一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法与流程

1.本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法。


背景技术：

2.啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验，出现较早，在上个世纪70-80年代，广泛用于评估化合物的系统遗传毒性。但因其操作复杂，程序繁琐，阅片时间长等问题，逐渐被红细胞微核试验所取代。但当化合物可引起如体温变化、应激、诱导红细胞生成改变等情况下，化合物可诱导机体产生非遗传毒性机制造成的微核升高。此时，可用该染色体畸变试验作为体内遗传毒理试验评估化合物的遗传毒性。
3.骨髓细胞染色体畸变试验作为经典的遗传毒理试验，根据一些文献报道，其染色效果和中期相染色体的呈现形态并不好，严重影响畸变率的评估，同时大大的影响了阅片的进度。急需一种方法来优化细胞的处理和制备的过程。


技术实现要素：

4.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，用于解决现有技术中遗传毒理试验中染色体畸变情况不易观察的问题。本发明的细胞处理方法优化了低渗条件，提高低渗效率；优化染色效果，提高玻片质量进一步提升阅片效率。经此细胞处理方法染色的玻片，染色均匀，深浅适宜，既能很好的评估畸变率，也能更快的阅片。
5.为实现上述目的及其他相关目的，
6.本发明的第一方面，提供一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，包括如下步骤：
7.步骤一、将低渗液加入重悬细胞中，进行一次孵育；
8.步骤二、向一次孵育后的细胞中加入固定液，进行二次孵育；
9.步骤三、将二次孵育后的细胞制片，将细胞玻片浸入1～20％的染色液中1～20min，即可。
10.经低渗液一次孵育、固定液二次孵育处理后的细胞，可保证有足够数目的细胞充分吸涨，以保证有足够多的中期相细胞可用于阅片和评估。在染色过程中，优化染色液的浓度，经此方法染色的玻片，染色均匀，深浅适宜。
11.于本发明的一实施例中，包括如下步骤：
12.步骤一、将低渗液加入重悬细胞中进行一次孵育，一次孵育时至少进行一次混悬操作；
13.步骤二、向一次孵育后的细胞中加入固定液，离心得到重悬细胞；再加入固定液，进行二次孵育；
14.步骤三、将二次孵育后的细胞制片，将细胞玻片浸入1～20％的染色液中1～
20min，染色完成后采用纯水浸泡1～3次，即可。
15.在一次孵育过程中，在低渗过程中增加了混悬操作(手动旋转、摇晃混匀的操作)，使得管内细胞能充分与低渗液接触，提高低渗效率。
16.在染色过程中，优化染色液的浓度，经此方法染色的玻片，染色均匀，深浅适宜。在细胞染色完成后，通过纯水多次洗涤，更便于后期观察。
17.于本发明的一实施例中，所述步骤一中重悬细胞的制备过程为：将细胞吹打分散，细胞筛过滤，离心，即得。
18.一般而言，细胞筛的粒径不能小于40微米。
19.细胞吹打分散后，增加使用细胞筛以过滤杂质、碎片及细胞团块。
20.经细胞筛过滤后的细胞悬液，其制片过程中，产生的杂质较少，辅以低渗完成后的吸去上清中脂肪物质的操作，在后续试验操作至固定完成，离心管内产生的杂质和细胞团块较少。与传统的处理方法相比，最终在制片时，首先目视细胞悬液中几乎无杂质，移液器在吸取细胞制片时不会堵塞移液管管头；制备过程中，玻片较干净，不会有很多颗粒感的杂质从而影响中期相的呈现；染色后的玻片，在阅片时较清晰，不会因大量杂质(颗粒物质等)的存在影响阅片的进度和干扰判断。
21.于本发明的一实施例中，所述步骤一中低渗液的温度为30～40℃，所述一次孵育的孵育温度为35～40℃，所述一次孵育的孵育时间为5～40min；
22.所述步骤二中固定液的温度为-4～10℃，所述二次孵育的孵育温度为20～30℃，所述二次孵育的孵育时间为5～40min。
23.低渗液需要预先加热，与后期孵育温度相近，可以获得更好的低渗效果。
24.固定液需使用冷的固定液，最好是低温固定液，从而或者更好的分散效果，便于后期染色观察。
25.低渗液可以选用常规低渗液，如低渗氯化钠、低渗氯化钾(75mm kcl溶液)等。
26.于本发明的一实施例中，所述步骤一中低渗液的温度为35～38℃，所述一次孵育的孵育温度为36～38℃，所述一次孵育的孵育时间为20～30min；
27.所述步骤二中固定液的温度为-2～4℃，所述二次孵育的孵育温度为20～25℃，所述二次孵育的孵育时间为20～30min。
28.于本发明的一实施例中，所述步骤二中固定液为甲醇和冰醋酸的混合溶液；
29.所述步骤三的染色液为姬姆萨染色液。
30.于本发明的一实施例中，所述固定液中为甲醇与冰醋酸的体积比为(0.1～10):1；
31.所述染色液为5～15％的姬姆萨染色液，所述染色液的染色时间为5～15min。
32.在染色过程中，优化染色液的浓度，经此方法染色的玻片，染色均匀，深浅适宜。
33.于本发明的一实施例中，所述固定液中为甲醇与冰醋酸的体积比为(1～5):1；
34.所述染色液为5～10％的姬姆萨染色液，所述染色液的染色时间为5～10min。
35.于本发明的一实施例中，所述步骤三中细胞制片的过程为：将二次孵育的细胞离心去除上清液，再加入固定液，离心去除上清液制得细胞悬液，将细胞悬液滴至载玻片，即得。
36.于本发明的一实施例中，所述细胞为骨髓细胞。
37.如上所述，本发明的一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，具
有以下
38.有益效果：
39.本发明的细胞处理方法优化了低渗条件，提高低渗效率；优化染色效果，提高玻片质量进一步提升阅片效率。经此细胞处理方法染色的玻片，染色均匀，深浅适宜，既能很好的评估畸变率，也能更快的阅片。
附图说明
40.图1为现有技术处理(文献报道)的染色体中期相图谱。
41.图2为实施例1的染色体中期相图谱。
42.图3为实施例6的染色体中期相图谱。
43.图4为实施例4的染色体中期相图谱。
具体实施方式
44.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
45.实施例1
46.一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，包括如下步骤：
47.s1、骨髓的收集
48.s11动物处死后，快速取出其骨头(胫骨或股骨)，去除肌肉，然后去除骨头顶端和尾端。
49.s12管子预先充好2-3ml的hbss(hank's平衡盐溶液)，用注射器(含2-3ml的hbss)将骨髓细胞冲洗到管子中。
50.s13用注射器吸打几次以分散细胞。然后使用细胞筛过滤，将各管中的细胞分别过滤到标有对应编号的50ml离心管中，再将各管中的细胞悬液转移至对应编号的15ml离心管中。
51.s14离心管以1500rpm速度离心5分钟。离心后，移除上清，得到重悬细胞。
52.s2、低渗和固定
53.s21固定液(无水甲醇和冰醋酸以3:1比例混合)在使用前进行新鲜配制，并保存在湿冰上。
54.s22 37℃水浴条件下，分别向每个离心管中滴加10ml预热的低渗液(75mm kcl，37℃)，边加边轻轻震荡混匀。将添加低渗液后的离心管置于37℃水浴锅中孵育约25(
±
1)分钟。孵育过程中，需要时，可手动颠倒离心管几次以混悬细胞。
55.s23孵育结束后，从水浴锅中取出离心管。向每管中加入2ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后以1500rpm速度离心5分钟。
56.s24去除上清，重悬细胞，分别向每管中滴加10ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后将离心管在室温孵育至少30分钟。
57.s25孵育结束后，将离心管以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后再加入10ml冷的固定液。再次以1500rpm速度离心5分钟后去除上清至1ml，重悬细胞。
58.s3、骨髓制片
59.s31将细胞悬液保存在4℃条件下过夜或更长时间，取出后以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后加入10ml新鲜配制的固定液(温度为0～2℃)，1500rpm速度离心5分钟，去除上清至1ml，重悬细胞后进行制片。
60.s32可向每管细胞中加入适量固定液稀释细胞悬液，以调整细胞密度，再进行制片。
61.s33将几滴细胞悬液滴到干净的载玻片上，可在低倍镜下观察细胞的密度以及中期相细胞的分布情况。若需要，可以调整这一步骤以获得适宜评估的片子(如使用湿的载玻片、向载玻片吹气、从高处滴下细胞以促进扩散、将玻片放在55℃的烤片机上加热)。
62.s34制片完成后，室温干燥玻片并对玻片进行标记。剩余细胞悬液将在4℃条件下进行储存。
63.s4、染色
64.s41将制备好的骨髓玻片在纯水中浸泡5(
±
1)分钟，然后取出浸泡完的涂片，在新鲜配制的10％姬姆萨染色液(1份吉姆萨染色加入到9份去离子水中，室温，现用现配)中浸泡10(
±
1)分钟。
65.s42取出染色后的涂片，置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟，取出后再置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟。
66.s43待玻片室温自然干燥后，用透明剂(如范氏)浸泡玻片，然后用封片剂(如范氏)以盖玻片进行封片。
67.实施例2
68.一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，包括如下步骤：
69.s1、骨髓的收集
70.s11动物处死后，快速取出其骨头(胫骨或股骨)，去除肌肉，然后去除骨头顶端和尾端。
71.s12管子预先充好2-3ml的hbss(hank's平衡盐溶液)，用注射器(含2-3ml的hbss)将骨髓细胞冲洗到管子中。
72.s13用注射器吸打几次以分散细胞。然后使用细胞筛过滤，将各管中的细胞分别过滤到标有对应编号的50ml离心管中，再将各管中的细胞悬液转移至对应编号的15ml离心管中。
73.s14离心管以1500rpm速度离心5分钟。离心后，移除上清，得到重悬细胞。
74.s2、低渗和固定
75.s21固定液(无水甲醇和冰醋酸以3:1比例混合)在使用前进行新鲜配制，并保存在湿冰上。
76.s22 37℃水浴条件下，分别向每个离心管中滴加10ml预热的低渗液(37℃)，边加边轻轻震荡混匀。将添加低渗液后的离心管置于37℃水浴锅中孵育约5(
±
1)分钟。孵育过程中，需要时，可手动颠倒离心管几次以混悬细胞。
77.s23孵育结束后，从水浴锅中取出离心管。向每管中加入2ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后以1500rpm速度离心5分钟。
78.s24去除上清，重悬细胞，分别向每管中滴加10ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后将离心管在室温孵育至少30分钟。
79.s25孵育结束后，将离心管以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后再加入10ml冷的固定液。再次以1500rpm速度离心5分钟后去除上清至1ml，重悬细胞。
80.s3、骨髓制片
81.s31将细胞悬液保存在4℃条件下过夜或更长时间，取出后以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后加入10ml新鲜配制的固定液(温度为0～2℃)，1500rpm速度离心5分钟，去除上清至1ml，重悬细胞后进行制片。
82.s32可向每管细胞中加入适量固定液稀释细胞悬液，以调整细胞密度，再进行制片。
83.s33将几滴细胞悬液滴到干净的载玻片上，可在低倍镜下观察细胞的密度以及中期相细胞的分布情况。若需要，可以调整这一步骤以获得适宜评估的片子(如使用湿的载玻片、向载玻片吹气、从高处滴下细胞以促进扩散、将玻片放在55℃的烤片机上加热)。
84.s34制片完成后，室温干燥玻片并对玻片进行标记。剩余细胞悬液将在4℃条件下进行储存。
85.s4、染色
86.s41将制备好的骨髓玻片在纯水中浸泡5(
±
1)分钟，然后取出浸泡完的涂片，在新鲜配制的10％姬姆萨染色液(1份吉姆萨染色加入到9份去离子水中，室温，现用现配)中浸泡10(
±
1)分钟。
87.s42取出染色后的涂片，置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟，取出后再置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟。
88.s43待玻片室温自然干燥后，用透明剂(如范氏)浸泡玻片，然后用封片剂(如范氏)以盖玻片进行封片。
89.实施例3
90.一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，包括如下步骤：
91.s1、骨髓的收集
92.s11动物处死后，快速取出其骨头(胫骨或股骨)，去除肌肉，然后去除骨头顶端和尾端。
93.s12管子预先充好2-3ml的hbss(hank's平衡盐溶液)，用注射器(含2-3ml的hbss)将骨髓细胞冲洗到管子中。
94.s13用注射器吸打几次以分散细胞。然后使用细胞筛过滤，将各管中的细胞分别过滤到标有对应编号的50ml离心管中，再将各管中的细胞悬液转移至对应编号的15ml离心管中。
95.s14离心管以1500rpm速度离心5分钟。离心后，移除上清，得到重悬细胞。
96.s2、低渗和固定
97.s21固定液(无水甲醇和冰醋酸以3:1比例混合)在使用前进行新鲜配制，并保存在湿冰上。
98.s22 37℃水浴条件下，分别向每个离心管中滴加10ml预热的低渗液(37℃)，边加边轻轻震荡混匀。将添加低渗液后的离心管置于37℃水浴锅中孵育约15(
±
1)分钟。孵育过程中，需要时，可手动颠倒离心管几次以混悬细胞。
99.s23孵育结束后，从水浴锅中取出离心管。向每管中加入2ml湿冰上的固定液，边加
边轻轻震荡混匀。然后以1500rpm速度离心5分钟。
100.s24去除上清，重悬细胞，分别向每管中滴加10ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后将离心管在室温孵育至少30分钟。
101.s25孵育结束后，将离心管以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后再加入10ml冷的固定液。再次以1500rpm速度离心5分钟后去除上清至1ml，重悬细胞。
102.s3、骨髓制片
103.s31将细胞悬液保存在4℃条件下过夜或更长时间，取出后以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后加入10ml新鲜配制的固定液(温度为0～2℃)，1500rpm速度离心5分钟，去除上清至1ml，重悬细胞后进行制片。
104.s32可向每管细胞中加入适量固定液稀释细胞悬液，以调整细胞密度，再进行制片。
105.s33将几滴细胞悬液滴到干净的载玻片上，可在低倍镜下观察细胞的密度以及中期相细胞的分布情况。若需要，可以调整这一步骤以获得适宜评估的片子(如使用湿的载玻片、向载玻片吹气、从高处滴下细胞以促进扩散、将玻片放在55℃的烤片机上加热)。
106.s34制片完成后，室温干燥玻片并对玻片进行标记。剩余细胞悬液将在4℃条件下进行储存。
107.s4、染色
108.s41将制备好的骨髓玻片在纯水中浸泡5(
±
1)分钟，然后取出浸泡完的涂片，在新鲜配制的10％姬姆萨染色液(1份吉姆萨染色加入到9份去离子水中，室温，现用现配)中浸泡10(
±
1)分钟。
109.s42取出染色后的涂片，置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟，取出后再置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟。
110.s43待玻片室温自然干燥后，用透明剂(如范氏)浸泡玻片，然后用封片剂(如范氏)以盖玻片进行封片。
111.实施例4
112.一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，包括如下步骤：
113.s1、骨髓的收集
114.s11动物处死后，快速取出其骨头(胫骨或股骨)，去除肌肉，然后去除骨头顶端和尾端。
115.s12管子预先充好2-3ml的hbss(hank's平衡盐溶液)，用注射器(含2-3ml的hbss)将骨髓细胞冲洗到管子中。
116.s13用注射器吸打几次以分散细胞。然后使用细胞筛过滤，将各管中的细胞分别过滤到标有对应编号的50ml离心管中，再将各管中的细胞悬液转移至对应编号的15ml离心管中。
117.s14离心管以1500rpm速度离心5分钟。离心后，移除上清，得到重悬细胞。
118.s2、低渗和固定
119.s21固定液(无水甲醇和冰醋酸以3:1比例混合)在使用前进行新鲜配制，并保存在湿冰上。
120.s22 37℃水浴条件下，分别向每个离心管中滴加10ml预热的低渗液(37℃)，边加
边轻轻震荡混匀。将添加低渗液后的离心管置于37℃水浴锅中孵育约30(
±
1)分钟。孵育过程中，需要时，可手动颠倒离心管几次以混悬细胞。
121.s23孵育结束后，从水浴锅中取出离心管。向每管中加入2ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后以1500rpm速度离心5分钟。
122.s24去除上清，重悬细胞，分别向每管中滴加10ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后将离心管在室温孵育至少30分钟。
123.s25孵育结束后，将离心管以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后再加入10ml冷的固定液。再次以1500rpm速度离心5分钟后去除上清至1ml，重悬细胞。
124.s3、骨髓制片
125.s31将细胞悬液保存在4℃条件下过夜或更长时间，取出后以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后加入10ml新鲜配制的固定液(温度为0～2℃)，1500rpm速度离心5分钟，去除上清至1ml，重悬细胞后进行制片。
126.s32可向每管细胞中加入适量固定液稀释细胞悬液，以调整细胞密度，再进行制片。
127.s33将几滴细胞悬液滴到干净的载玻片上，可在低倍镜下观察细胞的密度以及中期相细胞的分布情况。若需要，可以调整这一步骤以获得适宜评估的片子(如使用湿的载玻片、向载玻片吹气、从高处滴下细胞以促进扩散、将玻片放在55℃的烤片机上加热)。
128.s34制片完成后，室温干燥玻片并对玻片进行标记。剩余细胞悬液将在4℃条件下进行储存。
129.s4、染色
130.s41将制备好的骨髓玻片在纯水中浸泡5(
±
1)分钟，然后取出浸泡完的涂片，在新鲜配制的10％姬姆萨染色液(1份吉姆萨染色加入到9份去离子水中，室温，现用现配)中浸泡10(
±
1)分钟。
131.s42取出染色后的涂片，置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟，取出后再置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟。
132.s43待玻片室温自然干燥后，用透明剂(如范氏)浸泡玻片，然后用封片剂(如范氏)以盖玻片进行封片。
133.实施例5
134.一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，包括如下步骤：
135.s1、骨髓的收集
136.s11动物处死后，快速取出其骨头(胫骨或股骨)，去除肌肉，然后去除骨头顶端和尾端。
137.s12管子预先充好2-3ml的hbss(hank's平衡盐溶液)，用注射器(含2-3ml的hbss)将骨髓细胞冲洗到管子中。
138.s13用注射器吸打几次以分散细胞。然后使用细胞筛过滤，将各管中的细胞分别过滤到标有对应编号的50ml离心管中，再将各管中的细胞悬液转移至对应编号的15ml离心管中。
139.s14离心管以1500rpm速度离心5分钟。离心后，移除上清，得到重悬细胞。
140.s2、低渗和固定
141.s21固定液(无水甲醇和冰醋酸以3:1比例混合)在使用前进行新鲜配制，并保存在湿冰上。
142.s22 37℃水浴条件下，分别向每个离心管中滴加10ml预热的低渗液(37℃)，边加边轻轻震荡混匀。将添加低渗液后的离心管置于37℃水浴锅中孵育约40(
±
1)分钟。孵育过程中，需要时，可手动颠倒离心管几次以混悬细胞。
143.s23孵育结束后，从水浴锅中取出离心管。向每管中加入2ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后以1500rpm速度离心5分钟。
144.s24去除上清，重悬细胞，分别向每管中滴加10ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后将离心管在室温孵育至少30分钟。
145.s25孵育结束后，将离心管以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后再加入10ml冷的固定液。再次以1500rpm速度离心5分钟后去除上清至1ml，重悬细胞。
146.s3、骨髓制片
147.s31将细胞悬液保存在4℃条件下过夜或更长时间，取出后以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后加入10ml新鲜配制的固定液(温度为0～2℃)，1500rpm速度离心5分钟，去除上清至1ml，重悬细胞后进行制片。
148.s32可向每管细胞中加入适量固定液稀释细胞悬液，以调整细胞密度，再进行制片。
149.s33将几滴细胞悬液滴到干净的载玻片上，可在低倍镜下观察细胞的密度以及中期相细胞的分布情况。若需要，可以调整这一步骤以获得适宜评估的片子(如使用湿的载玻片、向载玻片吹气、从高处滴下细胞以促进扩散、将玻片放在55℃的烤片机上加热)。
150.s34制片完成后，室温干燥玻片并对玻片进行标记。剩余细胞悬液将在4℃条件下进行储存。
151.s4、染色
152.s41将制备好的骨髓玻片在纯水中浸泡5(
±
1)分钟，然后取出浸泡完的涂片，在新鲜配制的10％姬姆萨染色液(1份吉姆萨染色加入到9份去离子水中，室温，现用现配)中浸泡10(
±
1)分钟。
153.s42取出染色后的涂片，置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟，取出后再置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟。
154.s43待玻片室温自然干燥后，用透明剂(如范氏)浸泡玻片，然后用封片剂(如范氏)以盖玻片进行封片。
155.实施例1～5的主要区别在于低渗时长不同，其最优的低渗时间为25min。25min的低渗处理时间，其良好的中期相细胞较多，可为获得充足的计数细胞。
156.实施例6
157.一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，包括如下步骤：
158.s1、骨髓的收集
159.s11动物处死后，快速取出其骨头(胫骨或股骨)，去除肌肉，然后去除骨头顶端和尾端。
160.s12管子预先充好2-3ml的hbss(hank's平衡盐溶液)，用注射器(含2-3ml的hbss)将骨髓细胞冲洗到管子中。
161.s13用注射器吸打几次以分散细胞。然后使用细胞筛过滤，将各管中的细胞分别过滤到标有对应编号的50ml离心管中，再将各管中的细胞悬液转移至对应编号的15ml离心管中。
162.s14离心管以1500rpm速度离心5分钟。离心后，移除上清，得到重悬细胞。
163.s2、低渗和固定
164.s21固定液(无水甲醇和冰醋酸以3:1比例混合)在使用前进行新鲜配制，并保存在湿冰上。
165.s22 37℃水浴条件下，分别向每个离心管中滴加10ml预热的低渗液(37℃)，边加边轻轻震荡混匀。将添加低渗液后的离心管置于37℃水浴锅中孵育约25(
±
1)分钟。孵育过程中，需要时，可手动颠倒离心管几次以混悬细胞。
166.s23孵育结束后，从水浴锅中取出离心管。向每管中加入2ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后以1500rpm速度离心5分钟。
167.s24去除上清，重悬细胞，分别向每管中滴加10ml湿冰上的固定液，边加边轻轻震荡混匀。然后将离心管在室温孵育至少30分钟。
168.s25孵育结束后，将离心管以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后再加入10ml冷的固定液。再次以1500rpm速度离心5分钟后去除上清至1ml，重悬细胞。
169.s3、骨髓制片
170.s31将细胞悬液保存在4℃条件下过夜或更长时间，取出后以1500rpm速度离心5分钟。去除上清至1ml，重悬细胞后加入10ml新鲜配制的固定液(温度为0～2℃)，1500rpm速度离心5分钟，去除上清至1ml，重悬细胞后进行制片。
171.s32可向每管细胞中加入适量固定液稀释细胞悬液，以调整细胞密度，再进行制片。
172.s33将几滴细胞悬液滴到干净的载玻片上，可在低倍镜下观察细胞的密度以及中期相细胞的分布情况。若需要，可以调整这一步骤以获得适宜评估的片子(如使用湿的载玻片、向载玻片吹气、从高处滴下细胞以促进扩散、将玻片放在55℃的烤片机上加热)。
173.s34制片完成后，室温干燥玻片并对玻片进行标记。剩余细胞悬液将在4℃条件下进行储存。
174.s4、染色
175.s41将制备好的骨髓玻片在纯水中浸泡5(
±
1)分钟，然后取出浸泡完的涂片，在新鲜配制的5％姬姆萨染色液(5份吉姆萨染色加入到95份去离子水中，室温，现用现配)中浸泡5(
±
1)分钟。
176.s42取出染色后的涂片，置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟，取出后再置于新鲜纯水中浸泡5(
±
1)分钟。
177.s43待玻片室温自然干燥后，用透明剂(如范氏)浸泡玻片，然后用封片剂(如范氏)以盖玻片进行封片。
178.实施例1和实施例6两者均具有良好的阅片效果。
179.实施例1染色体染色偏深，利于评判单体畸变类型，具体见图2。
180.实施例6的染色体颜色较佳，利于阅片和辨别畸变类型，具体见图3。
181.综上所述，本发明的细胞处理方法优化了低渗条件，提高低渗效率；优化染色效
果，提高玻片质量进一步提升阅片效率。经此细胞处理方法染色的玻片，染色均匀，深浅适宜，既能很好的评估畸变率，也能更快的阅片。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
182.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

技术特征：
1.一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、将低渗液加入重悬细胞中，进行一次孵育；步骤二、向一次孵育后的细胞中加入固定液，进行二次孵育；步骤三、将二次孵育后的细胞制片，将细胞玻片浸入1～20％的染色液中1～20min，即可。2.根据权利要求1所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一、将低渗液加入重悬细胞中进行一次孵育，一次孵育时至少进行一次混悬操作；步骤二、向一次孵育后的细胞中加入固定液，离心得到重悬细胞；再加入固定液，进行二次孵育；步骤三、将二次孵育后的细胞制片，将细胞玻片浸入1～20％的染色液中1～20min，即可。3.根据权利要求1或2所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：所述步骤一中重悬细胞的制备过程为：将细胞吹打分散，细胞筛过滤，离心，即得。4.根据权利要求1或2所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：所述步骤一中低渗液的温度为30～40℃，所述一次孵育的孵育温度为35～40℃，所述一次孵育的孵育时间为5～40min；所述步骤二中固定液的温度为-4～10℃，所述二次孵育的孵育温度为35～40℃，所述二次孵育的孵育时间为5～40min。5.根据权利要求1或2所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：所述步骤一中低渗液的温度为35～38℃，所述一次孵育的孵育温度为36～38℃，所述一次孵育的孵育时间为20～30min；所述步骤二中固定液的温度为-2～4℃，所述二次孵育的孵育温度为36～38℃，所述二次孵育的孵育时间为20～30min。6.根据权利要求1或2所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：所述步骤二中固定液为甲醇和冰醋酸的混合溶液；所述步骤三的染色液为姬姆萨染色液。7.根据权利要求6所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：所述固定液中为甲醇与冰醋酸的体积比为(0.1～10):1；所述染色液为5～15％的姬姆萨染色液，所述染色液的染色时间为5～15min。8.根据权利要求7所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：所述固定液中为甲醇与冰醋酸的体积比为(1～5):1；所述染色液为5～10％的姬姆萨染色液，所述染色液的染色时间为5～10min。9.根据权利要求1或2所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：所述步骤三中细胞制片的过程为：将二次孵育的细胞离心去除上清液，再加入固定液，离心去除上清液制得细胞悬液，将细胞悬液滴至载玻片，即得。10.根据权利要求1或2所述的用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，其特征在于：所述细胞为骨髓细胞。

技术总结
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别是涉及一种用于优化遗传毒理染色体畸变试验的细胞处理方法，包括：将低渗液加入重悬细胞中，进行一次孵育；向一次孵育后的细胞中加入固定液，进行二次孵育；将二次孵育后的细胞制片，将细胞玻片浸入1～20％的染色液中1～20min，即可。本发明的细胞处理方法优化了低渗条件，提高低渗效率；优化染色效果，提高玻片质量进一步提升阅片效率。经此细胞处理方法染色的玻片，染色均匀，深浅适宜，既能很好的评估畸变率，也能更快的阅片。也能更快的阅片。也能更快的阅片。


技术研发人员：单翔 乐聪 徐宁 康明珠 陈瑶瑶 高立文
受保护的技术使用者：苏州药明康德新药开发有限公司
技术研发日：2022.12.30
技术公布日：2023/7/12