一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片

1.本发明涉及微流控芯片技术领域，具体涉及一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片。


背景技术：

2.循环肿瘤细胞ctc是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。由于ctc在进入外周血后大部分会发生凋亡或被吞噬，因此目前获取外周血中的ctc主要用于肿瘤的检测。ctc通常被认定为表达上皮标记细胞角蛋白ck、上皮细胞粘附分子epcam但不表达cd45的有核细胞。但是，当前通过识别上皮特异性标记物捕获ctc技术的缺点是没法检测经上皮-间质转化emt后不再过表达epcam的ctc。
3.现有的分离ctc的方法主要有：1）肿瘤标志物的磁珠分选（包括epcam，ck8、ck18、ck19等）；2）免疫细胞cd45标志物磁珠分选、负筛、分离免疫细胞；3）密度梯度离心方法：需要的血液量大，杂质多；4）过滤：可能损失较小的肿瘤细胞，还需根据肿瘤的不同制定不同的滤膜，生产要求高；5）特殊的仪器装置：门槛高、价格昂贵。目前，使用现有筛选方法的ctc难以在体外生长，其中一个可能的原因是使用细胞表面标记物（epcam）捕获ctc会阻碍后续细胞培养中的细胞粘附和增殖。而使用物理方法如离心、过滤等也可能会对细胞造成物理损伤。假设在不阻断细胞表面标记的情况下捕获ctc，可能是体外扩增细胞并保持捕获的ctc表型的可靠方法。近年来ctc检测技术不断发展，由于不同的富集和检测方法，在临床实践中ctc的检测方法尚未标准化，其主要应用仍局限于简单的计数与肿瘤转移能力的判断。
4.在外周血中的ctc中具有少量侵袭性较高的ctc，这一类群的ctc在外周血循环过程中更容易被特定环境所吸引，进而产生贴附和浸润，最终形成远端转移。如果能够针对此类群的ctc进行有效的捕获，培养，并用于体外抗癌药物的药敏测试，则有望能够筛选出对肿瘤转移更有针对性的治疗药物，这对于肿瘤患者治疗具有极为重要的意义。
5.目前基于微流控芯片方法对ctc的分离也有一定的研究，较为常见的策略是采用物理的方式；许多研究强调了ctc的物理和生物力学特性，使其能够与其他血细胞区分开来。大多数ctc的尺寸（17～52 μm）与红细胞（6～8 μm）和白细胞相比（大多数为7～15 μm，单核细胞为20 μm）更大，核质比更高，膜折叠复杂。可以通过采用不同孔径的滤膜或在芯片中设置间距不同的微柱阵列从血液中分离ctc。但是这种方法在处理大量细胞时存在易堵塞的问题。同时，其分离得到的ctc纯度较低。当流速控制不当时，还会对细胞造成物理损伤。此方法仅适用于分选ctc，不能用于分选高侵袭性的ctc。采用微流控芯片的方法对ctc分离的另一策略是采用生物学的方式，多采用抗原和抗体亲和性，针对ctc表面的特有标志物（如epcam等），在微流控芯片的流道表面修饰特异性抗体，在细胞悬液经过流道时，ctc会与抗体发生特异性结合，从而捕获ctc。另一种思路是分别将ctc特异性抗体（如epcam等）、白细胞特异性抗体（如cd45等）与磁珠相结合，制成免疫磁珠，免疫磁珠会分别与ctc、白细胞发生特异性结合，再通过磁场两级的吸附与排斥将结合ctc的免疫磁珠吸附，将结合白细胞的磁珠分离，即可实现对ctc的捕获。但是这种方法修饰的抗体总量是一定的，当处理的
细胞量超出抗体总量时，存在部分细胞无法与抗体结合，造成丢失。因此处理样本的通量往往较低，而免疫磁珠法则需要对处理样品进行免疫磁珠的预标记。但是捕获的ctc均带有特异性抗体，无法实现对ctc的无标记捕获，对ctc的下游分析带来困难。同时这种方法也只能捕获ctc，无法分选出高侵袭性的ctc。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术存在的问题提供一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片。
7.本发明采用的技术方案是：一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，包括从上到下依次叠置的上层、中间层和下层；上层上设置有细胞悬液灌流通道；细胞悬液灌流通道两端分别设置有第一进液口和第一出液口；下层对应细胞悬液灌流通道位置设置有白细胞趋化分离区和ctc趋化捕获区；中间层包括第一pet膜和第二pet膜；第一pet膜设置于白细胞趋化分离区对应位置，第二pet膜设置于ctc趋化捕获区对应位置；白细胞趋化分离区的第二进液口、第二出液口在上层对应位置均设置有通孔；ctc趋化捕获区的第三进液口和第三出液口在上层对应位置均设置有通孔。
8.进一步的，所述细胞悬液灌流通道主体为长方形结构，两端为三角形结构；三角形顶点位置分别对应第一进液口和第一出液口。
9.进一步的，所述白细胞趋化分离区和第二进液口通过第一进液通道连通，和第二出液口通过第一出液通道连通；ctc趋化捕获区和第三进液口通过第二进液通道连通，和第三出液口通过第二出液通道连通。
10.进一步的，所述白细胞趋化分离区主体为长方形结构，两端为三角形结构，三角形顶点位置分别对应第一进液通道和第一出液通道一端；ctc趋化捕获区主体为长方形结构，两端为三角形结构，三角形顶点位置分别对应第二进液通道和第二出液通道一端。
11.进一步的，所述第二进液口连通设置在上层的第一通孔，第二出液口连通设置在上层的第二通孔；第三进液口连通设置在上层的第四通孔，第三出液口连通设置在上层的第三通孔。
12.进一步的，所述第一进液口和第一出液口对应三角形顶角均小于45
°
。
13.进一步的，所述第一进液通道和第一出液通道对应三角形顶角均小于45
°
；第二进液通道和第二出液通道对应三角形顶角均小于45
°
。
14.进一步的，所述第一pet膜覆盖白细胞趋化分离区，第二pet膜覆盖ctc趋化捕获区；所述第一pet膜微孔尺寸小于8 μm，第二pet膜微孔尺寸大于8 μm。
15.进一步的，所述细胞悬液灌流通道流速范围为0.1 ul/min～4 ml/min。
16.进一步的，所述上层和下层为聚二甲硅氧烷制备。
17.本发明的有益效果是：（1）本发明经过趋化作用处理，能够处理掉95%～97%的白细胞，能够无标记的分离捕获ctc。
18.（2）本发明经过对侵袭性相关的蛋白进行免疫荧光染色表征证实经过芯片分离到的ctc具有更强的侵袭性，并且其在芯片中能够保持长时间培养；
（3）本发明对高侵袭性ctc的捕获和培养打破了传统ctc分选仅用于计数的局限，拓宽了ctc用于开展下游分析及药物测试等其他方面的应用。
附图说明
19.图1为本发明结构爆炸图。
20.图2为采用本芯片未捕获ctc的染色效果示意图，a为dapi染色效果，b为mmp-2染色效果，c为mmp-9染色效果，d为dapi、mmp-2、mmp-9三种染色叠加效果。
21.图3为采用本芯片捕获ctc的染色效果示意图，a为dapi染色效果，b为mmp-2染色效果，c为mmp-9染色效果，d为dapi、mmp-2、mmp-9三种染色叠加效果。
22.图中：1-上层，101-细胞悬液灌流通道，102-第一进液口，103-第一出液口，104-第一通孔，105-第二通孔，106-第三通孔，107-第四通孔，201-第一pet膜，202-第二pet膜，3-下层，301-白细胞趋化分离区，302-ctc趋化捕获区，303-第一进液通道，304-第二出液通道，305-第二进液口，306-第二出液口，307-第三进液口，308-第三出液口，309-第一出液通道，310-第二进液通道。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
24.如图1所示，一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，包括从上到下依次叠置的上层1、中间层和下层3；上层1上设置有细胞悬液灌流通道101；细胞悬液灌流通道两端分别设置有第一进液口102和第一出液口103；下层3对应细胞悬液灌流通道101位置设置有白细胞趋化分离区301和ctc趋化捕获区302；中间层包括第一pet膜201和第二pet膜202；第一pet膜201设置于白细胞趋化分离区301对应位置，第二pet膜202设置于ctc趋化捕获区302对应位置；白细胞趋化分离区301的第二进液口305、第二出液口306在上层1对应位置均设置有通孔；ctc趋化捕获区302的第三进液口307和第三出液口308在上层1对应位置均设置有通孔。第一pet膜201和第二pet膜202的宽度相同，略宽于细胞悬液灌流通道101。第一pet膜201长度大于第二pet膜202的长度，并且第二pet膜202的长度为第一pet膜201的一半。第一pet膜201微孔尺寸为小于8 μm，本实施例选择5 μm，第二pet膜202微孔尺寸大于8 μm，本实施例选择10 μm。这种结构使得血细胞可以通过第一pet膜201进入白细胞趋化分离区301，肿瘤细胞可以通过第二pet膜202进入ctc趋化捕获区302。其中白细胞趋化分离区301尺寸略小于第一pet膜201，能够被其完全覆盖。ctc趋化捕获区302尺寸略小于第二pet膜202，能够被其完全覆盖。
25.细胞悬液灌流通道101主体为长方形结构，两端为三角形结构；三角形顶点位置分别对应第一进液口102和第一出液口103。这种结构使得细胞在注入过程中不易粘附在侧壁上。细胞悬液灌流通道101流速范围在0.1 ul/min-4 ml/min。
26.白细胞趋化分离区301和第二进液口305通过第一进液通道303连通，和第二出液口306通过第一出液通道309连通；ctc趋化捕获区302和第三进液口307通过第二进液通道310连通，和第三出液口308通过第二出液通道304连通。通过第一进液通道303和第二进液通道310注入培养基或水凝胶材料。
27.白细胞趋化分离区301主体为长方形结构，两端为三角形结构，三角形顶点位置分
别对应第一进液通道303和第一出液通道309一端；ctc趋化捕获区302主体为长方形结构，两端为三角形结构，三角形顶点位置分别对应第二进液通道310和第二出液通道304一端。这种结构使得白细胞趋化分离区301和ctc趋化捕获区302构成六边形结构。
28.第二进液口305连通设置在上层1的第一通孔104，第二出液口306连通设置在上层1的第二通孔105；第三进液口307连通设置在上层1的第四通孔107，第三出液口308连通设置在上层1的第三通孔106。
29.第一进液口102和第一出液口103对应三角形顶角均小于45
°
。第一进液通道303和第一出液通道309对应三角形顶角均小于45
°
；第二进液通道310和第二出液通道304对应三角形顶角均小于45
°
。
30.上层1和下层3为聚二甲硅氧烷制备。通过真空等离子键合的方法将三层结构合并为一个整体。
31.使用时，按照以下方法进行：步骤1：取10毫升全血样本，采用红细胞裂解液对样本进行预处理，裂解掉红细胞，得到白细胞和ctc的混合细胞重悬于10 ml无血清rpmi-1640培养基中备用。
32.步骤2：取白细胞趋化因子（c5a、il-2等，不局限于此两种）与无血清rpmi-1640培养基混合制备白细胞趋化培养基。
33.步骤3：取ctc趋化因子（tgf-β、fgf、igf、egf等，不局限于以上四种）与含10～15%血清的甲基丙烯酰化明胶混合制备ctc捕获基质。
34.步骤4：分别将白细胞趋化培养基、ctc捕获基质注入到芯片的白细胞趋化分离区301、ctc趋化捕获区302中，用塞子封闭注液口，用紫外灯照射甲基丙烯酰化明胶20秒，使液体状态的基质固化为水凝胶状态。
35.步骤5：将装有混合细胞悬液的储存管用两根软管与芯片顶层的细胞悬液进液口和出液口（即-第一进液口102和第一出液口103）相连接，形成一个封闭的液体循环灌流体系，以蠕动泵为动力，驱动储存管内的细胞悬液以一个稳定的流速流经芯片，再返回储存管。液体的流速可以参考人体毛细血管网末梢静脉血管的血液流速设置，以模拟人体内外周血循环的环境。液体循环时间控制在24～48 h，在此期间，芯片及细胞悬液储存管均放置于5%二氧化碳培养箱中适合细胞培养的环境。
36.步骤6：24～48 h后，混合细胞悬液中的白细胞已被大量趋化迁移至下层白细胞趋化分离区301内，高侵袭性ctc也将发生趋化迁移作用从芯片上层1迁移至ctc捕获区的水凝胶材料中。此时，可将细胞悬液储存管更换为营养物质培养基储存管，继续维持液体灌流，使被捕获的高侵袭性ctc能够在水凝胶材料中继续培养生长，以用作下游分析。
37.本发明经过趋化作用处理，能够处理掉95%～97%的白细胞，并能够无标记的分离捕获ctc，经过对侵袭性相关的蛋白mmp-2及mmp-9进行免疫荧光染色表征，表征结果如图2和图3所示。图2为采用本芯片未捕获ctc的染色效果示意图，图3为采用本芯片捕获ctc的染色效果示意图。从图中可以看出，经过芯片分离到的ctc分泌产生了更大量的侵袭性相关蛋白，证实了经过芯片分离到的ctc具有更强的侵袭性。并且其在芯片中能够保持长时间培养。为ctc的无标记分选提供了一种全新的分离思路和方法，对高侵袭性ctc的捕获和培养打破了传统ctc分选仅用于计数的局限，拓宽了ctc用于开展下游分析及药物测试等其他方面的应用，具有较强的应用价值。

技术特征：
1.一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，包括从上到下依次叠置的上层（1）、中间层和下层（3）；上层（1）上设置有细胞悬液灌流通道（101）；细胞悬液灌流通道两端分别设置有第一进液口（102）和第一出液口（103）；下层（3）对应细胞悬液灌流通道（101）位置设置有白细胞趋化分离区（301）和ctc趋化捕获区（302）；中间层包括第一pet膜（201）和第二pet膜（202）；第一pet膜（201）设置于白细胞趋化分离区（301）对应位置，第二pet膜（202）设置于ctc趋化捕获区（302）对应位置；白细胞趋化分离区（301）的第二进液口（305）、第二出液口（306）在上层（1）对应位置均设置有通孔；ctc趋化捕获区（302）的第三进液口（307）和第三出液口（308）在上层（1）对应位置均设置有通孔。2.根据权利要求1所述一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述细胞悬液灌流通道（101）主体为长方形结构，两端为三角形结构；三角形顶点位置分别对应第一进液口（102）和第一出液口（103）。3.根据权利要求1所述的一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述白细胞趋化分离区（301）和第二进液口（305）通过第一进液通道（303）连通，和第二出液口（306）通过第一出液通道（309）连通；ctc趋化捕获区（302）和第三进液口（307）通过第二进液通道（310）连通，和第三出液口（308）通过第二出液通道（304）连通。4.根据权利要求3所述的一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述白细胞趋化分离区（301）主体为长方形结构，两端为三角形结构，三角形顶点位置分别对应第一进液通道（303）和第一出液通道（309）一端；ctc趋化捕获区（302）主体为长方形结构，两端为三角形结构，三角形顶点位置分别对应第二进液通道（310）和第二出液通道（304）一端。5.根据权利要求3所述的一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述第二进液口（305）连通设置在上层（1）的第一通孔（104），第二出液口（306）连通设置在上层（1）的第二通孔（105）；第三进液口（307）连通设置在上层（1）的第四通孔（107），第三出液口（308）连通设置在上层（1）的第三通孔（106）。6.根据权利要求2所述的一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述第一进液口（102）和第一出液口（103）对应三角形顶角均小于45
°
。7.根据权利要求4所述的一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述第一进液通道（303）和第一出液通道（309）对应三角形顶角均小于45
°
；第二进液通道（310）和第二出液通道（304）对应三角形顶角均小于45
°
。8.根据权利要求1所述的一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述第一pet膜（201）覆盖白细胞趋化分离区（301），第二pet膜覆盖ctc趋化捕获区（302）；所述第一pet膜（201）微孔尺寸小于8 μm，第二pet膜（202）微孔尺寸大于8 μm。9.根据权利要求1所述的一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述细胞悬液灌流通道（101）流速范围为0.1 ul/min～4 ml/min。10.根据权利要求1所述的一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，其特征在于，所述上层（1）和下层（3）为聚二甲硅氧烷制备。

技术总结
本发明涉及微流控芯片技术领域，公开了一种无标记的高侵袭性循环肿瘤细胞捕获、培养芯片，包括从上到下依次叠置的上层、中间层和下层；上层上设置有细胞悬液灌流通道；细胞悬液灌流通道两端分别设置有第一进液口和第一出液口；下层对应细胞悬液灌流通道位置设置有白细胞趋化分离区和CTC趋化捕获区；中间层包括第一PET膜和第二PET膜；第一PET膜设置于白细胞趋化分离区对应位置，第二PET膜设置于CTC趋化捕获区对应位置；本发明能够无标记的捕获外周血中高侵袭性的CTC，可用于临床肿瘤药物筛选，能够筛选出对肿瘤转移更有针对性的治疗药物。物。物。


技术研发人员：王书崎 吴迪 武国华 刘慧 颜小皓
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/7/12