一种新型的杂交捕获方法与流程

1.本发明涉及杂交捕获技术领域，具体为一种新型的杂交捕获方法。


背景技术：

2.杂交捕获技术是一种利用抗体检测靶核酸的技术。其原理为靶dna与rna探针杂交(或靶rna与dna探针杂交)形成dna-rna杂合体，此杂合体作为抗原可被抗dna-rna杂合体抗体识别并捕获，进而进行检测。杂交捕获技术不涉及核酸的提取、逆转录和扩增等程序，无需昂贵的pcr扩增仪和单独的核酸扩增实验室，对操作人员的要求也相应的较低。对于杂交捕获技术，目前面临的问题是捕获效率低、捕获的时间较长，因此本领域亟待进行此类的改进。


技术实现要素：

3.本发明所解决的技术问题在于提供一种新型的杂交捕获方法，以解决技术背景中所提到的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种新型的杂交捕获方法，具体包括以下步骤：
4.步骤1、文库杂交捕获：配置溶解试剂，加入到pcr管内，加入浓缩干粉充分混匀，轻离心；
5.步骤2、洗脱液准备和文库与磁珠结合：
6.准备洗脱液；
7.准备捕获磁珠：取50ul捕获磁珠于子弹头内震荡混匀轻离心放铁板上分离磁珠，弃去上清；加100ul的1xbwb，涡旋震荡10s轻离心放铁板上分离磁珠，弃去上清液，重复1次；加50ul的1xbwb液，震荡混匀备用；重悬液50ulbwb放置在磁力架上去掉上清后放入pcr仪中，将pcr杂交液16ul全部转移至无水捕获磁珠管中，震荡充分混匀，放置65℃30min；
8.磁珠热洗以及磁珠冷洗；
9.在冷洗过的磁珠pcr管加入混合试剂后震荡充分混匀，瞬离心；
10.步骤3、磁珠纯化：加50ul1.0
×
磁珠纯化后震荡充分混匀轻离心放置5min；
11.放置磁力架上分离去掉上清，留磁珠，加80％乙醇100ul洗涤，轻轻旋转180度让磁珠吸附到pcr管相对面，待澄清分离去掉上清液，瞬离心去底部残液，放置3min让乙醇挥发掉；
12.加去离子水26ul，震荡充分混匀瞬离心放置5min，转移至新ep管内。
13.优选地，所述步骤1中溶解试剂由体积比为5:1:1:1的hyb buffer、enhancer、超纯水、lxp probe混合而成。
14.优选地，所述步骤2中磁珠热洗具体内容为：将1
×
w1、1
×
s-w 2管放入65℃pcr仪中温浴；
15.一洗：w1加入捕获磁珠管中使用移液枪吹打10～15次，放置磁力架快速分离磁珠，弃去上清液，放入pcr仪；
16.二洗：s-w加入磁珠管缓慢吹打15次、避免气泡，进行温浴并准确计时：65℃5min，放入磁力架快速分离，弃去上清液；
17.三洗：s-w加入磁珠管缓慢吹打15次、避免气泡，进行温浴并准确计时：65℃5min，放入磁力架快速分离，弃去上清液。
18.优选地，所述步骤2中磁珠冷洗具体内容为：一洗：150ul w1加入磁珠管涡旋震荡2min，轻离心，放置磁力架上分离去上清；
19.二洗：150ulw2150u加入磁珠管涡旋震荡1min，轻离心，放置磁力架上分离去上清；
20.三洗：150ulw3加入磁珠管吹打15次后转入新的pcr管中，再放置磁力架上分离去上清，瞬离心，去掉底部残液，磁珠放置3min置干。
21.优选地，所述步骤2中混合试剂由体积比为2:25:23的primer5/primer 7、2
×
hifi pcr mix、超纯水混合而成。
22.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本方法可以提高现有手工的捕获效率；可以缩短捕获的时间；减少人力成本。
具体实施方式
23.为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，及进行非创造性的扩展而得出的其它结论，都属于本发明保护的范围。
24.实施例
25.一种新型的杂交捕获方法，具体包括以下步骤：
26.取10ulhyb buffer、2ulenhancer、2ul超纯水、2ullxp probe混合配置溶解试剂，加入到pcr管内，加入浓缩干粉充分混匀，轻离心；
27.步骤2、洗脱液准备和文库与磁珠结合：
28.如表1所示准备洗脱液：
29.表1
30.名称原液(ul)+水(ul)1
×
应用液(ul)2
×
bwb14014028010
×
w13027030010
×
w21614416010
×
w31614416010
×
s-w32288320
31.准备捕获磁珠：取50ul捕获磁珠于子弹头内震荡混匀轻离心放铁板上分离磁珠，弃去上清；加100ul的1xbwb，涡旋震荡10s轻离心放铁板上分离磁珠，弃去上清液，重复1次；加50ul的1xbwb液，震荡混匀备用；重悬液50ulbwb放置在磁力架上去掉上清后放入pcr仪中，将pcr杂交液16ul全部转移至无水捕获磁珠管中，震荡充分混匀，放置65℃30min；
32.磁珠热洗：将1
×
w1、1
×
s-w 2管放入65℃pcr仪中温浴；
33.一洗：w1加入捕获磁珠管中使用移液枪吹打10～15次，放置磁力架快速分离磁珠，
弃去上清液，放入pcr仪；
34.二洗：s-w加入磁珠管缓慢吹打15次、避免气泡，进行温浴并准确计时：65℃5min，放入磁力架快速分离，弃去上清液；
35.三洗：s-w加入磁珠管缓慢吹打15次、避免气泡，进行温浴并准确计时：65℃5min，放入磁力架快速分离，弃去上清液。
36.磁珠冷洗：一洗：150ul w1加入磁珠管涡旋震荡2min，轻离心，放置磁力架上分离去上清；
37.二洗：150ulw2150u加入磁珠管涡旋震荡1min，轻离心，放置磁力架上分离去上清；
38.三洗：150ulw3加入磁珠管吹打15次后转入新的pcr管中，再放置磁力架上分离去上清，瞬离心，去掉底部残液，磁珠放置3min置干。
39.在冷洗过的磁珠pcr管加入混合试剂后震荡充分混匀，瞬离心，其中pcr仪条件如表2所示(热盖105℃)：
40.表2
[0041][0042]
磁珠纯化：加50ul1.0
×
磁珠纯化后震荡充分混匀轻离心放置5min；
[0043]
放置磁力架上分离去掉上清，留磁珠，加80％乙醇100ul洗涤，轻轻旋转180度让磁珠吸附到pcr管相对面，待澄清分离去掉上清液，瞬离心去底部残液，放置3min让乙醇挥发掉；
[0044]
加去离子水26ul，震荡充分混匀瞬离心放置5min，转移至新ep管内。
[0045]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：
1.一种新型的杂交捕获方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤1、文库杂交捕获：配置溶解试剂，加入到pcr管内，加入浓缩干粉充分混匀，轻离心；步骤2、洗脱液准备和文库与磁珠结合：准备洗脱液；准备捕获磁珠：取50ul捕获磁珠于子弹头内震荡混匀轻离心放铁板上分离磁珠，弃去上清；加100ul的1xbwb，涡旋震荡10s轻离心放铁板上分离磁珠，弃去上清液，重复1次；加50ul的1xbwb液，震荡混匀备用；重悬液50ulbwb放置在磁力架上去掉上清后放入pcr仪中，将pcr杂交液16ul全部转移至无水捕获磁珠管中，震荡充分混匀，放置65℃30min；磁珠热洗以及磁珠冷洗；在冷洗过的磁珠pcr管加入混合试剂后震荡充分混匀，瞬离心；步骤3、磁珠纯化：加50ul1.0
×
磁珠纯化后震荡充分混匀轻离心放置5min；放置磁力架上分离去掉上清，留磁珠，加80％乙醇100ul洗涤，轻轻旋转180度让磁珠吸附到pcr管相对面，待澄清分离去掉上清液，瞬离心去底部残液，放置3min让乙醇挥发掉；加去离子水26ul，震荡充分混匀瞬离心放置5min，转移至新ep管内。2.根据权利要求1所述的一种新型的杂交捕获方法，其特征在于：所述步骤1中溶解试剂由体积比为5:1:1:1的hybbuffer、enhancer、超纯水、lxpprobe混合而成。3.根据权利要求1所述的一种新型的杂交捕获方法，其特征在于：所述步骤2中磁珠热洗具体内容为：将1
×
w1、1
×
s-w2管放入65℃pcr仪中温浴；一洗：w1加入捕获磁珠管中使用移液枪吹打10～15次，放置磁力架快速分离磁珠，弃去上清液，放入pcr仪；二洗：s-w加入磁珠管缓慢吹打15次、避免气泡，进行温浴并准确计时：65℃5min，放入磁力架快速分离，弃去上清液；三洗：s-w加入磁珠管缓慢吹打15次、避免气泡，进行温浴并准确计时：65℃5min，放入磁力架快速分离，弃去上清液。4.根据权利要求1所述的一种新型的杂交捕获方法，其特征在于：所述步骤2中磁珠冷洗具体内容为：一洗：150ulw1加入磁珠管涡旋震荡2min，轻离心，放置磁力架上分离去上清；二洗：150ulw2150u加入磁珠管涡旋震荡1min，轻离心，放置磁力架上分离去上清；三洗：150ulw3加入磁珠管吹打15次后转入新的pcr管中，再放置磁力架上分离去上清，瞬离心，去掉底部残液，磁珠放置3min置干。5.根据权利要求1所述的一种新型的杂交捕获方法，其特征在于：所述步骤2中混合试剂由体积比为2:25:23的primer5/primer7、2
×
hifipcrmix、超纯水混合而成。

技术总结
本发明提供了一种新型的杂交捕获方法，包括：配置溶解试剂，加入到PCR管内，加入浓缩干粉充分混匀，轻离心；洗脱液准备和文库与磁珠结合；磁珠纯化：加50ul1.0


技术研发人员：刘骁 王海波 贾志臣 胡太开 金斌 郭品 苏开凤 黄小敏
受保护的技术使用者：嘉兴金弗康生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/7/12