一种基于氟化聚合物的纳米载体及其制备方法和应用

1.本发明涉及联合递送化药和基因药物的载体制备技术领域，尤其涉及一种基于氟化聚合物的纳米载体及其制备方法和应用。


背景技术：

2.通过聚合物纳米粒改善化药的水溶性被广泛应用于药物递送系统。纳米粒常通过载体和药物之间的偶联形成核壳结构，利用疏水相互作用将疏水性药物包载在核中，由亲水外壳提供靶向、掩蔽和加强循环的功能。然而，药物分子之间会存在非特异的疏水相互作用，导致聚合物纳米粒在形成过程中出现药物聚集，造成载药量和均一性的降低。因此，设计更有效的前药策略实现更高载药量的化药递送体系，是构建聚合物纳米粒的关键。
3.与氢相比，氟分子之间具有避免与其他基团发生相互作用的亲氟效应，并且氟化修饰的碳链既疏水又疏油，在水性生物环境和脂质双层中均具有高相分离性，这些特性有利于增加聚合物的循环稳定性和组织渗透性。因此，利用更强且更特异的氟氟相互作用，有望达到更有效的载体和药物的偶联组装。此外，具有低表面能的氟化修饰聚合物在低浓度下也能够相互作用，进一步突出了氟氟相互作用的实用性。
4.乳腺癌和黑色素瘤是当前癌症患者中非常常见的疾病，通过抗肿瘤免疫作用治疗这些且不限于这些实体瘤癌症，有望在更高的安全性下杀伤实体瘤组织和易转移的癌细胞。阿霉素(dox)作为经典的抗肿瘤药物，除了能破坏dna直接杀伤细胞外，还能触发细胞产生损伤相关分子模式导致免疫原性细胞死亡(icd)，进而刺激树突状细胞(dc细胞)的成熟，促进效应t细胞的浸润。然而，在对实体瘤的治疗中，肿瘤微环境会通过各种调控手段阻碍抗肿瘤免疫作用，诱导暴露在肿瘤微环境中的t细胞的共抑制受体表达增加，增殖能力和i型免疫细胞因子的产生下降，这种t细胞衰竭的状态，阻碍了化疗药物的抗肿瘤免疫作用。因此，有必要研究一种纳米粒在递送化疗药物阿霉素的同时调控肿瘤微环境中的免疫细胞以高效发挥抗肿瘤免疫治疗效果。胸腺细胞选择相关的高迁移率群盒蛋白(tox)在耗竭t细胞中显著上调，通过小干扰rna下调tox表达水平，有望恢复t细胞的抗肿瘤能力，提高阿霉素免疫原性化疗的效率。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种基于氟化聚合物的纳米载体及其制备方法和应用，该方法能够将化疗药物如阿霉素与亲水性聚乙二醇实现组装，并包载生物分子如具有下调tox蛋白功能的小干扰rna(sitox)，从而构建高载药量的化药基因共递送体系，用于人实体瘤癌症的抗肿瘤免疫治疗。
6.第一方面，本发明提供了一种基于氟化聚合物的纳米载体的制备方法，其包括如下步骤：
7.(1)以2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-十二氟-1,8-辛二醇、草酰氯和聚乙二醇为原料，经聚合反应，透析，冷冻干燥，得到化合物i；
[0008][0009]
(2)以3,5-双三氟甲基苯甲醛和阿霉素为原料，通过席夫碱形成反应，得到化合物ii；
[0010][0011]
(3)以所述化合物i和化合物ii为原料，在二甲基亚砜溶剂中发生氟-氟相互作用，得到氟化聚乙二醇-氟化阿霉素聚合物；
[0012]
(4)向水中滴加步骤(3)所得的氟化聚乙二醇-氟化阿霉素聚合物，透析，冷冻干燥，得到基于氟化聚合物的纳米载体。
[0013]
进一步的，步骤(1)中，所述聚合反应的时间为0.5h
–
60h，优选为6h。所述2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-十二氟-1,8-辛二醇、草酰氯、聚乙二醇的摩尔比为1:(1-15):1，优选为1:(1-3):1，更优选为1：2：1。所述反应温度范围为0
–
99℃，优选为25℃；所述聚乙二醇的分子量为100-10000，优选为600。
[0014]
进一步的，步骤(2)中，所述反应的时间为0.5h
–
240h，优选为24h。所述3,5-双三氟甲基苯甲醛、阿霉素的摩尔比为0.1-10:1，优选为1-2:1，更优选为1.1：1。所述反应温度范围为0
–
99℃，优选为25℃。
[0015]
进一步的，步骤(3)中，所述反应的时间为0.5h
–
24h，优选为1h。所述反应温度范围为0
–
99℃，优选为25℃。
[0016]
进一步的，步骤(3)中，所述化合物i和化合物ii的质量比为0.01
–
100，优选为1。
[0017]
进一步的，步骤(4)中，所述滴加过程中持续搅拌0.5h
–
24h，优选为1h。所述滴加浓度范围为0.1
–
10mg/ml，优选为1mg/ml。
[0018]
第二方面，本发明提供了一种上述方法制备的基于氟化聚合物的纳米载体。
[0019]
第三方面，本发明还提供了一种载基因药物的氟化聚合物纳米粒体系，其制备方法如下：将核酸药物溶解后与前述的基于氟化聚合物的纳米载体在水中充分混合，核酸药物与氟化聚合物纳米载体的质量比为1:0.01-100，静置后得到载基因聚合物纳米体系。
[0020]
进一步的，所述静置时间为5min
–
24h，优选为20min。
[0021]
第四方面，本发明还提供了一种所述的基于氟化聚合物的纳米载体或所述的载基因药物的氟化聚合物纳米粒体系在制备人实体瘤癌症治疗药物中的应用。
[0022]
进一步的，人实体瘤癌症为乳腺癌或黑色素瘤。
[0023]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024]
(1)本发明以氟化修饰的聚乙二醇为原料合成产品，聚乙二醇是具有良好生物相
容性的聚合物分子，并且氟元素在30％的上市药物中存在，在临床治疗中氟化聚乙二醇作为药物使用具有安全性。
[0025]
(2)本发明依托氟化修饰的载体和药物之间的相互作用，合成过程简便，修饰后包载成纳米粒的策略具有广泛适用于化疗药物的潜力。
[0026]
(3)本发明中形成的纳米粒具有高渗透长滞留效应，能够提高药物在实体瘤组织中的浓度，降低化药的副作用，并且具有对化药的高载药量，提高治疗效率。
[0027]
(4)本发明中共同递送化疗药物和基因药物，两者的共同作用促进了肿瘤微环境中免疫细胞的激活，表现出对实体瘤的抗肿瘤免疫作用。
附图说明
[0028]
图1为本发明联合递送化药和基因药物发挥抗肿瘤免疫作用的原理示意图。
[0029]
图2为对实施例1中形成的聚合物纳米粒的包载能力和物理特性的表征；
[0030]
其中，a.琼脂糖凝胶电泳检测基因在不同质量比(w/w)下被缩合的情况；b.在ph 7.4的pbs溶液或10％的血清溶液中，载基因氟化聚合物纳米粒在48h内的粒径变化；c.载基因氟化聚合物纳米粒在不同ph和不同过氧化氢浓度的溶液中12h内的粒径变化；d.纳米粒在不同条件下的dox释放。
[0031]
图3为实施例1中聚合物纳米粒对肿瘤细胞icd的诱导情况，以及促进dc细胞成熟的能力；
[0032]
其中，a.小鼠乳腺癌(4t1)细胞经过不同浓度的不同处理后的凋亡水平，pbs为磷酸盐缓冲液对照组，fpeg为氟化聚乙二醇，dox为游离阿霉素，fpeg-fdox@sitox为载sitox氟化聚合物纳米粒；b-d.不同条件下肿瘤细胞的钙网蛋白(crt)暴露情况，以及三磷酸腺苷(atp)和高迁移率族蛋白1(hmgb1)的分泌水平；e.不同条件下dc细胞的成熟水平。
[0033]
图4为实施例1中聚合物纳米粒对4t1荷瘤小鼠的体内免疫激活情况；
[0034]
其中，a.荷瘤小鼠在被给予不同药物后的dc细胞成熟水平；b.荷瘤小鼠在被给予不同药物后cd8
+
t细胞向肿瘤组织的浸润情况；c.被给予不同药物的小鼠肿瘤组织的耗竭t细胞水平；d.通过流式细胞术分析肿瘤组织内浸润的cd8
+
t细胞中的tox含量。
[0035]
图5为实施例1中聚合物纳米粒对4t1荷瘤小鼠的抗肿瘤和抗转移作用；
[0036]
其中，a.荷瘤小鼠被给予各种治疗后实体瘤体积的变化，ns为注射生理盐水的空白对照组，dox为注射游离阿霉素给药，fpeg-fdox@sinc为注射载无治疗作用的sirna(sinc)氟化聚合物纳米粒给药，fpeg-fdox@sitox为注射载sitox氟化聚合物纳米粒给药；b.不同给药的小鼠在实验观察结束后的肿瘤重量；c.荷瘤小鼠在治疗期间的相对体重变化；d.不同治疗的荷瘤小鼠在60天内的生存情况；e.抗转移研究中各组小鼠的肺组织及肺组织的h&e染色图像。
[0037]
图6为实施例1中聚合物纳米粒对小鼠黑色素瘤(b16f10)细胞接种的荷瘤小鼠的抗肿瘤和抗转移作用；
[0038]
其中，a.c57bl/6荷瘤小鼠被给予各种治疗后实体瘤体积的变化；b.不同给药的小鼠在实验观察结束后的肿瘤重量；c.荷瘤小鼠的肿瘤组织图像；d.不同治疗的荷瘤小鼠在60天内的生存情况；e.抗转移研究中各组小鼠的肺组织及肺组织的h&e染色图像。
具体实施方式
[0039]
以下实施例可以更好地理解本发明，但不限于本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0040]
实施例1利用氟氟相互作用制备氟化聚合物纳米粒
[0041]
(1)2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-十二氟-1,8-辛二醇(mw＝362.11,713mg,2.0mmol)溶入5ml二甲基甲酰胺，草酰氯(mw＝126.92,500mg,4.0mmol)和聚乙二醇(mw≈600,1.18g,2.0mmol)溶入5ml二氯甲烷并在4摄氏度下滴入前述二甲基甲酰胺溶液中，氮气保护下，室温反应6小时，透析纯化48小时，冷冻干燥24小时，得到氟化聚乙二醇；反应式如下：
[0042][0043]
(2)将3,5-双三氟甲基苯甲醛(mw＝242.11,484mg,2.0mmol)和游离阿霉素(mw＝543.52,1.09g,2.0mmol)溶于10ml二甲基亚砜溶液，加入微量醋酸，氮气保护下反应24小时，通过柱层析法(二氯甲烷:甲醇＝10:1)纯化产物，得到氟化阿霉素，反应式如下：
[0044][0045]
(3)将步骤(1)所得氟化聚乙二醇(mw＝3963,198mg,0.05mmol)和步骤(2)所得氟化阿霉素(mw＝767.64,198mg,0.25mmol)溶于1ml二甲基亚砜溶液中并在避光条件下室温搅拌1小时，搅拌停止后将其滴入磷酸盐缓冲液中继续搅拌1小时，透析纯化48小时，冷冻干燥24小时，得到氟化聚乙二醇-氟化阿霉素聚合物。将其以基因质量的0.2
–
2倍的浓度溶解在水溶液中并与sinc溶液或sitox溶液混合，得到不同w/w的载sinc氟化聚合物纳米粒和载sitox氟化聚合物纳米粒。
[0046]
实施例2：物性研究
[0047]
取实施例1制备获得的氟化聚合物纳米粒，对纳米粒在不同处理下的物理特性进行研究。
[0048]
具体研究方法如下：
[0049]
实验(1)：不同w/w的氟化聚合物纳米粒溶液静置30分钟后，在100v下进行15分钟的电泳实验，验证基因在纳米粒中的包封情况，并通过成像系统成像。
[0050]
实验(2)：在ph 7.4的pbs缓冲液或10％血清(fbs)中孵育0.5、2、6、12和24小时后检测载sinc氟化聚合物纳米粒的粒径；在ph 5.0的pbs缓冲液以及含有100μm过氧化氢的ph 7.4和ph 5.0的pbs缓冲液中孵育0.5、4、8和12小时后测量纳米粒的粒径。
[0051]
实验(3):将含有纳米粒的透析袋(mwco,1000da)放入不同条件的pbs缓冲液中，300rpm的搅拌速度下在48小时内从缓冲液中连续收集样品，用紫外分光光度计在480nm处测定纳米粒中释放出的游离阿霉素。
[0052]
测定结果如图2所示，电泳结果表明，氟化聚乙二醇-氟化阿霉素聚合物与游离阿霉素相比提高了基因包载能力。在含有血清的溶液中持续监测的粒径结果表明，氟化聚合物纳米粒能够在10％血清溶液中保持稳定。不同ph和过氧化氢条件下的粒径结果和阿霉素释放结果表明，氟化聚合物纳米粒在酸性和氧化条件下具有敏感释放药物的能力。
[0053]
实施例3：取实施例1制备获得的载sitox氟化聚合物纳米粒，以氟化聚乙二醇和游离阿霉素为对照，对小鼠乳腺癌细胞的凋亡、免疫原性死亡和对dc细胞成熟的诱导作用进行研究。
[0054]
具体方法如下：
[0055]
实验(1):以浓度为5μg/ml制备氟化聚乙二醇、游离阿霉素和载sitox氟化聚合物纳米粒(2.5μg/ml sitox)，用凋亡检测试剂盒通过流式细胞术分析细胞凋亡情况。
[0056]
实验(2):将四组4t1细胞分别用含有1μg/ml阿霉素的游离阿霉素、载sitox氟化聚合物纳米粒(0.5μg/ml sitox)、pbs缓冲液和氟化聚乙二醇处理，24小时后除去上清液，分别采用crt抗体、atp试剂盒和hmgb1酶联免疫吸附测定试剂盒检测三种分子水平的变化。
[0057]
实验(3):将四组4t1细胞以(2)中所述方法处理，12小时后除去上清液，将dc 2.4细胞加入到4t1细胞中，共培养12小时，用cd11c、cd80和cd86的荧光抗体通过流式细胞分析术检测dc细胞成熟情况。
[0058]
测定结果如图3所示，细胞凋亡结果表明，载sitox的氟化聚合物纳米粒在细胞实验中能达到有效的肿瘤细胞杀伤。crt、atp和hmgb1含量检测结果表明，载sitox的氟化聚合物纳米粒能够引起4t1细胞发生显著的免疫原性细胞死亡。dc细胞成熟结果表明，载sitox的氟化聚合物纳米粒处理后的4t1细胞能够诱导dc细胞的成熟。
[0059]
实施例4：取实施例1制备获得的载基因氟化聚合物纳米粒，以生理盐水和游离阿霉素为对照，对荷瘤小鼠免疫细胞的诱导作用和tox抑制作用，以及对4t1或b16f10荷瘤小鼠的抗肿瘤和抗转移作用进行研究。
[0060]
具体方法如下：
[0061]
实验(1):选用18～22g的雌性balb/c小鼠，随机分为4组每组5只，向每只小鼠左侧皮下注射1
×
106个4t1细胞构建原发实体瘤模型。7天后实体瘤长至约150mm3时，向4组小鼠尾静脉分别注射给药生理盐水和4mg/kg游离阿霉素，以及含有4mg/kg阿霉素和2mg/kg基因的载sinc氟化聚合物纳米粒和载sitox氟化聚合物纳米粒，每2天注射给药一次共4次。最后一次注射给药的7天后，收集小鼠的肿瘤组织和淋巴结，检测免疫细胞的变化。
[0062]
实验(2):用与本实施例实验(1)相同的造模和注射给药方式，在最后一次注射给药的3天后，向每只小鼠尾静脉注射5
×
105个4t1细胞构建肿瘤转移模型，11天后收集肿瘤和肺组织。在治疗期间每两天称量小鼠体重和测量肿瘤的尺寸，肿瘤体积(mm3)＝0.5
×
长
×
宽2。
[0063]
实验(3):用与本实施例实验(1)相同的造模和注射给药方式，对小鼠进行持续60天的生存期研究。
[0064]
实验(4):选用18～22g雌性c57bl/6小鼠分为4组每组5只，向其右背部皮下注射1
×
106个b16f10细胞构建黑色素瘤模型。4天后当肿瘤生长到约50mm3时，在c57bl/6小鼠上进行与balb/c小鼠相同的注射给药治疗，每2天注射给药一次共5次。治疗中记录肿瘤尺寸和小鼠体重。造模20天后，收集小鼠肿瘤组织称重。
[0065]
实验(5):向c57bl/6小鼠尾静脉注射8
×
105个b16f10细胞构建转移模型，隔天用与本实施例实验(4)同样的注射给药方式治疗小鼠，15天后收集小鼠肺组织。
[0066]
如图1为氟化聚合物纳米粒自组装示意图及其抗肿瘤和抗转移的原理模式图。
[0067]
如图4所示，cd80和cd86抗体检测的dc细胞成熟结果表明，载sitox氟化聚合物纳米粒能够显著诱导dc细胞的成熟。cd3和cd8抗体检测的t细胞水平结果表明，载sitox氟化聚合物纳米粒能够提升cd8
+
t细胞在肿瘤组织中的浸润。pd1和tim3检测的耗竭t细胞结果表明，载sitox氟化聚合物纳米粒显著下调了耗竭t细胞的水平，而载sinc氟化聚合物纳米粒没有表现出耗竭t细胞的下调，说明作为基因载体的氟化聚乙二醇-氟化阿霉素聚合物能够有效递送sitox下调耗竭t细胞水平。tox水平检测结果进一步表明载sitox氟化聚合物纳米粒递送sitox抑制了tox蛋白的表达。
[0068]
如图5所示，瘤体积变化和瘤重结果表明，载sitox氟化聚合物纳米粒治疗的小鼠肿瘤生长最缓慢。体重和生存率结果表明，载sitox氟化聚合物纳米粒治疗组的小鼠与对照组相比没有发生显著的体重下降，并且小鼠生存时间延长。肺组织图像结果表明，载sitox氟化聚合物纳米粒具有显著抑制小鼠4t1细胞肺转移的作用。
[0069]
如图6所示，瘤体积和瘤重表明，载sitox氟化聚合物纳米粒治疗后小鼠的黑色素瘤在同样的时间内被抑制得最明显。生存率结果表明，纳米粒治疗与游离阿霉素治疗相比延长了小鼠的生存时间。肺组织的结果分析表明，载sitox氟化聚合物纳米粒具有显著抑制小鼠b16f10细胞肺转移的效果。
[0070]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种基于氟化聚合物的纳米载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)以2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-十二氟-1,8-辛二醇、草酰氯和聚乙二醇为原料，经聚合反应，透析，冷冻干燥，得到化合物i；(2)以3,5-双三氟甲基苯甲醛和阿霉素为原料，通过席夫碱形成反应，得到化合物ii；(3)以所述化合物i和化合物ii为原料，在二甲基亚砜溶剂中发生氟-氟相互作用，得到氟化聚乙二醇-氟化阿霉素聚合物；(4)向水中滴加步骤(3)所得的氟化聚乙二醇-氟化阿霉素聚合物，透析，冷冻干燥，得到基于氟化聚合物的纳米载体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述聚合反应的时间为0.5h
–
60h，所述2,2,3,3,4,4,5,5,6,6,7,7-十二氟-1,8-辛二醇、草酰氯、聚乙二醇的摩尔比为1:(1-15):1，所述反应温度范围为0
–
99℃；所述聚乙二醇的分子量为100-10000。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述反应的时间为0.5h
–
240h，所述3,5-双三氟甲基苯甲醛、阿霉素的摩尔比为0.1-10:1，所述反应温度范围为0
–
99℃。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应的时间为0.5h
–
24h，所述反应温度范围为0
–
99℃。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述化合物i和化合物ii的质量比为0.01
–
100。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述滴加过程中持续搅拌0.5h
–
24h，所述滴加浓度范围为0.1
–
10mg/ml。7.一种如权利要求1～6任一项所述方法制备的基于氟化聚合物的纳米载体。8.一种载基因药物的氟化聚合物纳米粒体系，其特征在于，制备方法如下：将核酸药物溶解后与权利要求7所述的基于氟化聚合物的纳米载体在水溶液中充分混合，核酸药物与氟化聚合物纳米载体的质量比为1:0.01-100，静置后得到载基因聚合物纳米体系。9.如权利要求8所述的载基因氟化聚合物纳米粒体系，其特征在于，所述静置时间为5min
–
24h。10.如权利要求7所述的基于氟化聚合物的纳米载体或权利要求9所述的载基因药物的氟化聚合物纳米粒体系在制备人实体瘤癌症治疗药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于氟化聚合物的纳米载体及其制备方法和应用；该方法包括：(1)合成化合物I；(2)合成化合物II；(3)以化合物I和化合物II为原料，经氟-氟相互作用，得到化合物III；(4)向水中滴加化合物III，得到氟化聚合物载体；(5)核酸(如DNA或RNA)或蛋白溶液与氟化聚合物载体溶液充分混合，得到载基因聚合物纳米体系。本发明方法能够将化疗药物如阿霉素等化疗药与亲水性聚乙二醇实现组装，并包载生物分子如具有下调TOX蛋白功能的小干扰RNA等核酸药物，从而构建高载药量的化药基因共递送体系，用于实体瘤的抗肿瘤免疫治疗。用于实体瘤的抗肿瘤免疫治疗。用于实体瘤的抗肿瘤免疫治疗。


技术研发人员：王本 张清妍
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2023.02.08
技术公布日：2023/7/12