使用AIMP2-DX2和任选地miR-142的靶序列及其组合物治疗年龄相关的黄斑疾病的方法与流程

franciscoca；由novartis全球商业化)由美国食品药品监督管理局(fda)于2006年批准用于治疗新生血管性amd(hernández-zimbrón2018)。它是一种靶向并以高亲和力结合vegf-a的重组人源化免疫球蛋白(ig)g1κ同种型单克隆抗原结合片段(fab)。阿柏西普(aflibercept)(regeneron,tarrytown,ny；由bayerag全球商业化)于2011年获fda批准。它是一种将人vegf受体1和2的两个关键结合结构域与人igg1的片段可结晶(fc)区组合的融合蛋白。最后，贝伐单抗(bevacizumab)(genentechinc.,southsanfrancisco,ca；由roche全球商业化)是结合并阻断全部vegf同工型的全长人源化抗体。11.氧化应激可以触发凋亡，这可能活化并召集巨噬细胞并且诱导炎症。凋亡可以是cnv模型中脉络膜炎症和因此血管生成的触发者之一(du2013)。12.aimp2-dx2是多因素凋亡性基因aimp2的拮抗性备选剪接变体。已知aimp2-dx2通过阻碍aimp2的功能抑制细胞凋亡。充当aimp2的竞争性抑制物的aimp2-dx2通过抑制traf2的遍在蛋白化/降解，抑制tnf-α介导的凋亡。另外，已经报道，在现有研究中已确认aimp2-dx2作为肺癌现有诱导因素并且，确认癌细胞中广泛表现的aimp2-dx2通过干扰aimp2的癌症抑制功能诱导癌症。另外，发现正常细胞中aimp2-dx2的表现推进细胞的癌化，而抑制aimp2-dx2的表现，则阻抑癌生长，因而展示出治疗作用。13.还已经确定aimp2-dx2可以用于治疗神经元疾病(kr10-2015-0140723(2017)和us2019/0298858(2019)。14.发明概述15.本文中公开了在有需求的受试者中治疗年龄相关的黄斑疾病(amd)的方法，包括向受试者施用药用有效量的包含外显子2缺失的aimp2变体(aimp2-dx2)基因的重组载体。在一些实施方案中，amd是湿性amd。在一些实施方案中，amd是干性amd。16.重组载体还可以包含mir-142靶序列。17.载体还可以包含与aimp2-dx2有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是逆转录病毒(ltr)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、mt启动子、ef-1α启动子、ub6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、cag启动子、rpe65启动子或视蛋白启动子。18.mir-142靶序列可以相对于aimp2-dx2基因为3’。19.在一些实施方案中，aimp2-dx2基因包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与seqidno:2、13、14、15、16、17、18、19或20至少90％同一。20.在一些实施方案中，aimp2-dx2基因包含编码seqidno:2、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列的核苷酸序列。21.在一些实施方案中，aimp2-dx2基因不具有外显子，所述外显子包含编码与seqidno:10或11至少90％同一的氨基酸序列的核苷酸序列。22.在一些实施方案中，aimp2-dx2基因不具有外显子，所述外显子包含编码seqidno:10或11的氨基酸序列的核苷酸序列。23.mir-142靶序列可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含acacta。在一些实施方案中，mir-142靶序列包含acacta和seqidno:5的1-17个额外的连续核苷酸。在一些实施方案中，mir-142靶序列包含与seqidno:5(tccataaagtaggaaacactaca)的核苷酸序列至少50％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，mir-142靶序列可以包含seqidno:5的核苷酸序列。24.在一些实施方案中，mir-142靶序列包含acttta。在一些实施方案中，mir-142靶序列包含acttta和seqidno:7的1-15个额外的连续核苷酸。在一些实施方案中，mir-142靶序列包含与seqidno:7(agtagtgctttctactttatg)的核苷酸序列至少50％同一的核苷酸序列。在一些实施方案中，mir-142靶序列包含seqidno:7的核苷酸序列。25.mir-142靶序列可以在本文公开的载体中重复2-10次。26.载体可以是病毒载体。病毒载体可以是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、人免疫缺陷病毒(hiv)载体、鼠白血病病毒(mlv)载体、禽肉瘤/白血病病毒(aslv)载体、脾坏死病毒(snv)载体、劳斯肉瘤病毒(rsv)载体、小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)载体、单纯疱疹病毒载体或痘苗病毒载体。27.在一些实施方案中，将重组载体局部施用至、通过玻璃体内注射施用至、通过结膜下注射施用至或施用入受试者的视网膜下腔中。28.本文所公开的方法还可以包括向受试者施用额外的治疗剂。在一些实施方案中，额外的治疗剂是雷珠单抗、阿柏西普或贝伐单抗。附图说明29.图1显示重组载体示例。30.图2显示重组载体在体外环境下的神经细胞特异性表达。31.图3显示mir142-3pt(加下划线)重复4次的mir142-3pt(靶)序列(seqidno:6)。32.图4a显示有1、2和3次重复的mir142-3pt及突变体的示意图。图4b显示用mir-142-3pt的1、2和3次重复来抑制mir142-3p对dx2表达的作用。33.图5显示核心结合序列在dx2抑制中重要。使用含tseqx3次重复的载体(其显示显著抑制dx2)(图4b)和将dx2构建体作为对照。100pmolmir-142-3p处理显著地抑制tseqx3载体，但是dx2序列和突变体序列不受抑制。34.图6a-图6c.aimp2-dx2和变体的氨基酸序列比较(图6b和图6c是图6a的继续)。35.图7.dx2在cnv小鼠模型中的预防性效力。经scaav2-gfp或scaav2-dx2处理后激光光凝术部位的荧光素血管造影图像和吲哚花青绿(indocyaninegreen)血管造影图像。注入病毒后二十一天的激光所诱导cnv。36.图8.脉络膜血管新生面积比较。经gfp对照和dx2处理时，渗漏面积对cnv面积之比率。通过使用fa测量高荧光总面积，估计渗漏面积，并且使用icga测量cnv面积。dx2处理所致的cnv面积改变。基于测量的同工凝集素b4总量，计算cnv量。对于每个组，n＝12，*p《(0.05)。37.图9.激光诱导的脉络膜血管新生(cnv)小鼠模型中的vegf表达。cnv小鼠模型中vegf表达的蛋白质印迹结果和vegf倍数变化。通过imagej测量vegf倍数变化。对于每个组，n＝6，*p《(0.05)。38.图10.视网膜的横截面组织学(h&e染色)。39.图11a-图11e.视网膜组织学厚度的组织学量值。图11a.视网膜厚度。图11b.rpe(视网膜色素上皮)厚度。图11c.onl(感光器(photoreceptor)的外核层)厚度。图11d.外段(outersegment)厚度。图11e.opl(外丛状层(outerplexiformlayer))厚度。全部样品均从含有视神经的10μm厚的切片获得。视网膜中转染dx2基因导致神经视网膜总厚度恢复(图11a)。dx2的转染显示较厚的rpe层(图11b)及感光器外段层(图11c)，表明dx2表达阻止rpe变性及感光器纤毛降解。dx2的转染还显示较厚的感光器外核层(图11d)和外丛状层(图11e)，表明dx2表达减少感光器变性。40.图12.rpe(视网膜色素上皮)的完整性和增生。dx2基因的转染通过激活rpe增生，导致rpe完整性恢复。41.图13.pr(感光器)恢复。dx2基因的转染通过激活pr增生，导致pr群体恢复。42.图14a-图14b.rpe和pr的细胞性增生。测量ki67表达以分析rpe层和感光器层中的增生。在aav2-dx2转染的样品中，rpe(图14a)和感光器外段层(图14b)中增生显著地更高。43.图15a-图15f.视网膜功能恢复。aav2-dx2已转染样品的视网膜电图显示正常erg图形格式的恢复增长(图15a和图15b)。aav2-dx2转染显示与干性amd模型(mdm1-/-)或阴性对照(mdm1-/-+aav-gfp)相比，α-波波幅增加(图15c)且潜伏期缩减(图15d)，这表明dx2表达减少损伤感光器的电生理学功能和视敏度。aav2-dx2转染的样品未改变b-波波幅(图15e)和潜伏期(图15f)。44.发明详述45.aimp2-dx2是多因素凋亡性基因aimp2(氨酰基trna合酶复合体相互作用的多功能蛋白2)的拮抗性备选剪接变体。已知aimp2-dx2通过阻碍aimp2的功能抑制细胞凋亡。46.充当aimp2的竞争性抑制物的aimp2-dx2通过抑制traf2的遍在蛋白化/降解，抑制tnf-α介导的凋亡。47.还已经确定aimp2-dx2可以治疗神经元疾病(us2019/0298858a1)。48.还已经确定将aimp2-dx2插入腺相关病毒中并将所得到物引入视网膜下腔时，它抑制脉络膜血管新生。49.本文中公开了在有需求的受试者中治疗年龄相关的黄斑疾病(amd)的方法，包括向受试者施用药用有效量的包含外显子2缺失的aimp2变体(aimp2-dx2)基因的重组载体。在一些实施方案中，amd是湿性amd。在一些实施方案中，amd是干性amd。50.本文中公开了在患有amd的受试者中眼或眼周区域内减少血管渗漏、减少脉络膜血管新生面积、减少脉络膜血管新生形成或减少vegf表达的方法，所述方法包括向受试者施用药用有效量的包含外显子2缺失的aimp2变体(aimp2-dx2)基因的重组载体。51.如本文中公开的重组载体还可以包含mir-142靶序列。载体还可以包含与aimp2-dx2有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是逆转录病毒(ltr)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、mt启动子、ef-1α启动子、ub6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、cag启动子、rpe65启动子、突触蛋白启动子、mecp2启动子、camkii启动子、hb9启动子或视蛋白启动子。52.在本文所公开的方法中，在一些实施方案中，重组载体可以包含外显子2缺失的aimp2变体(aimp2-dx2)基因和mir-142靶序列。mir-142靶序列可以相对于aimp2-dx2基因为3’。本文所述的载体可以在神经元细胞中表达aimp2-dx2，但不在造血细胞，如白细胞和淋巴样细胞中表达。53.aimp2-dx2多肽(seqidno:2)是aimp2(例如，seqidno:12的aa序列；例如，seqidno:3的nt序列)的剪接变体，其中缺失了aimp2的第二外显子(seqidno:10；seqidno:4的nt序列)。在一些实施方案中，aimp2-dx2基因具有seqidno:1中所述的核苷酸序列，并且aimp2-dx2多肽具有seqidno:2中所述的氨基酸序列。aimp2-dx2多肽的变体或同工型也为已知并且可以由本领域那些技术人员确定(例如，参见seqidno:13-19)。例如，图6a-图6c显示aimp2(seqidno:2)和变体seqidno:13-19比较，以及aimp2或aimp2-dx2的共有或核心序列(seqidno:20)。54.在一些实施方案中，aimp2-dx2基因可以包含编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列与seqidno:2、13、14、15、16、17、18、19或20至少90％同一、至少93％同一、至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或其间任何同一性％范围。aimp2-dx2基因可以包含编码seqidno:2、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列的核苷酸序列。55.aimp2-dx2基因可以包含与seqidno:1的核苷酸序列至少90％同一、至少93％同一、至少95％同一、至少96％、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或其间任何同一性％范围的核苷酸序列。aimp2-dx2基因可以包含seqidno:1的核苷酸序列。56.在一些实施方案中，aimp2-dx2基因不具有包含下述核苷酸序列的外显子，所述核苷酸序列编码与seqidno:10或11具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，aimp2-dx2基因不具有外显子，所述外显子包含编码seqidno:10或11的氨基酸序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，aimp2-dx2基因不具有包含下述核苷酸序列的外显子，所述核苷酸序列与seqidno:4具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。57.mir-142靶序列(mir-142t)可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含acacta。mir-142靶序列可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含acacta和seqidno:5的1-17个额外的连续核苷酸。例如，mir-142靶序列可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含acacta和如seqidno:5中所示与acacta的5’或3’邻接的总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个额外核苷酸。58.mir-142靶序列可以包含与seqidno:5(tccataaagtaggaaacactaca；mir-142-3pt)的核苷酸序列至少50％同一、至少60％同一、至少70％同一、至少80％同一、至少90％同一、至少90％同一、至少93％同一、至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一的核苷酸序列。mir-142靶序列可以包含seqidno:5的核苷酸序列。59.mir-142靶序列可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含acttta。mir-142靶序列可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含acttta和seqidno:7的1-15个额外的连续核苷酸。例如，mir-142靶序列可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含acttta和如seqidno:7中所示与acttta的5’或3’邻接的总计1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个额外核苷酸。60.mir-142靶序列可以包含与seqidno:7(agtagtgctttctactttatg；mir-142-5pt)的核苷酸序列至少50％同一、至少60％同一、至少70％同一、至少80％同一、至少90％同一、至少90％同一、至少93％同一、至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一或100％同一的核苷酸序列。mir-142靶序列可以包含seqidno:7的核苷酸序列。61.mir142-3pt突变体序列的示例是：62.ccgctgcagtgtgacagtgccagccaatgtgcagaggtggatgaggtcttgtgaaaacctggctccttttaacacggccctcaagct63.ccttaagtgaccagaagcttgctagctccataaagtaggaccactgcaatcactccataaagtaggaccactgcaagatatctccataaagtaggaccactgcaatcactccataaagtaggaccactgcaaaagcttgtagggatccgcc(seqidno:25)。64.突变体序列指mir1423pt的核心序列的一个或多个区域，例如，四个区域，如下置换：(5’‑aacactac-3’→5’‑ccactgca-3’)。载体转染的hek293细胞中随mir142-3px1重复(100pmol)mir142-3p靶序列观察到抑制dx2表达并且随着mir142-3p靶序列中核心结合序列的数目增加，mir142-3p抑制对dx2表达的作用也增加。含有tseqx3核心序列的载体显示明显的抑制作用，而未观察到突变3x序列的抑制作用。65.微rna(mirna)是功能在于控制基因表达的非编码rna分子。mirna通过与mrna分子内部的互补序列(即，mirna靶序列)碱基配对发挥作用。mirna可以与蛋白质编码基因的靶信使rna(mrna)转录物结合并且负向控制它们的翻译或引起mrna降解。目前，已经鉴定到超过2000种人mirna并且公众可获得mirbase数据库。许多mirna以组织特异性方式表达并且在维持组织特异性功能和分化方面具有重要作用。66.mirna在基因的翻译后阶段发挥作用，并且在哺乳动物的情况下，已知大约60％基因表达受mirna控制。mirna在活体内部种类繁多的过程中发挥重要作用并且已经公开与癌症、心脏疾病和神经相关疾病有相关性。例如，mir-142-3p和mir-142-5p存在于mir-142中并且可以使用任一其靶序列。因此，“mir-142”或“mirna-142”例如指mir-142-3p和/或mir-142-5p，并且可以结合至mir-142靶序列，例如，mir-142-3pt或mir-142-5pt。67.mir-142靶序列可以相对于aimp2-dx2基因为5’或3’。68.例如，“mir-142-3p”可以存在于侵袭性b细胞白血病中其基因转位发生的区域内并且已知在造血组织(骨髓、脾和胸腺等)中表达。另外，已知mir-142-3p参与造血系统分化，同时确认在胎小鼠肝脏(小鼠造血组织)中表达。69.在一些实施方案中，mir-142-3p和/或mir-142-5p靶序列重复至少2-10次、至少2-8次、至少2-6次、至少4次或其任何范围或次数。70.作为一个示例，例如具有seqidno:23的核苷酸序列的mir-142-3p可以具有相应的靶序列，例如，mir-142-3p靶序列(mir-142-3pt)具有seqidno:5的核苷酸序列，但不限于此。例如具有seqidno:24的核苷酸序列的mir-142-5p可以具有相应的靶序列，例如，mir-142-5p靶序列(mir-142-5pt)具有seqidno:7的核苷酸序列，但不限于此。71.在一些实施方案中，mir-142-3p可以具有seqidno:23的核苷酸序列并且mir-142-5p可以具有seqidno:24的核苷酸序列。72.本文中公开了可以通过以下方式控制aimp2-dx2变体过量表达的副作用的重组载体：将mir-142-3p靶序列和/或mir-142-5p靶序列(分别为mir-142-3pt和/或mir-142-5pt)插入aimp2-dx2的末端并且控制cd45衍生的细胞、尤其淋巴系统和白细胞中对aimp2-dx2表达的抑制。因此，aimp2-dx2变体的表达可以仅限于被注射的神经元细胞和组织中，而不在非神经元造血细胞(被注射的组织区域内的主要群体)中表达。mir142-3p仅在造血细胞中表达。73.本文中公开了含有针对mir-142-3p和/或mir-142-5p的靶序列的重组载体。本文中公开了包含如本文中公开的外显子2缺失的aimp2变体(aimp2-dx2)基因和mir-142-3p和/或mir-142-5p靶序列的重组载体。74.术语“重组载体”指可以在适宜的宿主细胞中表达为靶蛋白质或rna的载体，及基因构建体，所述基因构建体含有基本上有效连接的控制因子以使得插入的基因适当表达成为可能。75.术语“有效连接”指核酸表达控制序列与这样的核酸序列之间的功能性联系，所述核酸序列编码被靶向的执行总体功能的蛋白质和rna。例如，它可以影响这样的核酸序列表达，所述核酸序列编码已经出于核酸序列的可操作性而连接的启动子和蛋白质或rna。可以通过使用相应
技术领域：
：内熟知的基因重组技术及使用相应
技术领域：
：内通常已知用于区域特异性dna切割和连接的酶，产生与重组载体的有效连接。76.重组载体还可以包含如本文中公开的与aimp2-dx2有效连接的启动子。在一些实施方案中，启动子是逆转录病毒(ltr)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、mt启动子、ef-1α启动子、ub6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、cag启动子、rpe65启动子、突触蛋白启动子、mecp2启动子、camkii启动子、hb9启动子或视蛋白启动子。77.重组载体可以额外地含有异质启动子及启动子中有效连接的异质基因。78.如本文所用的“异质基因”可以包括具有生物学上适宜激活的蛋白质或多肽，和靶向产物(如免疫原或抗原性蛋白质或多肽或治疗激活性蛋白质或多肽)的加密序列。79.多肽可以补足宿主细胞中内源蛋白的匮乏或缺少表达。可以从种类多样的供应物引出基因序列，所述供应物包括dna、cdna、合成dna、rna或其组合。基因序列可以包括含有或不含有天然内含子的基因组dna。另外，基因组dna可以随启动子序列或聚腺苷酸化序列一起获得。基因组dna或cdna可以按多种方法获得。可以通过相应领域内公开通告的方法从适宜细胞提取和纯化基因组dna。备选地，通过与细胞分离，mrna可以用来借助逆转录或其他方法产生cdna。备选地，多核苷酸序列可以含有与rna序列互补的序列，例如，反义rna序列，并且可以将反义rna施用至个体，以阻遏个体的细胞中互补多核苷酸表达。80.例如，异质基因是其中缺失外显子2的aimp-2剪接变体，且mir-142-3p靶序列可以与该异质基因的3’utr连接。文献中描述了aimp2蛋白的序列(312aa形式：aac50391.1或gi:1215669；320aa形式：aah13630.1，gi:15489023、bc013630.1)(312aa形式：nicolaides,n.c.,kinzler,k.w.和vogelstein,b.analysisofthe5’regionofpms2revealsheterogeneoustranscriptsandanoveloverlappinggene(分析pms2的5’区域揭示异质转录物和一个新颖重叠基因),genomics29(2),329-334(1995)/320aa形式：generationandinitialanalysisofmorethan15,000full-lengthhumanandmousecdnasequences(超过15,000个全长人类和小鼠cdna序列的生成和初步分析),proc.natl.acad.sci.u.s.a.99(26),16899-16903(2002))。81.术语“aimp2剪接变体”指因外显子1至4当中外显子2部分或完全缺失而生成的变体。由此，该变体意味着通过形成aimp2蛋白质和异二聚体，干扰aimp2的正常功能。注射的aimp2-dx2基因很少在所注射组织之外的组织中表达。然而，作为额外的安全措施，可以插入mir142靶序列以完全阻断aimp2-dx2在造血细胞(受注射组织区域中非神经元细胞的主要群体)中表达的可能性。82.重组载体可以包括seqidno:1和5。83.术语与核苷酸或氨基酸序列的“序列同源性％”、“同一性％”或“％同一的”可以例如通过在比较结构域中比较2个最佳排列的序列来证实，并且最佳排列这2个序列(不包含添加或缺失)时与参考序列相比，比较结构域中一些核苷酸序列可以包括添加或缺失(即，缺口)。84.如本文中公开的蛋白质不仅包括具有其天然型氨基酸序列的那些，还包括具有变异氨基酸序列的那些。85.蛋白质的变体预示具有因天然氨基酸序列缺失、插入、非保守性或保守性置换或其组合和多于1个氨基酸残基所致的差异序列的蛋白质。在相应区域注明蛋白质和肽中总体上不改变分子活性的氨基酸交换(h.neurath,r.l.hill,theproteins,academicpress,newyork,1979)。86.可以通过天然提取、合成(merrifield,j.amer.chem.soc.85:2149-2156,1963)或基于dna序列的基因重组(sambrook等人,molecularcloning,coldspringharbourlaboratorypress,newyork,usa,第2版,1989)产生蛋白质或其变体。87.基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如亲水性、疏水性、电荷和大小等可以存在氨基酸突变。根据对氨基酸侧链取代基大小、形状和类型的分析，可以了解精氨酸、赖氨酸和组氨酸是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这类考虑，可以认为精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸在生物学上为功能等同物。88.在引入一个或多个突变中，可以考虑氨基酸的疏水指数。根据疏水性和电荷向每种氨基酸赋予疏水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。89.在赋予蛋白质的互作性生物学功能时，疏水性氨基酸指数非常重要。只有用疏水指数相似的氨基酸进行置换才可能具有相似的生物学活性。在通过参考疏水指数引入突变的情况下，在疏水指数差异处于±2以内、±1以内或±0.5以内的氨基酸之间置换。90.同时，还众所周知，在亲水性值相似的氨基酸之间置换可以诱导具有等同生物学活性的蛋白质。如美国专利号4,554,101中所示，向每种氨基酸残基赋予以下亲水值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。91.在通过参考亲水值引入一个或多个突变的情况下，在亲水值差异处于±2以内、±1以内或±0.5以内的氨基酸之间置换，但不限于此。92.在相应区域注明蛋白质中总体不改变分子活性的氨基酸交换(h.neurath,r.l.hill,theproteins,academicpress,newyork,1979)。大部分通常存在的交换是在包括以下的氨基酸残基之间的那些交换：ala/ser、val/ile、asp/glu、thr/ser、ala/gly、ala/thr、ser/asn、ala/val、ser/gly、thy/phe、ala/pro、lys/arg、asp/asn、leu/ile、leu/val、ala/glu和asp/gly。可以通过相应行业中公开的多种方法构建载体系统。sambrook等人(2001),molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress中描述了具体方法。93.本文公开的载体可以作为常见的克隆或表达载体构建。另外，载体可以用原核或真核细胞作为宿主来构建。如果载体是表达载体和并且使用原核细胞作为宿主，则通常纳入执行转录的强力启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacuv5启动子、1pp启动子、plx启动子、prx启动子、rac5启动子、amp启动子、reca启动子、sp6启动子、trp启动子和t7启动子等)、编码启动用核糖体结合位点和转录/编码终止序列。在使用大肠杆菌(例如，hb101、bl21、dh5a等)作为宿主细胞的情况下，大肠杆菌色氨酸生物合成途径的启动子和操纵基因位点(yanofsky,c.(1984),j.bacteriol.,158:1018-1024)和噬菌体x的左向启动子(plx启动子，herskowitz,i.和hagen,d.(1980),ann.rev.genet.,14:399-445)可以用作对照。94.同时，可以使用的载体可能多于1个类型，如病毒载体、线性dna或质粒dna。[0095]“病毒载体”指能够递送基因或遗传物质至目的细胞、组织和/或器官的病毒载体。[0096]病毒载体可以包括多于1个来自腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、hiv(人类免疫缺陷病毒)、mlv(鼠白血病病毒)、aslv(鸟类肉瘤/白血病)、snv(脾坏死病毒)、rsv(劳斯肉瘤病毒)、mmtv(小鼠乳腺瘤病毒)和单纯疱疹病毒所组成群组的种类，但它不限于此。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺相关病毒(aav)载体、腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、痘苗病毒载体或单纯疱疹病毒载体。[0097]尽管逆转录病毒具有宿主细胞基因组整合功能且无害于人体，但它可以具有诸特征，包括整合时抑制正常细胞的功能、感染种类多样细胞的能力、易于增殖、容纳大约1-7kb外来基因及生成复制缺陷病毒。然而，逆转录病毒还可能具有诸缺点，包括难以感染有丝分裂后的细胞、体内条件下递送基因及需要在体外条件下增殖体细胞。另外，逆转录病毒具有自发突变风险，因为它可以整合入原癌基因中，因而带来细胞坏死的可能性。[0098]同时，腺病毒作为克隆载体具有多种优点，包括甚至在中等大小水平的细胞的胞核中复制、临床上无毒、即使插入外来基因亦稳定、无基因重排或丢失、转化真核生物，并且甚至整合入宿主细胞染色体时也高水平稳定地表达。腺病毒的良好宿主细胞是作为人类中造血系统瘤、淋巴瘤和骨髓瘤病因的细胞。然而，增殖困难，原因在于它是线性dna且不易回收感染的病毒，且病毒感染率低。另外，已递送基因的表达在1-2周的期间最大量，而仅在一些细胞中表达维持3-4周。另一个问题是它具有高度的免疫抗原性。[0099]近几年，腺相关病毒(aav)是优选的，因为它可以弥补前述问题并且作为基因治疗剂具有众多优点。它还称作腺卫星病毒。腺相关病毒粒子的直径是20nm并且已知其对人体几乎无害。由此，其作为基因治疗剂在欧洲获批。[0100]aav是需要辅助病毒以重复的单链前病毒，并且aav基因组具有可以向已感染细胞的染色体19的特定区域中插入的4,680bp。将反式基因插入质粒dna，所述质粒dna由2个各自145bp的反向末端重复序列(itr)序列部分和信号序列部分连接。用表达aavrep部分和cap部分的其他质粒dna一起执行转染，并且添加腺病毒作为辅助病毒。aav具有以下优点：递送基因的宿主细胞类型广泛、反复施用时免疫副作用少和基因表达时间长。另外，它安全，即便aav基因组整合入宿主细胞的染色体亦如此，并且不改变或重排宿主的基因表达。[0101]腺相关病毒已知具有总共4个血清型。在可以用于递送靶基因的许多腺相关病毒的血清型当中，研究最充分的载体是腺相关病毒血清型2并且当前用于递送囊性纤维化、血友病和canavan病的临床基因。另外，最近，重组腺相关病毒(raav)的潜力在基因治疗癌症领域正在增加(du2013)。在一些实施方案中，可以使用腺相关病毒血清型2。但不限于此，可以选择并应用适当的病毒载体。[0102]另外，如果载体是表达载体并且使用真核细胞作为宿主，则可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，后腺病毒启动子、痘苗病毒7.5k启动子、sv40启动子、巨细胞病毒启动子和hsvtk启动子)。具体而言，尽管启动子可以包括多于1个选自以下的种类：逆转录病毒ltr、巨细胞病毒(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、mt启动子、ef-1α启动子、ub6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、cag启动子、rpe65启动子和视蛋白启动子，但不限于这些启动子。另外，它通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。[0103]本文公开的载体可以根据需要与其他序列融合，以使得蛋白质纯化更容易。可以例如使用诸如谷胱甘肽s-转移酶(pharmacia，美国)、麦芽糖结合蛋白(neb，美国)、flag(ibi，美国)和6xhis(六组氨酸；quiagen，美国)等融合序列，但不限于这些融合序列。另外，表达载体可以包含通常在相应行业中用作选择性标志物的抗生素耐药基因，所述抗生素包括氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素作为示例。[0104]另外，本文公开了基因载体，包括含有分别针对mir-142(如mir-142-3p和/或mir-142-5p)的靶序列(mir-142-3pt和/或mir-142-5pt)的重组载体。[0105]术语“基因转移”包括递送遗传物质至细胞以便总体转录和表达。基因转移的方法用于蛋白质表达和治疗目的是理想的。公开了种类多样的递送方法如dna转染法和病毒转导法。病毒介导的基因转移是突出的：因为已递送基因的高递送效率和高表达水平及(如果需要)自然界友好或假性分型而靶向特定受体和/或细胞类型的可能性。[0106]基因载体可以是已被转化成重组载体的已转化实体，并且转化包括向有机体、细胞、组织或器官引入核酸的全部方法，并且如在相应领域所公开，有可能根据宿主细胞选择并且执行适宜的标准技术。这类方法包括电穿孔法、原生质融合法、磷酸钙(cap04)沉降法、氯化钙(cacl2)沉降法，与使用碳化硅纤维(siliconecarbidefiber)混合法、农杆菌介导的转化法、peg法、硫酸葡聚糖法和脂质转染胺法(lipofectamin)等，但不限于这些方法。[0107]基因载体用于在神经元中表达异质基因。就此而言，它抑制异质基因在cd45衍生的细胞中表达并且可以增加异质基因在脑组织中表达。cd45的主体是位于造血细胞的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶。可以根据位于细胞表面上的分子界定细胞并且cd45是全部白细胞群和b淋巴细胞的细胞标志物。基因载体不在cd45衍生的细胞中、尤其淋巴样细胞和白细胞范围的细胞中表达。[0108]基因载体可以额外地包含允许按药理方式使用的运载体、赋形剂或稀释剂。[0109]另外，本文公开了在神经元中递送及表达异质基因的方法，所述方法包括将重组载体引入相应实体的步骤。[0110]这些方法可以增加异质基因在脑组织中表达并且控制异质基因在其他组织中表达。[0111]另外，本文公开了载体，所述载体包含1)启动子；2)与启动子有效连接的编码靶蛋白的核苷酸序列；和3)包含插入在该核苷酸序列3’utr的靶向mir-142-3p的核苷酸序列的表达盒。在一些实施方案中，载体可以包含1)启动子；2)与启动子有效连接的编码靶蛋白的核苷酸序列；和3)包含插入在该核苷酸序列3’utr的靶向mir-142-5p的核苷酸序列的表达盒。[0112]术语“表达盒”指这样的单元盒，其可以执行表达以产生并分泌与下游信号肽有效连接的靶蛋白，因为它包含编码靶蛋白的基因和编码启动子与信号肽的核苷酸序列。分泌表达盒可以与分泌系统混合。可以辅助靶蛋白高效产生的种类多样的因子可以包含于这类表达盒中及其外部。[0113]另外，本文公开了用于amd的预防或治疗用制剂，所述制剂包含编码缺失外显子2的aimp-2剪接变体的核苷酸序列和与该核苷酸序列3’utr连接的靶向mir-142-3p的核苷酸序列。[0114]因此，本文还公开了在有需求的受试者中治疗amd的方法，所述方法包括施用本文公开的任一载体。在一些实施方案中，amd是湿性amd。在一些实施方案中，amd是干性amd。[0115]本文公开的载体可以实现但不限于抑制凋亡、改善运动失调和/或抑制氧化应激，并且因此预防或治疗amd。[0116]术语“治疗”不仅包括完全治疗amd，还包括作为施加本文公开的药理学物质的结果，部分治疗、改善和/或减少amd的总体症状。[0117]术语“预防”意指通过以下方式事先防止amd的总体症状出现：施加本文公开的药理学物质至出现退行性脑病的实体，抑制或阻断诸如认知障碍、行为障碍和脑神经毁坏等症状或现象。[0118]相对于本文公开的药理学物质，可以额外地包括非有效成分的佐剂。可以非限制地使用任何佐剂，只要它在相应
技术领域：
：为已知即可，但可以例如通过进一步包含弗氏完全和不完全佐剂来增加免疫性。[0119]本文公开的药理学物质可以按照使有效成分与药理学允许的载体混合的样式制造。此处，药理学允许的载体包括药理学领域内通常使用的载体、赋形剂和稀释剂。可以用于本文所公开药理学物质的药理学允许的载体包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿位伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟甲基苯甲酸酯、羟丙基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于这些。[0120]本文公开的药理学物质可以通过按照各种样式制造来使用，所述样式包括口服施用类型如粉剂、颗粒剂，丸剂、胶囊剂、混悬溶液剂、乳剂、糖浆剂和气溶胶剂等，及根据其相应的一般制造方法，包括外部施加、栓剂药物或消毒注射溶液等。[0121]当制造成制剂时，可以在制造中使用通常使用的稀释剂或赋形剂如填料，增容剂、结合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂等。固态口服施用制剂包括丸剂、片剂、粉剂、颗粒剂和胶囊制剂，并且可以通过将多于1种赋形剂如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶与有效成分混合，制造这类固态制剂。另外，除简单赋形剂之外，也可以使用润滑剂如硬脂酸镁和滑石。液态口服施用制剂包括混悬溶液剂、内用溶液剂、油剂和糖浆剂等，同时包含除了作为通常用作稀释剂的水和液体石蜡之外的各种赋形剂如湿润剂、甜味剂、调味剂和防腐剂等。非口服施用制剂包括灭菌水溶液剂、非水溶剂、混悬剂、油剂、冷冻干燥剂和栓剂。可以使用如植物油、丙二醇、聚乙二醇和橄榄油和可注射用酯如乙酯作非水溶剂及混悬溶液。栓剂用物质可以包括witepsol、吐温61、可可油、月桂精油和甘油明胶(glycerogelatin)等。[0122]本文公开的药理学物质可以通过多种途径施与实体。可以使用全部施用样式如口服施用，及静脉内、肌肉、皮下和腹膜内注射。[0123]在一些实施方案中，将重组载体局部施用至、通过玻璃体内注射施用至、通过结膜下注射施用至或施用入受试者的视网膜下腔中。[0124]本文所公开的方法还可以包括向受试者施用额外的治疗剂。在一些实施方案中，额外的治疗剂是雷珠单抗、阿柏西普和/或贝伐单抗。[0125]本文公开的治疗活性剂的合乎需要的施用剂量根据各种因素而不同，所述因素包括制备生产方法、施用样式、年龄、患者体重和性别、疾病症状的程度、食物、施用期间、施用途径、释放速度和反应灵敏度等。然而，该剂量可以由相应的生产商适当地选择。[0126]对于治疗效果，熟练的医生可以确定并且开处有效剂量用于靶向治疗。例如，治疗剂包括静脉内、皮下和肌肉注射剂、通过使用微针直接注射入脑室或脊髓。有可能多次注射和反复施用，例如，有效剂量在载体情况下是0.05至15mg/kg，在重组病毒情况下是5x1011至3.3x1014个病毒粒子(2.5x1012至1.5x1016iu)/kg，以及在细胞情况下是5x102至5x107个细胞/kg。合乎需要地，按每周施用2至3次的频率，剂量在载体情况下是0.1至10mg/kg，在重组病毒情况下是5x1012至3.3x1013个粒子(2.5x1013至1.5x1015iu)/kg以及在细胞情况下是5x103至5x106个细胞/kg。不严格限制剂量。而且，它可以根据患者的状况和神经疾病的表现程度调整。按照间距10cm及每周2～3次的频率时，用于其他皮下脂肪和肌肉注射和直接施用至受累区域的有效剂量是9x1010至3.3x1014个重组病毒粒子。不严格限制剂量。而且，它可以根据患者的状况和神经疾病的表现程度调整。更具体地，本文公开的药理学物质可以包含1x1010to1x1012个vg(病毒基因组)/ml重组腺相关病毒，并且通常建议每2天注射1x1012个vg一次，进行2周。它可以一天施用一次或通过分割该剂量供一整天数次施用来施用。在一些实施方案中，载体可以按0.1x108个vg至500x108个vg、1x108个vg至100x108个vg、1x108个vg至10x108个vg(例如5x108个vg)或自其所衍生任何范围的剂量施用。对于iv注射剂，例如，vg可以转换成用于静脉内注射的基于体重的人用剂量。对于局部组织注射剂，例如，vg也可以转换成基于靶细胞数目和有效moi(感染复数)的人用剂量。[0127]在一些实施方案中，可以借助例如视网膜下注射、玻璃体内注射或脉络膜下注射，将本文公开的载体注入受试者。注射剂可以处于液体形式。在其他实施方案中，本文公开的载体可以按滴眼剂或油膏剂形式施用至受试者。[0128]药理学制剂可以按种类多样的口服和非口服可施用样式生产。在一些实施方案中，本文公开的载体可以施用至脑或脊髓。在一些实施方案中，可以通过立体定位注射，将本文公开的载体施用至脑。[0129]可口服施用药剂包括丸剂、片剂、硬胶囊剂和软胶囊剂、液体剂、混悬溶液剂、油剂、糖浆剂和颗粒剂等。除有效成分之外，这些药剂还可以包含稀释剂(例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸)和润滑剂(例如，二氧化硅、滑石和硬脂酸及其镁或钙盐和/或聚乙二醇)。另外、丸剂可以含有粘合剂如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯基吡咯烷，并且取决于场景，可以含有分解剂如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或类似混合物和/或吸附剂、着色剂、风味剂和甜味剂。可以通过一般混合法、造粒法或包衣法制造药剂。[0130]另外，注射剂是非口服施用制剂的代表性形式。这类注射剂的溶剂包括水、林格氏溶液、等渗生理盐水和悬液。注射剂的灭菌固定油可以用作溶剂或悬浮介质，并且包含单甘油酯和二甘油酯的任何无刺激性固定油可以用于这个目的。另外，注射剂可以使用脂肪酸如油酸。[0131]如下将通过使用以下执行实施例更详细地解释本发明。然而，以下执行实施例仅旨在阐明本发明的内容且不将本发明的申请限于这类实施例。实施例[0132]实施例1.产生重组载体[0133]cd45的主体是造血细胞的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，可以根据细胞表面上的该分子来界定细胞。cd45是全部白细胞群和b淋巴细胞的标志物。已经产生一种重组载体，其特异性地且仅在神经元中表达，且不在cd45衍生的细胞、尤其淋巴样和白细胞中表达。该重组载体含有其中氨酰基trna合成酶复合体相互作用性多功能蛋白2(aimp2)的外显子2已被缺失的剪接变体和能够控制该aimp2剪接变体表达的mirna。[0134]作为分布安全措施，产生该重组载体，旨在诱导aimp2剪接变体在受注射的神经元组织中特异性表达。另外，这样做也旨在完全阻断aimp2-dx2在造血细胞(其为受注射组织区域中非神经元细胞的主要群体)中表达的任何可能性。[0135]实施例1-1.产生aimp2变体[0136]aimp2是参与氨酰基trna合成酶(ars)形成并且充当多因子凋亡蛋白的蛋白质之一。为了构建表达aimp2的外显子2已经被缺失的变体的质粒，将aimp2剪接变体的cdna克隆入pcdna3.1-myc。通过已经使用引物扩增aimp2剪接变体后，利用ecorl和xho1在pcdna3.1-myc中实施亚克隆，其中所述引物具有与该h322cdna连接的ecor1接头和xho1接头。[0137]使用了具有seqidno:1的核苷酸序列和seqidno:2的氨基酸序列的aimp2变体。[0138]实施例1-2.分选mirna并且选择其靶序列[0139]如上文提到，作为分布安全措施，如上文产生重组载体，旨在使aimp2变体的表达限于受注射的神经元细胞中并且旨在完全阻断aimp2-dx2在造血细胞(受注射组织区域中非神经元细胞的主要群体)中表达的可能性。[0140]为此目的，选择仅在产生白细胞和淋巴样相关细胞的造血细胞中特异性表达的mir-142-3p作为靶。为了产生仅靶向mir-142-3p的序列，使用小鼠b细胞的微阵列数据和对mir-142-3p所靶向的基因的计算机编程(mirsvr评分)。mir-142-3p是seqidno:中所示的核苷酸序列。seqidno:5的mir-142-3p靶序列与mir-142-3p结合。[0141]mir-142-3p靶序列包含nhe1和hindiii、bmt1位点序列(ccagaagcttgctagc；seqidno:21)和hindh位点序列(aagcttgtag；seqidno:22)。mir-142-3pt可以包含重复4次的seqidno:5的核苷酸序列，以及将它们连接的接头(tcac和gatatc)(图4；seqidno:6)。[0142]实施例1-3.产生重组载体[0143]为了产生重组载体，将mir-142-3p靶序列(seqidno:5)插入aimp2变体(序列编号1)的3’utr。将aimp-2变体和碱基序列编号6的mir-142-3p靶序列连接，并且具体而言，将它们切割并通过使用nhei位点和hindiii位点插入。图1中显示重组载体。[0144]实施例2.确认神经细胞体外特异性表达重组载体[0145]由于mir142-3p仅在造血细胞中特异性表达，故在特定细胞中根据重组载体的mir142-3p靶序列的表达来敲低根据aimp2变体而确认aimp2变体的表达程度。[0146]具体而言，存在无重组载体处理组(sham)、空白/对照载体处理组(nc载体)、单一aimp2变体载体处理组(pscaav_dx2)和重组载体处理组(pscaav-dx2-mir142-3pt)。全部载体的浓度均以ug/ul为单位且每个组用2.5ul(2.5ug)处理。在每个处理组中，处理thp-1细胞株(人白血病单核细胞)和sh-sy5y细胞株(神经母细胞瘤)，同时证实aimp2变体敲低。通过使用下表1中引物，执行qpcr(变性15秒和温度60℃复性与延伸30秒，经历40个循环)。[0147]表1[0148]aimp2变体引物seqidno:正向ctggccacgtgcaggattacgggg(仅人类)8反向aagtgaatcccagctgatag(仅人类)9[0149]作为结果，确认aimp2变体在sham组和nc载体组中未表达。另外，确认在单一aimp2变体载体处理组(pscaav-dx2)的thp-1细胞株和sh-sy5y细胞株中存在表达，因而确认未诱导神经细胞特异性表达。在另一方面，确认aimp2变体仅在重组载体处理组的sh-sy5y细胞株中特异性表达(图2)。[0150]实施例3.材料与方法[0151]实施例3-1.qrt-pcr[0152]根据生产商的操作方案，使用trizol(invitrogen,waltham,ma,usa)从脊髓分离总rna。通过定量用分光光度计(asp-2680,actgene,usa)对提取的rna定量。为产生cdna，借助生产商的方案，使用superscriptⅲfirst-strand(invitrogen)进行逆转录。使用sybr绿pcr主混合物(thermofisherscientific,usa)，将所产生的cdna用于实时pcr。重复结果的表达数据用于2-δδct统计分析并且gadph表达用于归一化。[0153]实施例3-2.mir142-3p抑制实验[0154]可以从x1mir-142-3p靶序列观察到mir-142-3p抑制对dx2表达的作用。使用脂质转染胺2000(invitrogen，us)，将hek293细胞用x1、x2和x3重复mir-142-3p靶序列载体瞬时转染，以及也用100pmolmir-142-3p瞬时转染，并且随后孵育48小时。通过pcr分析dx2mrna的量。从tseqx1次重复mir142-3p靶序列中观察到mir142-3p抑制对dx2表达的作用(图4b)。[0155]实施例4[0156]实施例4-1.所生成的3种载体的核心结合序列的抑制作用[0157]tseqx1含有1个核心结合序列，tseqx2含有2个核心结合序列，并且tseqx3含有3个核心结合序列(图4a)。[0158]从x1重复mir142-3p靶序列开始观察到mir142-3p(100pmol)抑制对dx2表达的作用。使用脂质转染胺2000(invitrogen,us)，将hek293细胞用x1、x2和x3重复mir-142-3pt序列载体瞬时转染，以及也用100pmolmir-142-3p瞬时转染，随后孵育48小时。通过pcr分析dx2mrna的量。当mir142-3p靶序列中核心结合序列的数目增加时，mir142-3p抑制对dx2表达的作用也增加。含有tseqx3核心序列的载体显示明显的抑制作用(图4b)。[0159]实施例4-2.核心序列突变.[0160]使用小鼠b细胞微阵列数据和mir-142-3p靶基因的mirsvr评分，预测核心序列。如下置换核心序列的四个区域：(5’‑aacactac-3’→5’‑ccactgca-3’)(原始序列参见图3并且示意图参见图4a)。[0161]实施例4-3.核心结合序列对dx2抑制作用重要。[0162]置换四个核心序列(图4a)。通过使用脂质转染胺2000(invitrogen，us)，将hek293细胞用dx2-mir-142-3ptseqx3重复载体(tseq3x)或用核心序列突变的载体(mut)瞬时转染，以及用100pmolmir-142-3p瞬时转染，并且随后孵育48小时。通过pcr分析dx2mrna的表达。使用tseqx3重复的载体(其显示显著抑制dx2)(图4b)和dx2构建体作为对照。100pmolmir142-3p处理显著地抑制tseqx3载体，但是dx2序列和mut序列不受抑制(图5)。[0163]实施例5.湿性amd小鼠模型[0164]材料和方法[0165]5-1.动物实验[0166]动物圈养在无特定病原体条件和恒定环境条件(21-23℃温度，50-60％湿度和12小时光/暗循环)下动物设施的单独笼中。将每个组中的小鼠左眼(os，左眼)用aav-gfp处理并且将右眼(od，右眼)用aav-dx2处理。(注射：5x108个vg)。在视网膜下注射1周和10周后，使用激光光凝固仪，对眼底rpe层引入激光，以分别产生3周、3个月湿性amd模型。在激光处理2周、2个月后，分离小鼠眼球。[0167]5-1-1.使用以下方案进行视网膜下注射。[0168]将大鼠麻醉。使用腹膜内注射100mg/ml氯胺酮和经异氟烷吸入10mg/ml赛拉嗪(20μl/10g体重)。通过捏其一只爪确保动物深度麻醉。如果它蜷缩，等待几分钟并且在开始视网膜下注射之前再次尝试。将啮齿动物侧置，从而将接受注射的眼面向上。在解剖显微镜下，温和地绷紧皮肤，从而眼从眼窝略微凸出(眼球短暂突出)并且通过用两根手指刚好在耳上方且借助颌部挟持动物头部而变得更可接近，并且温和地与眼睑平行绷紧皮肤，从而眼从眼窝略微凸出。38g无菌微尖针(incyto,kr)紧贴角膜缘下方并且按避免用针触碰晶状体的角度戳一个孔洞。从眼回撤一次性尖针，同时维持头部挟持。在显微操作器上安装预加载钝针的注射器或手工持握它之后，把带钝针的注射器的尖头穿孔洞插入，再次小心勿触碰晶状体并且轻柔推动尖头非常柔和地穿过眼部直到感到阻力为止。保持全部动作均最轻微，将病毒小心缓慢地注射入视网膜下腔。在os(左眼)注射aav2-gfp。在od(右眼)注射aav2-dx2。缓慢回撤注射器。施加眼润湿滴剂以保持眼补水。继续监测动物直至它重获胸骨躺卧位。[0169]5-1-2.使用以下方案获得小鼠的激光诱导cnv模型。[0170]向小鼠引入激光之前，将激光器和裂隙灯置于可以轻易触及小鼠之处。打开激光器并且设定到预定参数。将大鼠麻醉。使用腹膜内注射100mg/ml氯胺酮和经异氟烷吸入10mg/ml赛拉嗪(20μl/10g体重)。使小鼠侧滚并且向每只眼滴入(大约30μl)盐酸丁卡因用于局部麻醉。等待2分钟以便溶液剂起效。[0171]用一滴局部用托吡卡胺重复先前步骤以扩瞳。备选地，使用盐酸去氧肾上腺素(2.5％)扩瞳。在适当时间之后，迅速地将小鼠置于小鼠台上并且将该台置于裂隙灯的颏托上。打开裂隙灯至最低亮度并且检查扩瞳程度。如果瞳孔未充分扩大(大约2.5-3mm)，则将小鼠返回动物保温室并等待。备选地，施用另一滴托吡卡胺。一旦使眼充分扩瞳，继续进行激光操作。[0172]调节小鼠在小鼠台上的位置，从而它理想地位于观察视神经的位置。在托台上如此摆放小鼠，从而它水平躺卧，垂直于裂隙灯束，头在一侧而尾在另一侧。[0173]略微转动小鼠，从而它处于大约170°度，头部更靠近激光器操作者。[0174]在理想地安置小鼠后，将一滴人工泪液置于25mmx25mm玻璃盖玻片上。将一滴人工泪液置于小鼠的对侧眼上－这将确保眼部补水且有助于延迟白内障形成。[0175]保持盖玻片的角在拇指和食指之间；如此安置，从而将玻璃盖玻片挤在两个手指的指尖之间。将剩余三根手指柔和地围绕动物躯体卷起，以支持及用手稳定。如此安置手，从而玻璃盖玻片可以轻易置于小鼠的眼上。一旦获得稳定位置，则将玻璃盖玻片(人工泪滴仍然黏附)小心地压到小鼠的眼上。确保盖玻片尽可能垂直于激光束安置，旨在防止激光束散射或反射。盖玻片充当隐形眼镜以压扁角膜。透过裂隙灯查看，用空闲手切换焦距至视网膜可以可视化。取决于可视化的位置，视网膜将具有浅黄/浅红色，不同的红色将可见。缓慢并小心地操纵小鼠头部和/或盖玻片直至使视神经可视化。视神经将呈黄色，多根血管从其放射而出。一旦操作者已经确认视神经可视化，则打开对焦激光束。一旦激光束已经打开，则调动对焦激光束至想要的位置(距视神经大约1个视盘直径)。将激光束聚焦在眼底的rpe上。通过获得最鲜明和最清晰的激光束实现恰当的聚焦。如果瞄准束看上去为椭圆或失焦，则切换裂隙灯焦距或重新安置玻璃盖玻片。曾经瞄准束在rpe上聚焦，则使用激光器的脚踏扳机启动激光施用。施用激光后立即留意空泡出现情况。激光照射的轮廓应当清晰且无论如何不应模糊。对全部预期cnv位置(通常围绕视神经在3、6、9和12点位置)重复先前3个步骤。[0176]在记录簿中记录位置及每次激光照射施用的结果及每次对眼所施用照射的结果(成功、模糊、出血等)。确信不使用时激光器置于待机模式。如果需要，使用对侧手稳定和新盖玻片，对小鼠的另一只眼重复先前全部步骤。在施用全部预期激光照射后，关闭激光器和裂隙灯。[0177]放下盖玻片并将小鼠置于保温器上以便从麻醉中复苏。上侧视检眼部任何损伤并且滴一滴人工泪液以保持眼部补水及潜在地防止未来白内障形成。一旦小鼠从麻醉复苏，则返回笼子。[0178]5-1-3.荧光素血管造影术[0179]在摘除角膜和晶状体后，将眼在4％多聚甲醛(electronmicroscopysciences,hatfield,pa)中固定2小时。剖取rpe/脉络膜/巩膜的后视杯，并且取出玻璃体。将视杯在4℃与(alexafluor647或fitc)缀合的同工凝集素b4(1:200,invitrogen,carlsbad,ca)孵育过夜，以标记正在侵袭的脉络膜血管。[0180]5-1-4.血管生成因子的表达[0181]收集细胞并用含有1％tritonx-100的pbs裂解。将等量蛋白质载入sds-page凝胶的各孔并且以100v转移至硝酸纤维素滤膜2小时。将膜用含有1％bsa的pbst(含tween20的磷酸盐缓冲盐水)在室温封闭1小时，并且用抗vegf抗体和抗β肌动蛋白抗体在室温探测1小时。将膜用pbst洗涤三次，随后与第二抗体在室温孵育1小时。用pbst洗涤三次后，检测免疫反应性条。使用imagej软件定量数据。[0182]实施例5-2.结果[0183]scaav2-dx2处理的小鼠减弱激光诱导的脉络膜血管新生。[0184]激光诱导的脉络膜血管新生(cnv)是广泛使用的湿性amd动物模型。在这个模型中，激光用来破坏脉络膜基底层，这引起下方脉络膜血管渗透并长入色素上皮下方的间隙。向5周龄雄性c57bl/6小鼠(n＝12)实施视网膜下注射scaav2-gfp(对照)或scaav2-dx2(第0天)。注射后二十一天，通过激光光凝术产生cnv(第21天)。激光处理后十四天，进行荧光素血管造影术和icg血管造影术(第35天)。次日，处死小鼠并且产生脉络膜铺片(flatmount)并用(fitc)缀合的同工凝集素b4(图7)染色(第36天)。通过荧光素血管造影术在激光诱导的光凝部位处明确观测到新血管形成引起的血管渗漏。icg血管造影术用来采集脉络膜的血管造影片。铺片用来评价清晰界定的同工凝集素阳性cnv的存在和面积。在荧光素血管造影术中与gfp注射对照相比，dx2注射显示血管渗漏减少(图7)。类似地，在icg血管造影术中与注射gfp的小鼠相比，注射dx2的小鼠显示cnv面积减少(图7)。另外，在注射dx2的小鼠中，经同工凝集素-b4染色的脉络膜铺片显示cnv形成面积明显减少(图7)。[0185]通过使用荧光素血管造影术(fa)测量高荧光总面积并使用icga测量cnv面积，估计渗漏面积对cnv面积之比(图8)。与gfp对照中的面积相比，在注射dx2的小鼠中，使用同工凝集素b4染色时脉络膜基底层处平均cnv面积也显著更小(n＝12)(图8)。基于这个结果，dx2在cnv小鼠模型中具有预防效果。[0186]已经在amd病灶附近/内部在组织学上展示炎性细胞尤其(巨噬细胞)，包括脉络膜基底层破坏面积、rpe萎缩和cnv。已经显示cnv病灶中(巨噬细胞)分泌促血管生成因子如vegf和促炎细胞因子如tnf。在图8中，相比gfp对照cnv细胞，注射dx2的小鼠的炎性细胞的数目显著地更少。[0187]过多量的血管内皮生长因子(vegf)触发黄斑下异常血管生长和渗漏，导致不可逆性中心视力减退。在这种情况下，已经做出许多努力以开发靶向vegf以治疗湿性amd的抗血管生成治疗剂。已经显示这些药物减慢amd进展，并且在一些情况下，通过抑制血管生成改进视敏度。此处，我们在激光诱导的脉络膜血管新生小鼠中用dx2事先处理并且与gfp处理的小鼠比较vegf表达(n＝6)(图9)。有趣地，与gfp处理的小鼠相比，dx2处理的小鼠显示表达更少。该数据还在cnv模型小鼠上显示dx2的预防效果。[0188]实施例6.干性amd小鼠模型[0189]材料与方法[0190]6-1.动物实验[0191]对于干性amd小鼠模型实验，mdm1-/-(crispr/cas9ko)小鼠展示出干性amd与遗传性视网膜变性的渐进性感光器和rpe变性。动物圈养在无特定病原体条件和恒定环境条件(21-23℃温度，50-60％湿度和12小时光/暗循环)下动物设施的单独笼中。在3周龄在视网膜下腔进行aav2-dx2和阴性对照(aav2-gfp)注射。在3月龄进行视网膜的组织学测量和功能恢复。[0192]6-2.dx2对干性amd和视网膜变性的治疗效果[0193]使用38g无菌微尖针(incyto,kr)以最大限度减少视网膜伤口，通过经巩膜注射法以4μl体积中的aav2-dx2/aav2-gfp在视网膜下腔注射三周龄mdm1-/-小鼠。将aav2-gfp/dx2注射入相同动物。在os(左眼)注射aav2-gfp。在od(右眼)注射aav2-dx2。[0194]6-2-3.电生理学功能评价[0195]使用三月龄小鼠。为了最终测量，评价wt(n＝11)、mdm1-/-(n＝6),mdm1-/-(aav2+gfp)(n＝6)和mdm1-/-(aav2+dx2)(n＝7)。[0196]对于感光器功能评价用视网膜电图，使用hmserg。用avertin(1％)诱导小鼠发生麻醉并且用3％异氟烷吸入维持麻醉，并且铺上加热垫维持小鼠生理状况。将一滴2％羟丙甲纤维素溶液滴剂置于带线状埋银电极的啮齿类接触镜上，以保持接触角膜并保持其润湿。将小鼠置于76mm直径ganzfeld圆顶下，以使眼部黑暗和均匀照亮。依照iscev扩展的全视野erg标准方案进行测量。使用ergview分析数据并且选择联合的标准视杆与视锥响应值以用闪光强度3000mcd.s/m2,0.10hz分析。对感光细胞功能进行α-波分析。对双极和水平细胞功能进行β波分析。分析α-波和β-波的波幅值和潜伏期值。[0197]6-2-4.组织学测量[0198]全部小鼠在收获erg及其眼球后安乐死。将眼球在4℃于4％pfa中固定过夜。使眼球在30％蔗糖中脱水并且将组织冰冻切片用oct复合物包埋。全部视网膜冰冻切片样品均从含有视神经的10μm厚的切片获得。[0199]分析视网膜冰冻切片。h&e用于层厚度分析。用leicalas程序进行层厚度分析。免疫荧光法用于rpe65和视蛋白表达及增生评价(ki67)。用imagej测量免疫荧光roi设定和重叠系数量值。[0200]6-2-5.统计分析[0201]studentt检验用于初步分析。将p值与mdm1-/-(aav2+dx2)比较。为评价恢复情况，将p值与wt比较。对于完整数据，用ibmspss统计23进行levene方差齐性检验、anova检验和事后(dunnett(t3)，tukeyhsd)评价。[0202]6-2-6.结果[0203]图10显示视网膜的横截面组织学(h&e染色)。[0204]图11a-图11e显示视网膜组织学厚度的组织学量值。图11a显示视网膜厚度。图11b显示rpe(视网膜色素上皮)厚度。图11c显示onl(感光器的外核层)厚度。图11d显示外段厚度。图11e显示opl(外丛状层)厚度。全部样品均从含有视神经的10μm厚的切片获得。视网膜中转染dx2基因导致神经视网膜总厚度恢复(图11a)。dx2的转染显示rpe层(图11b)及感光器外段层(图11c)较厚，提示dx2表达阻止rpe变性及感光器纤毛降解。dx2的转染还显示感光器外核层(图11d)和外丛状层(图11e)较厚，表明dx2表达减少感光器变性。[0205]图12显示rpe(视网膜色素上皮)的完整性和增生。dx2基因的转染通过激活rpe增生，导致rpe完整性恢复。[0206]图13显示pr(感光器)恢复。dx2基因的转染通过激活pr增生，导致pr群体恢复。[0207]图14a-图14b显示rpe和pr的细胞性增生。测量ki67表达以分析rpe层和感光器层中的增生。在aav2-dx2转染的样品中，rpe(图14a)和感光器外段层(图14b)中增生显著地更高。[0208]图15a-图15d显示视网膜功能恢复。aav2-dx2转染显示，与干性amd模型(mdm1-/-)或阴性对照(mdm1-/-+aav-gfp)相比，α-波波幅增加(图15a)且潜伏期缩减(图15b)，这表明dx2表达减少感光器的电生理学功能和视敏度损伤。与干性amd模型(mdm1-/-)相比，aav2-dx2转染的样品不显示β波波幅变化(图15c)，但是潜伏期缩减(图15d)，这表明dx2仅影响rpe和感光器，但不影响双极细胞(后感光神经元(post-photoreceptorsneurons))。[0209]aav2-dx2转染的样品的视网膜电图显示正常erg图形格式的恢复增加(图15a和图15b)。相比干性amd模型(mdm1-/-)，aav2-dx2转染的样品显示α-波波幅略微增加(图15c)且潜伏期缩减(图15d)，这表明dx2表达减少感光器的电生理学功能损伤。相比干性amd模型(mdm1-/-)，aav2-dx2转染的样品不显示b-波波幅变化(图15e)但潜伏期缩减(图15f)。[0210]参考文献[0211]kr10-1067816(2011).[0212]telegina,d.v.,o.s.kozhevnikova和n.g.kolosova.“molecularmechanismsofcelldeathinretinaduringdevelopmentofage-relatedmaculardegeneration(年龄相关的黄斑变性形成期间视网膜中细胞死亡的分子机制).”advancesingerontology7.1(2017):17-24.[0213]hernández-zimbrón,luisfernando等人,“age-relatedmaculardegeneration:newparadigmsfortreatmentandmanagementofamd(年龄相关的黄斑变性：治疗和管理amd的新范式).”oxidativemedicineandcellularlongevity2018(2018).[0214]du,hongjun等人,“jnkinhibitionreducesapoptosisandneovascularizationinamurinemodelofage-relatedmaculardegeneration(jnk抑制在年龄相关的黄斑变性的鼠模型中减少凋亡和血管新生).”proceedingsofthenationalacademyofsciences110.6(2013):2377-2382.[0215]brown等人,endogenousmicrornaregulationsuppressestransgeneexpressioninhematopoieticlineagesandenablesstablegenetransfer(内源微rna调节作用在造血谱系中抑制转基因表达并且使稳定基因转移成为可能),naturemed.12:585-591(2006)。[0216]brown等人,endogenousmicrornacanbroadlyexploitedtoregulatetransggeneexpressionacordingtotissue,lineageanddiffferentiationstate(内源微rna可以广义地用来根据组织、谱系和分化状态调节转基因表达),naturebiotech.25:12457-1467(2007).[0217]前文对具体实施方案的描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，从而通过应用本领域技术人员能力范围内的知识，他人可以轻易地对各种应用进行修改和/或改编，而不脱离本发明的总体构思。因此，基于本文展示的教导和指引，这类改编和修改意在处于所公开实施方案的等同物的意义和范围内。应当理解，本文中的短语或术语旨在描述且并非起到限制作用，从而本说明书的术语或短语应由技术人员根据该教导和指引解读。[0218]本发明的广度和范围不应当受前述示例性实施方案之任一者限制，而应当仅根据以下权利要求及其等同物限定。[0219]本文所述多个方面、实施方案和选项的全体均可以按任意和全部变型组合。[0220]本说明书提到的全部出版物、专利和专利申请均通过引用方式并入本文至相同程度，如同专门且独立地指出通过引用方式并入每份单独出版物、专利和专利申请。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.在有需求的受试者中治疗年龄相关的黄斑疾病(amd)的方法，包括向受试者施用药用有效量的包含外显子2缺失的aimp2变体(aimp2-dx2)基因的重组载体。2.根据权利要求1所述的方法，其中amd是湿性amd。3.根据权利要求1所述的方法，其中amd是干性amd。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中载体还包含mir-142靶序列。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中载体还包含与aimp2-dx2有效连接的启动子。6.根据权利要求5所述的方法，其中启动子是逆转录病毒(ltr)启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、mt启动子、ef-1α启动子、ub6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、cag启动子、rpe65启动子、突触蛋白启动子、mecp2启动子、camkii启动子、hb9启动子或视蛋白启动子。7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其中mir-142靶序列相对于aimp2-dx2基因为3’。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中aimp2-dx2基因包含编码与seq id no:2、13、14、15、16、17、18、19或20至少90％同一的氨基酸序列的核苷酸序列。9.根据权利要求8所述的方法，其中aimp2-dx2基因包含编码seq id no:2、13、14、15、16、17、18、19或20的氨基酸序列的核苷酸序列。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中aimp2-dx2基因不具有包含编码与seq id no:10或11至少90％同一的氨基酸序列的核苷酸序列的外显子。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中aimp2-dx2基因不具有包含编码seq id no:10或11的氨基酸序列的核苷酸序列的外显子。12.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中mir-142靶序列包含acacta。13.根据权利要求4-11所述的方法，其中mir-142靶序列包含acacta和seq id no:5的1-17个额外的连续核苷酸。14.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中mir-142靶序列包含与seq id no:5(tccataaagtaggaaacactaca)的核苷酸序列至少50％同一的核苷酸序列。15.根据权利要求14所述的方法，其中mir-142靶序列包含seq id no:5的核苷酸序列。16.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中mir-142靶序列包含acttta。17.根据权利要求4-11所述的方法，其中mir-142靶序列包含acttta和seq id no:7的1-15个额外的连续核苷酸。18.根据权利要求4-11中任一项所述的方法，其中mir-142靶序列包含与seq id no:7(agtagtgctttctactttatg)的核苷酸序列至少50％同一的核苷酸序列。19.根据权利要求18所述的方法，其中mir-142靶序列包含seq id no:7的核苷酸序列。20.根据权利要求4-19中任一项所述的方法，其中mir-142靶序列重复2-10次。21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中载体是病毒载体。22.根据权利要求21所述的方法，其中病毒载体是腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、人免疫缺陷病毒(hiv)载体、鼠白血病病毒(mlv)载体、禽肉瘤/白血病病毒(aslv)载体、脾坏死病毒(snv)载体、劳斯肉瘤病毒(rsv)载体、小鼠乳腺瘤病毒(mmtv)载体、痘苗病毒载体或单纯疱疹病毒载体。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中将重组载体局部施用至、通过玻璃体内注射施用至、通过结膜下注射施用至或施用入受试者的视网膜下腔中。24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，还包括向受试者施用额外的治疗剂。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述额外的治疗剂是雷珠单抗、阿柏西普或贝伐单抗。

技术总结
本文中公开了治疗年龄相关的黄斑疾病的方法，包括向有需求的受试者施用一种载体，所述载体包含AIMP2-DX2和任选地miR-142的靶序列。列。


技术研发人员：崔镇宇 白京和
受保护的技术使用者：杰内罗蒂股份有限公司
技术研发日：2021.09.30
技术公布日：2023/7/12