低内毒素大肠杆菌及低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌的制作方法

1.本发明涉及一种低内毒素大肠杆菌及低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌，属于蛋白表达技术领域。


背景技术：

2.胶原蛋白是人体及其他哺乳动物中最丰富的蛋白质，约占人体总蛋白的30％，目前已知的胶原蛋白家族多达30种。胶原蛋白由其三螺旋结构和独特的g x y重复序列组成，其中x通常是脯氨酸，而y通常是羟脯氨酸(hyp)。y位置的羟脯氨酸稳定了胶原的三螺旋结构，在胶原结构中极其重要。
3.革兰氏阴性菌释放的内毒素是来自生物过程的蛋白质溶液的常见污染。脂多糖(lps)是革兰氏阴性细菌的细胞壁成分，有助于细菌毒性。在细胞分裂、外膜囊泡脱落或细菌细胞死亡等过程中，lps被释放到周围介质中。如果这种污染进入血液，就会引发促炎免疫反应，严重的会导致感染性休克甚至死亡。因此去除它们对于安全的肠外给药至关重要。所有革兰氏阴性菌株的lps结构都高度有序，并符合基本的三单元组成：o抗原、核心寡糖和脂质a，其中脂质a负责革兰氏阴性细菌的毒性。然而，lps直到它通过脱落外膜囊泡从细菌膜释放或细胞分裂、裂解或死亡才能诱导促炎反应。免疫系统不能识别脂质a单位，而它仍然嵌入在细菌膜。一旦lps从革兰氏阴性菌的细胞壁释放出来，脂质a最终可以与宿主识别受体(即tlr4-md2)相互作用，诱导促炎反应并引发毒性。
4.在大肠杆菌中，脂多糖合成途径是一个由多种酶共同参与的催化反应过程。其结构中lipida-kdo2部分的合成始于udp-n-乙酰基葡萄糖胺(udp-glcnac)分子，在udp-glcnac乙酰基转移酶lpxa的作用下将一条β-羟基肉豆蔲酸酯(β-hydroxymyristate)添加至其3-羟基位，生成udp-3-o-(acy)-glcnac分子。该分子先由一种含锌的金属蛋白酶lpxc进行去乙酰化，脱去其氨基上的乙酰基，再由lpxd酶添加另一条β-羟基肉豆蔲酸酯，生成udp-2,3-diacylglucosamine分子。随后，在焦磷酸酶lpxh的催化下udp-2,3-diacylglucosamine中的焦磷酸键被切开而生成2,3-diacylglucosamine-1-phosphate分子，该分子通常被称为lipidx。在二糖合酶lpx b的作用下，lipid x分子与udp-2,3-diacylglucosamine分子发生缩合反应，形成lipid a的初始骨架，包含两个葡糖胺、四条β-羟基肉豆蔻酸酯以及一个磷酸基团。接着磷酸激酶lpx k对lipid a初始骨架中不含磷酸基团的葡糖胺进行磷酸化修饰，使得其4'-位添加一个新的磷酸基团，生成的分子通常被称为lipid iva。在大肠杆菌中kdo基团是从d-核酮糖5-磷酸(d-ribulose 5-phosphate)分子起始合成的，在异构酶(isomerase)kdsd或gutq的催化作用下形成d-阿拉伯糖5-磷酸(a5p)。再经过kdaa(kdo-8磷酸合酶)、kdsc(kdo-8磷酸磷酸酶)以及kdsb或kpsu(cmp-kdo合酶)的作用下生成cmp-kdo分子。waaa酶是一种双功能酶，又被称为kdta，在其催化下以cmp-kdo分子为底物，两个kdo基团被添加至lipid iva分子中的葡萄糖胺6'位。在此基础上，再由月桂酰基转移酶lpxl以及肉豆蔻酰基转移酶lpxm分别引入两条分别含有十二碳和十四碳的脂
肪酸链。最终形成的分子即为kdo2-lipid a。研究表明，lipid a发生侧链缺失会使lps表现出不同的生物学活性，如缺失lipid a生物合成途径中的lpxm可使其缺失一条豆蔻酰化侧链，同时体内外诱导细胞因子和内毒素反应的能力大大降低；而lpxl、lpxm、pagp、lpxp和epta同时敲除后，可产生缺失2条侧链的lipid iva，该结构不会引发人的任何内毒素反应，而且该突变株也是目前报道过的lipid a缺失侧链最多且能够正常存活的e.coli菌株。
5.在天然胶原蛋白提取制备过程中，若对内毒素的去除不彻底，会降低胶原蛋白材料的品质，限制胶原蛋白材料在生物医学领域的应用。目前工业上使用的天然胶原蛋白主要是通过酸、碱或者酶法提取动物的皮肤或骨骼中的胶原蛋白，其主要来源为动物结缔组织。但从动物组织中提取的胶原蛋白存在动物源疾病等风险，同时大规模的制备对供给侧的动物饲养造成巨大的压力。为了使提取获得的胶原蛋白符合医药应用标准，必须将提取获得的胶原蛋白中的内毒素含量降低到0.5eu/ml以下。常用于去除内毒素的方法主要包括阴离子交换色谱法、亲和色谱法、分子筛法、液相分离法、吸附法、蒸馏法等。上述的这些方法虽然都能以不同的程度去除重组蛋白中残留的内毒素，但仍然存在效率低、分离纯化成本高、特异性不好或是使用的分离试剂具有毒性不易去除等问题。


技术实现要素：

6.本发明利用基因重组改造菌株的技术思路，可以构建得到内毒素表达量很低的大肠杆菌，可作为表达各种蛋白的底盘菌，并且利用该思路表达得到了低内毒素重组人源胶原蛋白。
7.本发明采用的技术方案：
8.一种构建低内毒素大肠杆菌的方法，其特征在于敲除大肠杆菌中脂多糖合成的相关基因，所述脂多糖合成的相关基因是如下基因至少一种：lpxa基因、lpxb基因、lpxc基因、lpxd基因、lpxh基因、lpxk基因、lpxp基因、lpxl基因、lpxm基因、msba基因、wzx基因、wzy基因、waaa基因、waag基因、pagp基因、epta基因、kdsd基因、gutq基因、kdta基因、waal基因、waaf基因和waac基因。
9.优选的，所述脂多糖合成的相关基因是以下基因组合中的一种：
10.lpxl和lpxm；
11.lpxl、lpxm和epta；
12.lpxl、lpxm和pagp；
13.lpxl、lpxm和kdsd；
14.lpxl、lpxm和gutq；
15.lpxl、lpxm、kdsd和gutq；
16.lpxl、lpxm、pagp和gutq；
17.lpxl、lpxm、pagp和kdsd；
18.lpxl、lpxm、epta和gutq；
19.lpxl、lpxm、epta和kdsd；
20.lpxl、lpxm、epta和pagp；
21.lpxl、lpxm、pagp、kdsd和gutq；
22.lpxl、lpxm、epta、kdsd和gutq；
23.lpxl、lpxm、epta、pagp和gutq；
24.lpxl、lpxm、epta、pagp和kdsd；
25.lpxl、lpxm、epta、pagp、kdsd和gutq。
26.本发明还公开了一种低内毒素大肠杆菌，其特征在于敲除了脂多糖合成的相关基因，所述脂多糖合成的相关基因是如下基因至少一种：lpxa基因、lpxb基因、lpxc基因、lpxd基因、lpxh基因、lpxk基因、lpxp基因、lpxl基因、lpxm基因、msba基因、wzx基因、wzy基因、waaa基因、waag基因、pagp基因、epta基因、kdsd基因、gutq基因、kdta基因、waal基因、waaf基因和waac基因。
27.优选的，所述脂多糖合成的相关基因是以下基因组合中的一种：
28.lpxl和lpxm；
29.lpxl、lpxm和epta；
30.lpxl、lpxm和pagp；
31.lpxl、lpxm和kdsd；
32.lpxl、lpxm和gutq；
33.lpxl、lpxm、kdsd和gutq；
34.lpxl、lpxm、pagp和gutq；
35.lpxl、lpxm、pagp和kdsd；
36.lpxl、lpxm、epta和gutq；
37.lpxl、lpxm、epta和kdsd；
38.lpxl、lpxm、epta和pagp；
39.lpxl、lpxm、pagp、kdsd和gutq；
40.lpxl、lpxm、epta、kdsd和gutq；
41.lpxl、lpxm、epta、pagp和gutq；
42.lpxl、lpxm、epta、pagp和kdsd；
43.lpxl、lpxm、epta、pagp、kdsd和gutq。
44.本发明还公开了上述的低内毒素大肠杆菌在加工成表达低内毒素型蛋白的宿主菌中的应用。
45.一种低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌，为在上述的低内毒素大肠杆菌中转化表达人源胶原蛋白的表达载体而成。
46.优选的，所述人源胶原蛋白为人源i型胶原蛋白、人源ii型胶原蛋白或人源iii型胶原蛋白，上述i型胶原蛋白的ncbi登记号为ncbi:nm_000088.4；ii型胶原蛋白的ncbi登记号为nm_033150.2；iii型胶原蛋白的ncbi登记号为nm_000090.4。
47.优选的，所述表达载体为pseva321载体。
48.本发明还公开了上述的低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌在制备低内毒素人源胶原蛋白中的应用。
49.本发明的有益效果：
50.本发明利用基因重组改造菌株生产低内毒素重组人源胶原蛋白的技术思路，得到的大肠杆菌由于敲除了脂多糖合成的相关基因，抑制了脂多糖的合成通路，从而降低了重组人源胶原蛋白的内毒素含量，进而直接减少原生产的化学工艺流程中酸解和碱解的步
骤，提高产品纯度和产率，显著降低生产成本，从而合成出廉价、高效的低内毒素重组人源胶原蛋白。本发明的大肠杆菌也可用于表达其他适合大肠杆菌表达的蛋白。
附图说明
51.图1为i型胶原的表达质粒图谱。
52.图2为ii型胶原的表达质粒图谱。
53.图3为iii型胶原的表达质粒图谱。
具体实施方式
54.以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
55.实施例1.脂多糖合成基因敲除菌株的构建
56.步骤一、脂多糖合成基因的确定
57.本发明涉及到的脂多糖合成相关基因可为但不限于如下基因中至少一种：lpxa基因ncbi登记号:49775083；lpxb基因ncbi登记号:944838；lpxc基因ncbi登记号:913579；lpxd基因ncbi登记号:944882；lpxh基因ncbi登记号:1027739；lpxk基因ncbi登记号:945526；lpxp基因ncbi登记号:915640；lpxl基因ncbi登记号:912457；lpxm基因ncbi登记号:945143；msba基因ncbi登记号:917742；wzx基因ncbi登记号:qzi62780.1；wzy基因ncbi登记号:58390428；waaa基因ncbi登记号:915541；waag基因ncbi登记号:915543；pagp基因ncbi登记号:946360；epta基因ncbi登记号:948629；kdsd基因ncbi登记号:947734；gutq基因ncbi登记号:914714；bl21δlpxp基因ncbi登记号：946847；kdta基因ncbi登记号:949048、waal基因ncbi登记号:948148、waaf基因ncbi登记号:948135和waac基因ncbi登记号：948136。
58.步骤二、敲除脂多糖合成基因重组菌的构建
59.敲除脂多糖合成相关基因的重组菌构建过程，具体包括以下步骤：
60.(1)通过pcr方法构建含安普霉素抗性基因(apr)的打靶片段，构建方法为：
61.首先以大肠杆菌基因组为模板pcr扩增lpxa基因n端和c端同源臂均约350bp，其次以质粒pij773为模版，pcr扩增apr抗性盒，约1.4kb，最后通过重叠pcr将lpxa基因n端同源臂，apr抗性盒，c端同源壁连接起来，构建出左端为lpxa基因n端同源臂，中间为安普霉素抗性基因，右端为lpxa基因c端同源臂的打靶片段，约2.1kb。
62.(2)用氯化钙法将大肠杆菌bl21制成感受态细胞，将表达red重组酶的质粒pkd46转入感受态细胞中，在含氨苄青霉素100ug/ml的lb固体平板上培养，筛选转化子。将筛选出的转化子表示为大肠杆菌bl21/pkd46。
63.(3)挑取大肠杆菌bl21/pkd46单菌落接种于新鲜的lb培养基(含100ug/ml氨苄青霉素)中，30℃震荡培养12h，转接于50ml新鲜的lb培养基中，继续培养2h，加入l-阿拉伯糖诱导质粒pkd46表达重组酶，终浓度为10mmol/l，继续培养至od600＝0.5～0.6，将菌液置于
冰浴中15～20min，然后4℃，5000rpm离心10min，用灭菌的10％甘油洗涤菌体3次,将菌体重悬于0.5ml甘油中，即制成了电转感受态细胞。
64.(4)电击转化：将(1)中由pcr方法制得的打靶片段10～100ng与100ul感受态细胞混匀，转入已预冷的0.1cm的btx电击杯中，进行电击，电击条件为：电阻200ω，频率25uf，电压1.8kv，电击时间为4～5ms。电击完成后迅速加入900ul冰冷的lb培养基，30℃培养1h，移取100ul涂布于含有氨苄青霉素和安普霉素的lb平板上，30℃培养，筛选阳性转化子。通过菌落pcr技术鉴定阳性转化子，并测序鉴定，将鉴定为阳性的转化子表示为大肠杆菌bl21δlpxa∷apr/pkd46。
65.(5)消除质粒pkd46：因为质粒pkd46为温度敏感性质粒，所以可以通过高温培养将pkd46质粒消除。将(4)中得到的阳性转化子e.coli bl21δlpxa∷apr/pkd46接种于lb培养基中，42℃培养2h后，在37℃下划线分离培养，对每个单菌落进行氨苄青霉素和安普霉素抗性检测，挑选对氨苄青霉素敏感而对安普霉素具有抗性的克隆，得到消除pkd46的菌株，表示为大肠杆菌bl21δlpxa∷apr。
66.(6)安普霉素抗性基因的去除：将质粒pcp20转入菌株大肠杆菌bl21δlpxa∷apr中，含有氯霉素(25μg/ml)抗性平板30℃培养24h，挑取单菌落接种于lb平板42℃过夜培养，pcp20在42℃下诱导表达flp内切酶从而将frt位点间的抗性基因从基因组上切除掉，利用验证引物进行菌落pcr鉴定，并测序鉴定，阳性片段仅为同源臂大小，说明安普霉素抗性基因已成功消除，此时的菌株表示为大肠杆菌bl21δlpxa。
67.(7)用同样的方法构建其他脂多糖合成相关基因的重组菌，分别表示为大肠杆菌bl21δlpxb；大肠杆菌bl21δlpxc；大肠杆菌bl21δlpxd；大肠杆菌bl21δlpxh；大肠杆菌bl21δlpxk；大肠杆菌bl21δlpxl；大肠杆菌bl21δlpxp；大肠杆菌bl21δlpxm；大肠杆菌bl21δmsba；大肠杆菌bl21δwzx；大肠杆菌bl21δwzy；大肠杆菌bl21δwaaa；大肠杆菌bl21δwaag；大肠杆菌bl21δlpta；大肠杆菌bl21δlptb；大肠杆菌bl21δlptc；大肠杆菌bl21δlptd；大肠杆菌bl21δlpte；大肠杆菌bl21δlptf；大肠杆菌bl21δptg；大肠杆菌bl21δpagp；大肠杆菌bl21δepta；大肠杆菌bl21δkdsd；大肠杆菌bl21δgutq；大肠杆菌bl21δkdta；大肠杆菌bl21δwaal；大肠杆菌bl21δwaaf和大肠杆菌bl21δwaac。
68.(8)内毒素检测实验
69.采用动态浊度法测定细胞裂解液上清液中lps的浓度，所用试剂为厦门百远达科技有限公司采购的鲎试剂。上述重组菌株发酵后，上清液用无内毒素水稀释。将冻干的内毒素标准原液重新配制并稀释至最终浓度为10、1、0.1、0.05和0.01eu ml-1。所有样品、标准品和阴性对照一式两份放入96孔板(无发热源)的孔中。每孔加入100ul tal试剂，培养皿在37℃的biotek elx808读取器(biotek instruments,inc.)中孵育2小时。使用动力学分析程序测量内毒素水平，并使用gen5
tm
数据分析软件(biotek instruments,inc.)计算。内毒素含量如表1所示。
70.表1敲除脂多糖合成单个基因的重组菌的内毒素含量表
71.菌株名称内毒素含量(eu/ml)内毒素变化escherichiacolibl215.94*108————escherichiacolibl21::δlpxl8.19*107与出发菌比下降86％escherichiacolibl21::δlpxm4.58*108与出发菌比下降30％
escherichiacolibl21::δepta4.51*108与出发菌比下降24％escherichiacolibl21::δpagp4.75*108与出发菌比下降20％escherichiacolibl21::δlpxp6.59*108与出发菌比增加11％escherichiacolibl21::δkdsd4.87*108与出发菌比下降18％escherichiacolibl21::δgutq4.16*108与出发菌比下降30％escherichiacolibl21::δkdta5.76*108与出发菌比下降3％escherichiacolibl21::δlpxa5.52*108与出发菌比下降7％escherichiacolibl21::δlpxb5.58*108与出发菌比下降9％escherichiacolibl21::δlpxc5.82*108与出发菌比下降2％escherichiacolibl21::δlpxd5.76*108与出发菌比下降3％escherichiacolibl21::δlpxh5.82*108与出发菌比下降2％escherichiacolibl21::δlpxk5.82*108与出发菌比下降2％escherichiacolibl21::δmsba5.46*108与出发菌比下降8％escherichiacolibl21::δwzx5.4*108与出发菌比下降9％escherichiacolibl21::δwzy5.7*108与出发菌比下降4％escherichiacolibl21::δwaaa5.76*108与出发菌比下降3％escherichiacolibl21::waag5.46*108与出发菌比下降8％escherichiacolibl21::waac5.76*108与出发菌比下降3％escherichiacolibl21::waaf5.64*108与出发菌比下降5％escherichiacolibl21::waal5.58*108与出发菌比下降6％
72.由表中数据可得知，在以上重组菌株中，lpxl基因、lpxm基因、epta基因、pagp基因、kdsd基因、gutq基因在单敲除后内毒素含量与出发菌escherichia coli bl21相比有较为明显的下降，分别降低了86％、30％、24％、20％、18％、30％。
73.步骤三、多基因敲除菌株菌株的构建
74.(1)构建多基因敲除重组菌株
75.为进一步寻求产生更低内毒素含量的重组菌株，选择上述内毒素降低明显的6个基因进行组合敲除，lpxl、lpxm两个基因密切相关，已有过多次敲除的报道(wang et al.,2021)，因此，将lpxl、lpxm两个基因绑定与其他基因进行组合敲除。
76.在复合敲除lpxl与lpxm时，采用同步骤二中的方法，将lpxm基因打靶片段导入大肠杆菌bl21δlpxl感受态细胞中，最终获得重组菌株大肠杆菌bl21δlpxlδlpxm。用同样的方法获得其他基因组合敲除后的重组菌株。
77.(2)内毒素检测实验
78.采用动态浊度法测定细胞裂解液上清液中lps的浓度，所用试剂为厦门百远达科技有限公司采购的鲎试剂。上述重组菌株发酵后，上清液用无内毒素水稀释。将冻干的内毒素标准原液重新配制并稀释至最终浓度为10、1、0.1、0.05和0.01eu ml-1。所有样品、标准品和阴性对照一式两份放入96孔板(无发热源)的孔中。每孔加入100ul tal试剂，培养皿在37℃的biotek elx808读取器(biotek instruments,inc.)中孵育2小时。使用动力学分析程序测量内毒素水平，并使用gen5
tm
数据分析软件(biotek instruments,inc.)计算。内毒素含量如表2所示。
79.表2敲除脂多糖合成基因组合的重组菌的内毒素含量表
[0080][0081]
由表2中数据可得知，表2中的组合基因敲除重组菌株均可作为宿主菌来生产各种适合大肠杆菌表达的蛋白。其中组合基因敲除重组菌株escherichia coli bl21::δlpxlδlpxmδeptaδpagpδkdsdδgutq内毒素含量最低，分别达到了4.61*106eu/ml。下面选用该种重组菌株作为宿主生产人源胶原蛋白。
[0082]
实施例2.利用低内毒素重组菌株生产重组人源胶原蛋白
[0083]
低内毒素重组人源胶原蛋白的诱导表达过程，具体包括以下步骤：
[0084]
步骤一、胶原蛋白合成质粒及重组菌株的构建
[0085]
(1)根据ncbi上公布的人类全基因组序列，经生物信息学分析获得人源胶原蛋白基因的dna序列，将人源iii型胶原蛋白基因片断col3a1(ncbi:nm_000090.4)克隆到质粒pseva321中，得到重组质粒pseva321-col3a1，再转化到实施例二中筛选得到的低内毒素大肠杆菌菌株中，得到escherichia coli bl21::δlpxlδlpxmδepta δpagpδkdsdδgutq/pseva321-col3a1。采用上述菌株和对照菌株制备重组人源iii型胶原蛋白。
[0086]
(2)用同样的方法得到重组人源i型胶原蛋白(ncbi:nm_000088.4)和ii型胶原蛋白(ncbi:nm_033150.2)合成质粒以及低内毒素突变菌株，具体质粒如图1-3所示。
[0087]
步骤二、低内毒素重组菌株生产胶原蛋白的内毒素检测
[0088]
(1)种子液准备：在超净工作台挑取实施例1中转化平板上单菌落接种于10ml的lb液体培养基中，于37℃、220rpm恒温摇床培养10～12h作为种子液。
[0089]
(2)发酵及诱导
[0090]
将上述种子液按体积比1:100转接于3个装液量为200ml培养基/1000ml摇瓶，置于37℃、220rpm恒温摇床培养3～4h，菌液od600值在0.6～0.8时分别加入终浓度为0.1mm的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，诱导胶原蛋白表达，继续培养5h。诱导结束后，于4℃条件下12000g离心30min，收集得到菌体。测内毒素。
[0091]
(3)内毒素检测实验
[0092]
采用动态浊度法测定细胞裂解液上清液中lps的浓度，所用试剂为厦门百远达科技有限公司采购的鲎试剂。上述重组菌株发酵后，上清液用无内毒素水稀释。将冻干的内毒素标准原液重新配制并稀释至最终浓度为10、1、0.1、0.05和0.01eu ml-1。所有样品、标准品和阴性对照一式两份放入96孔板(无发热源)的孔中。每孔加入100ul tal试剂，培养皿在37℃的biotek elx808读取器(biotek instruments,inc.)中孵育2小时。使用动力学分析程序测量内毒素水平，并使用gen5tm数据分析软件(biotek instruments,inc.)计算。内毒素含量如表3所示。
[0093]
表3组合基因敲除重组菌株生产的胶原蛋白内毒素含量变化表
[0094][0095][0096]
由表3中数据可得知，利用组合基因敲除重组菌株escherichia coli bl21::δlpxlδlpxmδeptaδpagpδkdsdδgutq生产的各类型胶原蛋白内毒素比出发菌株生产各类型胶原蛋白内毒素都能明显的降低内毒素。因此，这种重组菌株可以作为宿主生产的人源胶原蛋白的优良底盘。

技术特征：
1.一种构建低内毒素大肠杆菌的方法，其特征在于敲除大肠杆菌中脂多糖合成的相关基因，所述脂多糖合成的相关基因是如下基因至少一种：lpxa基因、lpxb基因、lpxc基因、lpxd基因、lpxh基因、lpxk基因、lpxp基因、lpxl基因、lpxm基因、msba基因、wzx基因、wzy基因、waaa基因、waag基因、pagp基因、epta基因、kdsd基因、gutq基因、kdta基因、waal基因、waaf基因和waac基因。2.根据权利要求1所述的构建低内毒素大肠杆菌的方法，其特征在于所述脂多糖合成的相关基因是以下基因组合中的一种：lpxl和lpxm；lpxl、lpxm和epta；lpxl、lpxm和pagp；lpxl、lpxm和kdsd；lpxl、lpxm和gutq；lpxl、lpxm、kdsd和gutq；lpxl、lpxm、pagp和gutq；lpxl、lpxm、pagp和kdsd；lpxl、lpxm、epta和gutq；lpxl、lpxm、epta和kdsd；lpxl、lpxm、epta和pagp；lpxl、lpxm、pagp、kdsd和gutq；lpxl、lpxm、epta、kdsd和gutq；lpxl、lpxm、epta、pagp和gutq；lpxl、lpxm、epta、pagp和kdsd；lpxl、lpxm、epta、pagp、kdsd和gutq。3.一种低内毒素大肠杆菌，其特征在于敲除了脂多糖合成的相关基因，所述脂多糖合成的相关基因是如下基因至少一种：lpxa基因、lpxb基因、lpxc基因、lpxd基因、lpxh基因、lpxk基因、lpxp基因、lpxl基因、lpxm基因、msba基因、wzx基因、wzy基因、waaa基因、waag基因、pagp基因、epta基因、kdsd基因、gutq基因、kdta基因、waal基因、waaf基因和waac基因。4.根据权利要求3所述的低内毒素大肠杆菌，其特征在于所述脂多糖合成的相关基因是以下基因组合中的一种：lpxl和lpxm；lpxl、lpxm和epta；lpxl、lpxm和pagp；lpxl、lpxm和kdsd；lpxl、lpxm和gutq；lpxl、lpxm、kdsd和gutq；lpxl、lpxm、pagp和gutq；lpxl、lpxm、pagp和kdsd；lpxl、lpxm、epta和gutq；lpxl、lpxm、epta和kdsd；
lpxl、lpxm、epta和pagp；lpxl、lpxm、pagp、kdsd和gutq；lpxl、lpxm、epta、kdsd和gutq；lpxl、lpxm、epta、pagp和gutq；lpxl、lpxm、epta、pagp和kdsd；lpxl、lpxm、epta、pagp、kdsd和gutq。5.权利要求3或4所述的低内毒素大肠杆菌在作为表达低内毒素型蛋白的宿主菌中的应用。6.一种低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌，其特征在于：为在权利要求3或4所述的低内毒素大肠杆菌中转化表达人源胶原蛋白的表达载体而成。7.根据权利要求6所述的低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述人源胶原蛋白为人源i型胶原蛋白、人源ii型胶原蛋白或人源iii型胶原蛋白。8.根据权利要求6或7所述的低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述表达载体为pseva321载体。9.权利要求6-8中任一项所述的低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌在制备低内毒素人源胶原蛋白中的应用。

技术总结
本发明公开了一种构建低内毒素大肠杆菌的方法，其特征在于敲除大肠杆菌中脂多糖合成的相关基因。还公开了相应的低内毒素大肠杆菌、其在作为表达低内毒素型蛋白的宿主菌中的应用，以及相应的低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌。本发明利用基因重组改造菌株生产低内毒素重组人源胶原蛋白的技术思路，得到的大肠杆菌由于敲除了脂多糖合成的相关基因，抑制了脂多糖的合成通路，从而降低了重组人源胶原蛋白的内毒素含量，进而直接减少原生产的化学工艺流程中酸解和碱解的步骤，提高产品纯度和产率，显著降低生产成本，从而合成出廉价、高效的低内毒素重组人源胶原蛋白。本发明的大肠杆菌也可用于表达其他适合大肠杆菌表达的蛋白。蛋白。蛋白。


技术研发人员：田江杰 王晶晶 张丽娟
受保护的技术使用者：广州普言生物科技有限公司
技术研发日：2023.03.02
技术公布日：2023/7/12