基于UHPLC-QExactiveFocusMS/MS的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法与流程

基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法
技术领域
1.本发明涉及中药化学成分的分析方法，特别是基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法。


背景技术：

2.益肺解毒颗粒由“玉屏风散”和“银翘解毒散”等经典名方化裁而成，由黄芪、金银花、炒白术、连翘、防风、炙百合、石斛、桔梗、芦根、白茅根、甘草共11味中药组成，具有益气固表，解毒生津之功效，用于治疗新型冠状病毒肺炎轻症的中药制剂，方中君药黄芪健脾益气、固表止汗，金银花清热解毒、疏表透邪，两药合用体现了“扶正祛邪”“培土生金”“给邪以出路”的组方原则；炒白术健脾益气，连翘清热解毒，防风解表祛风，炙百合养阴益肺，石斛益胃生津，桔梗宣肺利咽、祛痰排脓共为臣药；芦根、白茅根2味共为佐药，发挥清肺解毒化湿降浊而不伤阴之效；甘草为使药，发挥清热解毒、调和诸药的作用。方中11味药皆以“轻清宣透”为主，符合“治上焦如羽，非轻不举”的原则，诸药配伍体现了“益气固表、解毒生津”之功效，主治体虚风毒感冒，用于预防及治疗冬春季普通感冒、流感、病毒性肺炎等呼吸道疾病，有助于提高人体免疫功能。据临床研究表明，36例新型冠状病密切接触者服用本方后均未发病，90例有呼吸道症状经相关检查排除新型冠状肺炎的患者服用本方后，临床症状均明显减轻或消失，且未见毒副作用及明显不良反应，这说明该方能够提高机体免疫力、防治新型冠状病等呼吸道疾病。目前，关于该方的基础研究较少，在物质基础研究方面，现有研究主要集中在单味药材，尚未有研究系统、全面分析益肺解毒颗粒的化学组成。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法。
4.本发明的目的通过以下技术方案来实现：基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法对益肺解毒颗粒的成分进行快速鉴别，色谱柱为thermo accucore aq c18色谱柱，流动相为甲醇(a)-0.1％甲酸水溶液(b)，梯度洗脱，柱温35℃，进样量3μl，流速0.3ml/min。
5.进一步地，所述梯度洗脱具体为：0～3min，1％ a；3～7min，1％～2％ a；7～35min，2％～95％ a；35～37min，95％～2％ a；37～39min，1％ a。
6.进一步地，采用加热电喷雾离子源，在正、负离子同时扫描模式下采集益肺解毒颗粒的质谱数据，扫描范围m/z 100～1500，碰撞能量30ev。
7.进一步地，所述益肺解毒颗粒的成分为生黄芪、炒白术、防风、炙百合、石斛、桔梗、芦根、金银花、连翘、白茅根、生甘草。
8.进一步地，，它包括以下步骤：
9.s1.对照品溶液的制备：
10.分别精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、绿原酸、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、连翘苷、连翘酯苷a、升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、石斛碱、毛兰素、桔梗皂苷d、甘草苷和甘草酸铵，用甲醇分别溶解并分别制成质量浓度为10ug/ml的对照品溶液；
11.s2.供试品溶液的制备：精密称取益肺解毒颗粒，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得益肺解毒颗粒样品溶液；
12.s3.色谱检测：应用uplc-q-tof-ms系统，分别采集对照品溶液和供试品溶液在正、负离子扫描模式下的数据，得基峰离子色谱图；
13.s4.成分库的建立及数据处理：借助pubchem及文献中益肺解毒颗粒各单味药的化学成分信息，构建该制剂的化学成分库，根据质谱精确相对分子量信息，选择一级准分子离子峰质荷比实测值与理论值误差小于5ppm的分子与自建的益肺解毒颗粒化学成分数据库信息进行匹配，初步推测化合物信息；采用xcalibur 4.1软件进一步对目标化合物色谱峰及其二级碎片离子信息进行提取，根据二级碎片推断其裂解途径，并结合相关化学成分数据库和文献信息对目标化合物进行鉴定和确证。
14.进一步地，所述对照品溶液的制备方法具体为：分别精密称取各对照品适量，置于10ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容，制备单一对照品储备液；精密吸取各单一对照品储备液适量，加甲醇稀释，经0.22μm微孔滤膜滤过，制成质量浓度为10ug/ml的对照品溶液。
15.进一步地，所述供试品溶液的制备方法具体为：精密称取益肺解毒颗粒0.2g，加10ml50％甲醇超声30min，超声条件为：200w，40khz，超声后放置室温并转移至10ml量瓶中用50％甲醇补足至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得益肺解毒颗粒样品溶液。
16.进一步地，在益肺解毒颗粒中共表征出184个化学成分，包括三萜皂苷类38个、黄酮类32个、苯乙醇苷类17个、酚酸类14个、萜类16个、木脂素类11个、色原酮类11个、香豆素类10个、酚酸甘油酯类9个、挥发油类3个、核苷类3个、糖类2个、酚类2个、氨基酸类1个、其他类15个。
17.本发明具有以下优点：本发明通过采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(uhplc-q exactive focus ms/ms)对益肺解毒颗粒的成分进行快速鉴别，建立一种快速鉴定中药抗疫制剂益肺解毒颗粒的化学成分的高分辨质谱分析方法。通过本发明方法，共鉴定出184个化学成分，包括三萜皂苷类38个、黄酮类32个、苯乙醇苷类17个、酚酸类14个、萜类16个、木脂素类11个、色原酮类11个、香豆素类10个、酚酸甘油酯类9个、挥发油类3个、核苷类3个、糖类2个、酚类2个、氨基酸类1个、其他类15个。其中7个化合物通过对照品比对进行了确证。该方法可对益肺解毒颗粒中化学成分进行快速、准确地鉴定和分析，为其质量评价、药效物质及作用机制等研究奠定了基础。
附图说明
18.图1为益肺解毒颗粒在正离子(a)和负离子(b)模式下的bpi图。
19.图2为甘草皂苷g2的质谱裂解途径分析图。
20.图3为大豆苷元的质谱裂解途径分析图。
21.图4为连翘酯苷a的质谱裂解途径分析图。
22.图5为1,2-o-diferuloylglycerol的质谱裂解途径分析图。
23.图6为路路通酸的质谱裂解途径分析图。
24.图7为东莨菪内酯的质谱裂解途径分析图。
25.图8为5-o-甲基维斯阿米醇苷的质谱裂解途径分析图。
具体实施方式
26.下面结合附图及实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
27.实施例1：
28.1 仪器与试药
29.1.1 仪器
30.ultimate 3000型超高效液相色谱系统(美国戴安公司)和q exactive focus型质谱仪(美国thermo fisher scientific公司)，配有加热电喷雾离子源(hesi)和xcalibur 4.1数据处理软件；超声波清洗机(宁波新艺超声设备有限公司，型号：sb-5200dt)。电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司，型号：bt25s，d＝0.01mg；bs210s，d＝0.1mg)。
31.1.2试药
32.益肺解毒颗粒(批号：190317，规格：10g/袋，陕西省中医医院)；对照品黄芪甲苷(批号chb210112)，毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号chb201128)，绿原酸(批号chb201114)，3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸(批号chb201227)，4,5-二-o-咖啡酰奎宁酸(批号chb210104)，木犀草苷(批号chb201227)，连翘苷(批号chb201202)，连翘酯苷a(批号chb201203)，升麻素苷(批号chb201107)，5-o-甲基维斯阿米醇苷(批号chb201227)，夏佛塔苷(批号must-21112211)，石斛碱(批号chb210105)，毛兰素(批号chb201122)，桔梗皂苷d(批号chb201206)，甘草苷(批号chb201102)，甘草酸铵(批号chb201106)，以上对照品均购买于成都克洛玛生物科技有限公司；东莨菪内酯(批号wkq20011001，四川省维克奇生物科技有限公司)，马钱子苷(批号p24o11f128801，上海源叶生物科技有限公司)。以上对照品纯度均≥98％。甲醇为色谱级，甲酸为质谱级(美国thermo fisher scientific公司)；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
33.2 方法
34.2.1 对照品溶液的制备
35.分别精密称取各对照品适量，置于10ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容，制备单一对照品储备液；精密吸取各单一对照品储备液适量，加甲醇稀释，经0.22μm微孔滤膜滤过，制成质量浓度约为10ug/ml的对照品溶液。
36.2.2供试品溶液的制备
37.精密称取益肺解毒颗粒0.2g，加10ml 50％甲醇超声(200w，40khz)30min，放置室温后转移至10ml量瓶中用50％甲醇补足至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得益肺解毒颗粒样品溶液。
38.2.3检测条件
39.uhplc条件：thermo accucore aq c18色谱柱(150mm
×
2.1mm，2.6μm)；流动相采用甲醇(a)和0.1％甲酸水(b)梯度洗脱，洗脱程序为甲醇(a)-0.1％甲酸水溶液(b)梯度洗脱(0～3min，1％a；3～7min，1％～2％a；7～35min，2％～95％a；35～37min，95％～2％a；37～
39min，1％a)。流速0.3ml/min；进样量3μl；柱温35℃。流动相使用前超声脱气，样品溶液用0.22μm微孔滤膜过滤。
40.ms条件：离子源为加热电喷雾离子源(hesi)，喷雾电压为3.5kv，鞘气(n2)流量40arb，辅助气流量10arb，辅助加热器温度350℃，毛细管温度320℃，s-lens射频水平50，自动增益控制(agc)106。扫描方式采用正、负离子full ms/dd-ms2模式，full ms分辨率70000，dd-ms2分辨率35 000；扫描范围m/z 100～1500，碰撞能量30ev。
41.2.4成分库的建立及数据处理
42.借助pubchem及文献中益肺解毒颗粒各单味药的化学成分信息，构建该制剂的化学成分库，根据质谱精确相对分子量信息，选择一级准分子离子峰质荷比实测值与理论值误差小于5ppm的分子与自建的益肺解毒颗粒化学成分数据库信息进行匹配，初步推测化合物信息。采用xcalibur 4.1软件进一步对目标化合物色谱峰及其二级碎片离子信息进行提取，根据二级碎片推断其可能的裂解途径，并结合相关化学成分数据库和文献信息对目标化合物进行鉴定和确证。
43.3结果
44.3.1益肺解毒颗粒化学成分分析
45.应用uplc-q-tof-ms系统，分别采集对照品溶液和供试品溶液在正、负离子扫描模式下的数据，得基峰离子(bpi)色谱图，见图1。
46.经2.4项目下方法及通过对照品的二级质谱数据、相关文献信息及自建的益肺解毒颗粒药材化学成分数据库信息，对目标化合物进行快速鉴定和确证。结合化合物的一级、二级质谱及裂解规律进行分析和鉴别，最终在益肺解毒颗粒中共表征出184个化学成分，包括三萜皂苷类38个、黄酮类32个、苯乙醇苷类17个、酚酸类14个、萜类16个、木脂素类11个、色原酮类11个、香豆素类10个、酚酸甘油酯类9个、挥发油类3个、核苷类3个、糖类2个、酚类2个、氨基酸类1个、其他类15个。具体信息见表1。
47.48.49.50.51.52.53.54.55.56.57.58.59.60.[0061][0062]
3.2主要类别化合物的鉴定及其裂解规律研究
[0063]
3.2.1三萜皂苷类化合物
[0064]
三萜类化合物以游离形式或以糖结合成苷或酯的形式存在于植物体内，故其质谱裂解规律多为糖苷键的断裂，裂解过程中可能会丢失1个或多个h2o。以155号化合物为例，在正离子模式下，其准分子离子峰m/z 839.4056[m+h]
+
，根据元素组成综合分析出可能的分子式为c
42h62o17
。该离子通过乳糖醛酸苷键断裂形成m/z 469.3312[m+h-c
12h18o13
]
+
的碎片离子峰，再失去ch2o形成m/z 439.3207[m+h-c
12h18o13-ch2o]
+
的碎片离子峰，或者再失去1分子h2o形成m/z 451.3207[m+h-c
12h18o13-h2o]
+
的碎片离子峰；同时准分子离子峰还可通过2分子的葡萄糖醛酸苷键断裂形成m/z 487.3418[m+h-2
×
c6h8o6]
+
的碎片离子峰，或者葡萄糖醛酸苷键直接断裂形成m/z 663.3739[m+h-c6h8o6]
+
的碎片离子峰，据据碎片离子信息及文献报道
[27-29]
，推测该化合物为甘草皂苷g2，其质谱图及可能的裂解途径见图2。
[0065]
3.2.2黄酮类化合物
[0066]
黄酮类化合物a，b环上常连接有羟基、甲氧基、甲基、异戊烯基等官能团，且常与糖结合成苷，故糖苷键的断裂以及中性碎片如co，h2o的丢失是黄酮类化合物最主要的质谱裂解规律。本研究共鉴定和推测出32个黄酮类化合物，包括黄酮类(33，34，40，42，53，61，81，83，85，92，94，101，107，108，111，115，118，132，137，142，144，154，160，171)，查尔酮类(96，97，99，145)，二氢黄酮类(60，103，104)，异黄酮类(106)，主要来源于黄芪、甘草、桔梗药材。
[0067]
以101号峰为例，在正离子模式下，其准分子离子峰m/z 255.0654[m+h]
+
，根据元素组成综合分析出可能的分子式为c
15h10
o4。该离子脱去co形成m/z 227.0703[m+h-co]
+
的碎片离子峰，再失去co形成m/z 199.0754[m+h-co-co]
+
的碎片离子峰；其二级碎片还有，通过b环断裂丢失对羟基苯乙炔形成的m/z 137.0233[m+h-c8h6o]
+
碎片离子峰和通过b环断裂，再失去1分子co形成m/z 91.0542[m+h-c7h3o
3-co]
+
的碎片离子峰，据据碎片离子信息及文献报道
[35]
，推测该化合物为大豆苷元，其质谱图及可能的裂解途径见图3。
[0068]
3.2.3苯乙醇苷类化合物
[0069]
苯乙醇苷是一类酚苷类化合物，由苯乙醇和糖组合形成。母核通常为β-葡萄糖，其中苯乙基和羟基被羟基或甲氧基取代，肉桂酰基被甲氧基取代，通过酯键或糖苷键形成天然糖苷类化合物。以67号化合物为例，其保留时间(t/r＝19.46min)与连翘酯苷a对照品保留时间(t/r＝19.50min)相近，在负离子模式下，其准分子离子峰m/z 623.1954[m-h]-，根据元素组成综合分析出可能的分子式为c
29h36o15
。该离子脱去咖啡酰基(caffeoyl)形成m/z
[0070]
461.1644[m-h-c9h6o3]-的碎片离子峰，再失去c
18h26o10
形成m/z
[0071]
59.0139[m-h-c9h6o
3-c
18h26o10
]-的碎片离子峰；m/z 461.1644[m-h-c9h6o3]-的碎片离子峰通过3,4-二羟基苯甲酸乙酯键的断裂，并进一步丢失一个鼠李糖形成115.0401
[0072]
[m-h-c9h6o
3-c9h
10o4-c2h
15
o5]-的碎片离子峰，或先失去1分子h2o，接着失去c9h
10
o4形成205.0718[m-h-c9h6o
3-h2o-c
13h20
o5]-的碎片离子峰；准分子离子峰m/z 623.1954[m-h]-还可直接通过糖苷键的断裂形成161.0244[m-h-c
20h31o12
]-的碎片离子峰，据据碎片离子信息及文献报道
[3]
，推测该化合物为连翘酯苷a，其质谱图及可能的裂解途径见图4。
[0073]
3.2.4酚酸类化合物
[0074]
酚酸类一般在一个苯环上会有多个酚羟基，因而其结构不稳定，容易受到酸、碱等的影响而发生裂解。以124号化合物为例，在负离子模式下，其准分子离子峰m/z 443.1333[m-h]-，根据元素组成综合分析出可能的分子式为c
23h24
o9。该离子脱去c
10
h8o3和c3h6o2形成m/z193.0506[m-h-c
10
h8o
3-c3h6o2]-的碎片离子峰，再失去1分子co2和1个ch3生成m/
z134.0373[m-h-c
10
h8o
3-c3h6o
2-co
2-ch3]-的碎片离子峰；准分子离子峰m/z 443.1348[m-h]-还可直接裂解为175.0401[m-h-c
13h16
o6]-的碎片离子峰，据据碎片离子信息及文献报道
[20]
，推测该化合物为1,2-o-diferuloylglycerol，其质谱图及可能的裂解途径见图5。
[0075]
3.2.5萜类化合物
[0076]
本研究共推测出16个萜类化合物，包括倍半萜类(149和159)，环烯醚萜类(19，20，22，24，45，56，77)和其他萜类(120，121，139，152，153，172，183)。以152号化合物为例，在正离子模式下，其准分子离子峰m/z 455.3527[m+h]
+
，根据元素组成综合分析出可能的分子式为c
30h46
o3。该离子脱去甲酸形成m/z 409.3465[m+h-hcooh]
+
的碎片离子峰，再失去c
15h23
o形成m/z 189.1638[m+h-hcooh-c
15h23
o]
+
的碎片离子峰，据据碎片离子信息及文献报道，推测该化合物为路路通酸，其质谱图及可能的裂解途径见图6。
[0077]
3.2.6苯丙素类化合物
[0078]
苯丙素类包括简单苯丙素类、香豆素和木脂素3类成分，质谱裂解中容易丢失co，ch3及ch3oh等中性分子。本研究共鉴定和推测出21个苯丙素类化合物，包括11个木脂素类(36，51，52，64，65，79，89，90，95，100，110)和10个香豆素类(43，46，48，49，93，102，105，113，119，150)。以43号峰为例，其保留时间(t/r＝17.52min)与东莨菪内酯对照品保留时间(t/r＝17.63min)相近，在正离子模式下，其准分子离子峰m/z 193.0496[m+h]
+
，根据元素组成综合分析出可能的分子式为c
10
h8o4。该离子脱去1分子co形成m/z165.0546[m+h-co]
+
的碎片离子峰，丢失1分子co形成m/z 137.0597[m+h-co-co]
+
的碎片离子峰，再失去1分子的甲醇形成m/z 105.0335[m+h-co-co-ch3oh]
+
的碎片离子峰；同时m/z 165[m+h-co]
+
可通过丢失1分子的甲醇形成m/z 133.0284[m+h-co-ch3oh]
+
的碎片离子峰，通过丢失1个ch3形成m/z 150.0311[m+h-co-ch3]
+
的碎片离子峰，据据碎片离子信息及文献报道，推测该化合物为东莨菪内酯，其质谱图及可能的裂解途径见图7。
[0079]
3.2.7色原酮类化合物
[0080]
色原酮类化合物属于植物的次生代谢产物，最具代表性的化合物为5,7-二羟基色原酮，全部来源于防风药材。以91号峰为例，保留时间(t/r＝21.48min)与5-o-甲基维斯阿米醇苷对照品的保留时间(t/r＝21.56min)相近，在正离子模式下，其准分子离子峰m/z 453.1749[m+h]
+
，根据元素组成综合分析出可能的分子式为c
22h28o10
。该离子脱去1分子葡萄糖后形成m/z 273.1121[m+h-c6h
12
o6]
+
，丢失异丙基形成m/z 231.0652[m+h-c6h
12o6-c(ch3)2]
+
的碎片离子峰；同时准分子离子峰m/z 453.1779[m+h]
+
还可直接丢失c
10h18
o7形成m/z231.0652[m+h-c
10h18
o7]
+
的碎片离子峰，据据碎片离子信息及文献报道，推测该化合物为5-o-甲基维斯阿米醇苷，其可能的裂解途径见图8。
[0081]
本发明为最大程度获取抗疫制剂益肺解毒颗粒药材成分的质谱信息，采用uhplc-q-exactive-ms技术对该抗疫制剂的化学成分进行了快速鉴定，考察了流动相乙腈-0.1％甲酸水溶液、0.1％甲酸乙腈-0.1％甲酸水溶液及甲醇-0.1％甲酸水溶液三种液相体系，发现甲醇-0.1％甲酸水溶液洗脱系统特征峰比较明显、分离效果最好；采用正、负离子2种模式分别进样扫描，发现2种模式下的基峰离子流图均有较好的响应。通过参考文献报道与对照品，比对化合物的保留时间、精确准分子离子峰及二级碎片等信息，并对主要类型化学成分二级碎片的质谱裂解规律进行推断，初步鉴定并推测出184个化合物，分布于三萜皂苷类、黄酮类、苯乙醇苷类、酚酸类、萜类、苯丙素类、色原酮类等，较全面的揭示该制剂的化学
物质基础。
[0082]
据文献报道，益肺解毒颗粒主治症见体虚易感、身困乏力、咽干咽痒、干咳少痰，发热头痛，舌淡红苔薄白或黄腻，脉浮数而无力的体虚风毒感冒，用于预防及治疗冬春季普通感冒、流感、病毒性肺炎等呼吸道疾病，有助于提高人体免疫功能。经鉴定的益肺解毒颗粒184个化合物中，黄芪含18个，主要为黄酮类、三萜皂苷类、核苷类、香豆素类及多糖类，其中毛蕊异黄酮，可以减少氧化应激和炎症反应，并改善神经功能，黄芪甲苷可能通过抑制nf-κb通路激活减少细胞炎性反应，同时抑制细胞自噬，对脂多糖诱导的pc12细胞炎性损伤发挥保护作用；金银花含18个，主要为萜类、酚酸类、黄酮类等；酚酸类作为重要的次生代谢产物，可不同程度地抑制炎症因子释放，其中咖啡酸抗炎活性最强，咖啡酸作为核转录因子nf-κb抑制剂，可调节炎性介质释放及免疫活性；炒白术含7个，主要为萜类，其中白术内酯ⅰ和白术内酯ⅲ对巨噬细胞产生的tnf-α、il-1β、il-6具有显著的抑制作用，能够使其ccl22、arginase1、tgf-β表达水平升高，il-1β、inos表达水平降低；且白术内酯ⅲ能参与调控tlr4/nf-κb信号通路，降低tnf-α的浓度以及inos、myd88、tlr4、cox-2的蛋白表达水平，表明白术内酯ⅰ、ⅲ能够明显促进炎性巨噬细胞因子表达发生改变，具有抗炎活性
[46-47]
；防风含19个，主要为色原酮类和香豆素类，色原酮类成分是防风发挥解热、镇痛、抗炎的主要活性成分，香豆素是继色原酮另一类主要药效成分，从而选择5-o-甲基维斯阿米醇苷分析其裂解途经，研究表明，5-o-甲基维斯阿米醇苷具有解热、镇痛、抗炎及抗血小板聚集作用，升麻苷通过抑制jak2/stat3信号转导抑制inos和cox-2的表达，对raw 264.7巨噬细胞发挥抗炎作用；炙百合含13个，主要为酚酸甘油酯类和酚酸类；石斛含2个，为挥发油类和酚酸类；桔梗含9个，主要为三萜皂苷类，研究发现桔梗皂苷d有治疗肺炎、急性肺损伤、乳腺炎等作用，桔梗皂苷d3具有调节气道粘蛋白的产生和分泌的能力，进而发挥宣肺祛痰的功效；白茅根含2个；甘草含45个，主要为三萜皂苷类和黄酮类，甘草总皂苷抑制花生四烯酸代谢途径pge合成的关键酶，能显著抑制no、tnf-α及il-1的生成与释放，甘草查尔酮a抑制inos，cox-2基因和蛋白的表达水平和炎症介质il-6的基因表达，上调ppar-γ的基因表达，抑制巨噬细胞的激活和炎症细胞因子的生成，发挥抗炎作用。同时鉴定出一些药材的共有成分，如化合物4来源于为黄芪、金银花、甘草等。
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以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，其特征在于，采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法对益肺解毒颗粒的成分进行快速鉴别，色谱柱为thermo accucore aq c18色谱柱，流动相为甲醇(a)-0.1％甲酸水溶液(b)，梯度洗脱，柱温35℃，进样量3μl，流速0.3ml/min。2.根据权利要求1所述的基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱具体为：0～3min，1％a；3～7min，1％～2％a；7～35min，2％～95％a；35～37min，95％～2％a；37～39min，1％a。3.根据权利要求1所述的基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，其特征在于，采用加热电喷雾离子源，在正、负离子同时扫描模式下采集益肺解毒颗粒的质谱数据，扫描范围m/z 100～1500，碰撞能量30ev。4.基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，其特征在于，所述益肺解毒颗粒的成分为生黄芪、炒白术、防风、炙百合、石斛、桔梗、芦根、金银花、连翘、白茅根、生甘草。5.根据权利要求1所述的基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，其特征在于，它包括以下步骤：s1.对照品溶液的制备：分别精密称取对照品黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、绿原酸、3,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、4,5-二-o-咖啡酰奎宁酸、木犀草苷、连翘苷、连翘酯苷a、升麻素苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、5-o-甲基维斯阿米醇苷、石斛碱、毛兰素、桔梗皂苷d、甘草苷和甘草酸铵，用甲醇分别溶解并分别制成质量浓度为10ug/ml的对照品溶液；s2.供试品溶液的制备：精密称取益肺解毒颗粒，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，即得益肺解毒颗粒样品溶液；s3.色谱检测：应用uplc-q-tof-ms系统，分别采集对照品溶液和供试品溶液在正、负离子扫描模式下的数据，得基峰离子色谱图；s4.成分库的建立及数据处理：借助pubchem及文献中益肺解毒颗粒各单味药的化学成分信息，构建该制剂的化学成分库，根据质谱精确相对分子量信息，选择一级准分子离子峰质荷比实测值与理论值误差小于5ppm的分子与自建的益肺解毒颗粒化学成分数据库信息进行匹配，初步推测化合物信息；采用xcalibur 4.1软件进一步对目标化合物色谱峰及其二级碎片离子信息进行提取，根据二级碎片推断其裂解途径，并结合相关化学成分数据库和文献信息对目标化合物进行鉴定和确证。6.根据权利要求5所述的基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，其特征在于，所述对照品溶液的制备方法具体为：分别精密称取各对照品适量，置于10ml量瓶中，加甲醇使溶解并定容，制备单一对照品储备液；精密吸取各单一对照品储备液适量，加甲醇稀释，经0.22μm微孔滤膜滤过，制成质量浓度为10ug/ml的对照品溶液。7.根据权利要求5所述的基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备方法具体为：精密称取益肺解毒颗粒0.2g，加10ml 50％甲醇超声30min，超声条件为：200w，40khz，超声后放置室温并转移至10ml量瓶中用50％甲醇补足至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，即得益肺解毒颗粒样品
溶液。8.根据权利要求5所述的基于uhplc-q exactive focus ms/ms的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，其特征在于，在益肺解毒颗粒中共表征出184个化学成分，包括三萜皂苷类38个、黄酮类32个、苯乙醇苷类17个、酚酸类14个、萜类16个、木脂素类11个、色原酮类11个、香豆素类10个、酚酸甘油酯类9个、挥发油类3个、核苷类3个、糖类2个、酚类2个、氨基酸类1个、其他类15个。

技术总结
本发明公开了一种基于UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS的益肺解毒颗粒化学成分的分析方法，采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法对益肺解毒颗粒的成分进行快速鉴别，色谱柱为Thermo Accucore aQ C18色谱柱，流动相为甲醇(A)-0.1％甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，柱温35℃，进样量3μL，流速0.3mL/min。本发明建立一种快速鉴定中药抗疫制剂益肺解毒颗粒的化学成分的高分辨质谱分析方法，该方法可对益肺解毒颗粒中化学成分进行快速、准确地鉴定和分析，为其质量评价、药效物质及作用机制等研究奠定了基础。机制等研究奠定了基础。机制等研究奠定了基础。


技术研发人员：刘静 杜霞 龙凯花 李晔 张红 马战平
受保护的技术使用者：陕西省中医医院
技术研发日：2023.02.20
技术公布日：2023/7/12