在检测模块激发光的照射下检测不同发射光信号，并进一步计算不同过敏原特异性ige抗体的含量。8.根据权利要求6所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，所述样品垫为滤血膜。9.根据权利要求1所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的五种量子点分别为：cdse/zns-450-peg-cooh，发射波长为450
±
10nm；cdse/zns-500-peg-cooh，发射波长为500
±
10nm；cdse/zns-545-peg-cooh，发射波长为545
±
10nm；inp/zns-600-peg-cooh，发射波长为600
±
15nm；cdse/zns-645-peg-cooh，发射波长为645
±
10nm。10.根据权利要求1所述的高通量定量检测过敏原特异性ige抗体试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤c中的nc膜为硝酸纤维素膜，划膜参数为：t线参数4ul/cm；c线参数1ul/cm。

技术总结
本发明公开了一种高通量定量检测过敏原特异性IgE抗体试剂的制备方法，属于医疗器械技术领域。一种高通量定量检测过敏原特异性IgE抗体试剂的制备方法，主要包括以下步骤：选取五种量子点；制备结合垫；制备包被板；制备成过敏原特异性IgE抗体检测试剂盒并在仪器上进行检测：将制备的结合垫、包被板、样品垫、吸水纸、组装成检测试纸条，将组装好的检测试纸条在多通道免疫层析分析仪上进行检测；本发明将鼠抗人IgE抗体和羊抗鸡Ig Y抗体分别包被在NC膜上，在包被膜的制备过程使用了放大系统，将链霉亲和素SA8预包被在NC膜上，后包被生物素标记的鼠抗人IgE抗体，鼠抗人IgE被充分的包被在NC膜上，降低了反应的空间位阻，提高了检测的灵敏度。的灵敏度。的灵敏度。


技术研发人员：孙燕燕 亓德胜 武建伟 沈付娆 梁玉 杨彩月 孙杰 刘倩 孙相美 潘影
受保护的技术使用者：济南德亨医学科技有限公司
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/7/12