一种基因组DNA提取试剂盒及基因组DNA的提取方法与流程

一种基因组dna提取试剂盒及基因组dna的提取方法
技术领域
1.本技术涉及dna提取的技术领域，具体涉及一种基因组dna提取试剂盒及基因组dna的提取方法。


背景技术：

2.随着测序技术的发展，第三代测序即单分子测序技术，近几年发展迅速。其特点是可以基于基因组层面的de novo组装和重测序，可以实现对每一条dna分子的单独测序；不依赖于pcr扩增的三代测序技术对基因组dna的总量、纯度等要求很高，是测序成功的关键所在。
3.比较经典的ctab（十六烷基三甲基溴化铵）方法需要搭配酚氯仿等有毒试剂进行杂质的去除，而硅胶吸附膜方法由于离心力的剪切作用，会损伤基因组的完整性。采用离子交换的原理提取基因组dna，所提核酸的完整性较好，纯度高，特别适合大分子核酸提取，可适用于三代测序。
4.针对一些油脂含量高的海洋样本、几丁质含量高的昆虫样本，此类样本次生代谢产物多，会干扰基因组dna的分离并影响纯度。因此，开发出一款普适性强的三代测序基因组dna提取试剂盒是非常迫切的需求。


技术实现要素：

5.为了提高基因组dna提取方法的普适性，同时保证所提基因组dna的得率和纯度，本技术提供一种基因组dna提取试剂盒及基因组dna的提取方法。
6.第一方面，本技术提供一种基因组dna提取试剂盒，所述基因组dna提取试剂盒包括组织保存液、裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液；所述组织保存液包含500-1000mm的nacl、5-15mm且ph为7.5-9.0的tris-cl、10-75mm的edta、0.5-2%(v/v)的triton
®ꢀ
x-100、0.5-2%的十二烷基硫酸钠；所述平衡结合液、漂洗液、洗脱液中盐离子浓度的大小关系为平衡结合液《漂洗液《洗脱液。
7.本技术利用上述组织保存液和裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液组成基因组dna提取试剂盒，可以最大程度的保护核酸，提高基因组dna的得率和纯度，可用于提取海洋动物和昆虫等样本，普适性强。利用该试剂盒提取到的基因组dna完整性大于30kb，得率高，od260/280和od260/230纯度好，能够满足三代测序基因组dna的需求。
8.优选地，所述基因组dna提取试剂盒还包括cs1组织过滤器；所述cs1组织过滤器包含30ml注射器、两层20um筛板、一层无纺布。
9.优选地，所述基因组dna提取试剂盒还包括deae（二乙基氨基乙基）弱阴离子交换树脂；所述deae弱阴离子交换树脂是二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉，粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联deae基团2-3μmol。
10.进一步地，所述deae弱阴离子交换树脂填充于耗材中制作成dna吸附柱。
11.本技术提供的cs1组织过滤器可以初步过滤掉杂质，流出液在适当盐离子及ph值的平衡结合液的条件下，利用重力流条件，释放出来的基因组dna结合于deae弱阴离子交换树脂的吸附柱上，多余的杂质随流出液流出。然后，利用较高盐离子浓度的溶液作为漂洗液，可以将结合在dna吸附柱上的蛋白等杂质漂洗掉，然后继续增加盐离子浓度、并改变ph值范围作为洗脱液，基因组dna从预装柱上洗脱下来。整个操作流程具有方便、快速等优点，且全程利用重力，没有剪切力，可以最大程度保留基因组dna的完整性。
12.优选地，所述裂解液包含100-500mm的guanidine-hcl（盐酸胍）、10-50mm且ph为7.5-8.5的tris-cl、10-50mm的edta、100-500mm的nacl、0.15-1% (v/v)的triton
®
x-100、5-100mm的dtt（二硫苏糖醇）。
13.优选地，所述平衡结合液包含300-700mm的nacl、50-100mm且ph为6.5-7.5的mops（3-吗啉丙磺酸）、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15% (v/v)的tritonx-100。
14.优选地，所述漂洗液包含700-1200mm的nacl、50-100mm且ph为4.5-5.5的naac、10-15%(v/v) 的异丙醇或者无水乙醇。
15.优选地，所述洗脱液包含1200-1700mm的nacl、50-100mm且ph为8.0-9.0的mops、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇。
16.优选地，所述基因组dna提取试剂盒还包括组织保护剂；所述组织保护剂选自有机还原剂。
17.进一步地，所述核酸保护剂选自巯基乙醇、二硫苏糖醇或三（2-羧乙基）膦盐酸盐中的至少一种。
18.进一步地，所述核酸保护剂的终浓度为5-100mm。
19.需要说明的是，“核酸保护剂的终浓度”是指核酸保护剂加入生物样本后，在生物样本中的终浓度。
20.本技术的发明人经过大量实验可得，采用上述浓度的核酸保护剂对核酸的保护效果较好，可防止生物样本中的核酸降解，抑制核酸酶，并保证得到更完整的基因组dna。
21.第二方面，本技术提供了上述基因组dna提取试剂盒在基因组dna提取方法中的应用。
22.第三方面，本技术提供了一种基因组dna的提取方法，具体包括以下步骤：向样本中加入所述组织保存液保护核酸，然后加入所述裂解液和蛋白酶k进行裂解，然后加入所述平衡结合液，混匀得到待纯化液；利用所述cs1组织过滤器将所述待纯化液注射到所述deae弱阴离子交换树脂中，至所有溶液流过，弃流出液；向所述deae弱阴离子交换树脂中加入所述漂洗液，至所有溶液流过，弃漂洗流出液；向所述deae弱阴离子交换树脂中加入所述洗脱液，至所有溶液流过，收集洗脱流出液；将所述洗脱流出液依次经过异丙醇洗涤、乙醇漂洗、晾干、溶解，即得所述基因组dna。
23.可选地，所述样本选自海洋动物样本和昆虫样本中的任意一种。
24.综上所述，本技术的技术方案具有以下效果：本技术利用组织保存液和裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液、cs1组织过滤器、deae弱阴离子交换树脂组成基因组dna提取试剂盒，提供了基因组dna的提取方法，该方法
提取到的基因组dna完整性高，纯度好，能够满足动物三代测序基因组dna的需求；且该提取方法适用于海洋动物样本和昆虫样本，普适性强。
附图说明
25.图1为实施例1中蛏子基因组dna的琼脂糖凝胶电泳结果（e1-1表示使用组织保存液，e1-2表示未使用组织保存液）。
26.图2为实施例2中蛤蜊基因组dna的琼脂糖凝胶电泳结果（e2-1表示使用cs1组织过滤器，e2-2表示未使用cs1组织过滤器）。
27.图3为实施例3中6种海洋动物样本基因组dna的琼脂糖凝胶电泳结果（e3-1、e3-2、e3-3、e3-4、e3-5、e3-6依次表示虾、蛏子、蛤蜊、鱼、海螺、扇贝）。
28.图4为实施例4中4种昆虫样本基因组dna的琼脂糖凝胶电泳结果（e4-1、e4-2、e4-3、e4-4依次表示蚜虫、面包虫、飞蛾、甲虫）。
29.图5为实施例5中面包虫样本基因组dna的琼脂糖凝胶电泳结果（e5-1表示本技术的提取方法，e5-2表示其他厂家的提取方法）。
30.图6为实施例6中面包虫基因组dna的琼脂糖凝胶电泳结果（e6-1、e6-2、e6-3、e6-4依次表示x厂家、y厂家、z厂家、本技术）。
具体实施方式
31.第一方面，本技术提供一种基因组dna提取试剂盒，包括组织保存液、deae弱阴离子交换树脂、cs1组织过滤器、裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液。
32.其中，组织保存液包含500-1000mm的nacl、5-15mm且ph为7.5-9.0的tris-cl、10-75mm的edta、0.5-2%(v/v)的triton
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x-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)、0.5-2%的十二烷基硫酸钠；deae弱阴离子交换树脂是二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉，粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联deae基团2-3μmol；cs1组织过滤器包含30ml注射器、两层20um筛板、一层无纺布；裂解液包含100-500mm的guanidine-hcl、10-50mm且ph为7.5-8.5的tris-cl、10-50mm的edta、100-500mm的nacl、0.15-1% (v/v)的triton
®
x-100、5-100mm的dtt；平衡结合液包含300-700mm的nacl、50-100mm且ph为6.5-7.5的mops、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15% (v/v)的tritonx-100；漂洗液包含700-1200mm的nacl、50-100mm且ph为4.5-5.5的naac、10-15%(v/v) 的异丙醇或者无水乙醇；洗脱液包含1200-1700mm的nacl、50-100mm且ph为8.0-9.0的mops、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇。
33.第二方面，本技术提供的基因组dna的提取方法，具体包括以下步骤：s1：柱平衡取deae修饰的离子交换硅胶粉1-2g（粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联deae基团2-3μmol）作为deae弱阴离子交换树脂，填充到30 ml柱体积的预装柱中，作为dna吸附柱；向dna吸附柱中加入5ml平衡结合液，通过重力作用使平衡结合液流过吸附柱，待
吸附柱中的溶液流尽后，弃溶液，dna吸附柱备用。
34.注意：平衡结合液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
35.s2：样本前处理：取100-500mg动物组织加入液氮充分研磨，转移到50ml收集管中。
36.具体地，当样本为核酸含量高的肝脏等样本，可以取样100-300mg左右；当样本为核酸含量较低的昆虫、肌肉等组织样本，可以取样300-500mg。
37.s3：基因组dna吸附和纯化s3.1：向步骤s2中装有样本的收集管中迅速加入1ml组织保存液静置5min，加入4ml裂解液，50
µ
l核酸保护剂st（天根生化科技（北京）有限公司），200
µ
l proteinase k，迅速振荡混匀后，将离心管放在50℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管数次以混合样品；加入100
µ
l 10mg/ml的rnase a （天根生化科技（北京）有限公司），充分混匀，室温静置5min；加入10ml平衡结合液，颠倒混匀30s，得到待纯化液。
38.s3.2：利用cs1组织过滤器将待纯化液用推杆注射到步骤s1中平衡后的dna吸附柱中，至所有溶液流过，弃流出液。
39.s3.3：取10ml漂洗液加入至dna吸附柱中，至所有溶液流过，弃漂洗流出液。
40.s3.4：向dna吸附柱中加入7.5 ml洗脱液，至所有溶液流过，收集洗脱流出液至一个干净的50ml离心管。
41.s3.5：向收集的洗脱流出液中加入5ml的异丙醇，充分混匀；于4℃下8000rpm离心10min，小心倒掉上清（注意：可以在离心管上标记沉淀的位置，倒去上清时避免沉淀损失）；向含有沉淀的离心管中加入2ml 70%（v/v）的乙醇漂洗沉淀，并于4℃下8000rpm离心5min，小心弃掉一半上清（注意：漂洗沉淀不能剧烈涡旋，轻晃离心管至沉淀重悬即可）；用剪过的蓝枪头转移剩余上清及沉淀，至1.5 ml的离心管中，并于4℃下8000 rpm离心5 min；用枪头弃去管底残留液体，室温干燥5-10 min；加入100-300
µ
l的洗脱缓冲液tb溶解基因组dna，并于适当条件保存（注意：可以将洗脱液置于50℃加热10 min，以充分溶解dna）。
42.s4：针对个别极其复杂样本，如果提取产物纯度不满足，建议使用0.8倍体积的beckman xp或者tiangen ng316磁珠按照操作说明进行纯化一遍。
43.以下结合实施例以及试验结果对本技术作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本技术所要求保护的范围。
实施例实施例1
44.本实施例提供了一种蛏子基因组dna的提取方法。
45.本实施例分为两组试验：一组使用组织保存液（e1-1），一组是未加组织保存液（e1-2）；实施例所用溶液具体为：组织保存液包含750mm的nacl、10mm且ph为8.3的tris-cl、50mm的edta、1.2%(v/v)
的triton
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x-100、1.2%的十二烷基硫酸钠；裂解液包含300mm的guanidine-hcl、30mm且ph为8.0的tris-cl、30mm的edta、300mm的nacl、0.5% (v/v)的triton
®
x-100、50mm的dtt；平衡结合液包含500mm的nacl、75mm且ph为7.0的mops、12%(v/v) 的异丙醇、0.1% (v/v)的tritonx-100；漂洗液包含1000mm的nacl、75mm且ph为5.0的naac、12%(v/v) 的异丙醇；洗脱液包含1500mm的nacl、75mm且ph为8.5的mops、12%(v/v)的异丙醇；本实施例中蛏子基因组dna的提取方法，具体包括以下步骤：s1：柱平衡取deae修饰的离子交换硅胶粉1.5g（粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联deae基团2-3μmol）作为deae弱阴离子交换树脂；填充到30 ml柱体积的预装柱中，作为dna吸附柱；向dna吸附柱中加入5ml平衡结合液，通过重力作用使平衡结合液流过吸附柱，待吸附柱中的溶液流尽后，弃溶液，dna吸附柱备用。
46.s2：样本前处理取300mg蛏子动物组织样本加入液氮充分研磨，转移到50ml收集管中。
47.s3：基因组dna吸附和纯化s3.1：向步骤s2中装有样本的收集管中迅速加入1ml组织保存液静置5min，加入4ml裂解液，50
µ
l核酸保护剂st，200
µ
l proteinase k，迅速振荡混匀后，将离心管放在50℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管数次以混合样品；加入100
µ
l rnase a (10mg/ml)，充分混匀，室温静置5min；加入10ml平衡结合液，颠倒混匀30s，得到待纯化液。
48.s3.2：利用cs1组织过滤器将待纯化液用推杆注射到步骤s1中平衡后的dna吸附柱中，至所有溶液流过，弃流出液。
49.s3.3：取10ml漂洗液加入至dna吸附柱中，至所有溶液流过，弃漂洗流出液。
50.s3.4：向dna吸附柱中加入7.5 ml洗脱液，至所有溶液流过，收集洗脱流出液至一个干净的50ml离心管。
51.s3.5：向收集的洗脱流出液中加入5ml的异丙醇，充分混匀；于4℃下8000rpm离心10min，小心倒掉上清（注意：可以在离心管上标记沉淀的位置，倒去上清时避免沉淀损失）；向含有沉淀的离心管中加入2ml 70%的乙醇漂洗沉淀，并于4℃下8000rpm离心5min，小心弃掉一半上清（注意：漂洗沉淀不能剧烈涡旋，轻晃离心管至沉淀重悬即可）；用剪过的蓝枪头转移剩余上清及沉淀，至1.5 ml的离心管中，并于4℃下8000 rpm离心5 min；用枪头弃去管底残留液体，室温干燥5-10 min；加入200
µ
l的洗脱缓冲液tb溶解基因组dna，并于适当条件保存（注意：可以将洗脱液置于50℃加热10 min，以充分溶解dna）。
52.试验结果：蛏子基因组dna的提取结果如图1和表1所示。
53.表1 实施例1中蛏子基因组dna的提取结果
54.从提取的nanodrop 2000测值及琼脂糖凝胶电泳结果（图1）结果看，未加组织保存液提取的基因组dna od 260/230比值偏高，电泳条带明显降解。而本技术加入组织保存液后，提取的基因组dna核酸的比值变好，od 260/230比值接近2.2，电泳条带完整性较好，主带在48kb左右，可以满足三代测序对核酸的纯度要求。
实施例2
55.本实施例提供了一种蛤蜊基因组dna的提取方法。
56.本实施例分为两组试验：一组使用cs1组织过滤器（e2-1），一组未使用cs1组织过滤器（e2-2）。
57.本实施例中蛤蜊基因组dna的提取方法与实施例1中试验组e1-1的不同之处在于：样本为150mg蛤蜊样本。
58.试验结果：蛤蜊基因组dna的提取结果如图2和表2所示。
59.表2 实施例2中蛤蜊基因组dna的提取结果
60.从提取的nanodrop 2000测值及琼脂糖凝胶电泳结果（图2）结果看，未使用cs1组织过滤器提取的核酸浓度低，电泳条带有明显拖尾现象，且泳道口有杂质残留。而本技术使用cs1组织过滤器提取的核酸浓度高，电泳条带完整性较好，泳道口干净，无杂货残留，可以满足三代测序对核酸浓度和纯度的要求。
实施例3
61.本实施例验证了基因组dna的提取方法对不同海洋动物样本提取的普适性。
62.本实施例分为六组试验：选取6种常见海洋动物样本（虾、蛏子、蛤蜊、鱼、海螺、扇贝），分别取300mg的样本按照实施例1中试验组e1-1提供的提取方法进行提取基因组dna。
63.试验结果：基因组dna的提取结果如图3和表3所示。
64.提取过程中没有出现样本粘稠堵柱子的情况，dna洗脱液无色素残留，提取得率和纯度均能达到三代测序基因组dna的要求，说明本技术提供的基因组dna的提取方法具有较广的样本适用性。
65.表3 实施例3中6种海洋动物样本基因组dna的提取结果
实施例4
66.本实施例验证了基因组dna的提取方法对不同昆虫组织基因样本提取的普适性。
67.本实施例分为六组试验：选取4种昆虫组织样本（蚜虫、面包虫、飞蛾、甲虫），分别按照表4的取样量进行取样，并按照实施例1中试验组e1-1提供的提取方法进行提取基因组dna。
68.试验结果：基因组dna的提取结果如图4和表4所示。
69.表4 实施例4中4种不同昆虫基因组dna的提取结果
70.提取过程中没有出现样本粘稠堵柱子的情况，dna洗脱液无色素残留，提取得率和纯度均能达到三代测序基因组dna的要求，说明本技术提供的基因组dna的提取方法具有较广的样本适用性。从结果看，本技术的提取方法同样适用于昆虫类的样本基因组dna提取。
实施例5
71.本实施例提供了利用本技术与其他厂家对面包虫基因组dna提取的试验结果对比。
72.本实施例选取300mg面包虫样本进行提取，并分为两组试验：一组为利用本技术实施例1中试验组e1-1提供的提取方法（e5-1），一组是利用其他厂家（qiagen产品操作说明书）提供的提取方法（e5-2）。
73.试验结果：基因组dna的提取结果如图5和表5所示。
74.表5 实施例5中面包虫样本基因组dna的提取结果
75.从提取的nanodrop 2000测值结果看，其他厂家产品提取得率较低，洗脱液杂质残留严重，dna洗脱液呈现浑浊状态，泳道口残留严重。而利用本技术提供的提取方法的得率较高，比值均较好，杂质去除效果较好，dna洗脱液无色素残留。
实施例6
76.本实施例提供了利用不同厂家填料对面包虫基因组dna提取的结果。
77.本实施例选取300mg面包虫样本进行提取，并利用不同来源（x厂家、y厂家、z厂家、本技术）的deae修饰的离子交换填料1.5g对面包虫基因组dna进行提取，分为四组试验。
78.试验结果：基因组dna的提取结果如图6和表6所示。
79.表6 实施例6中利用不同厂家填料对面包虫基因组dna提取的结果
80.从提取的nanodrop 2000测值结果看，所用其他厂家的离子交换填料提取得率较低，纯度较差，均不能满足三代测序的上机要求。而本技术方法所使用的离子交换填料效果最好，所提的基因组dna浓度和纯度均能满足三代测序的需求。
81.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述基因组dna提取试剂盒包括组织保存液、裂解液、平衡结合液、漂洗液、洗脱液；所述组织保存液包含500-1000mm的nacl、5-15mm且ph为7.5-9.0的tris-cl、10-75mm的edta、0.5-2%(v/v)的triton
®ꢀ
x-100、0.5-2%的十二烷基硫酸钠；所述平衡结合液、漂洗液、洗脱液中盐离子浓度的大小关系为平衡结合液<漂洗液<洗脱液。2.根据权利要求1所述的基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述基因组dna提取试剂盒还包括cs1组织过滤器；所述cs1组织过滤器包含30ml注射器、两层20um筛板、一层无纺布。3.根据权利要求1所述的基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述基因组dna提取试剂盒还包括deae弱阴离子交换树脂；所述deae弱阴离子交换树脂是二乙基氨基乙基弱阴离子修饰的多孔硅胶粉，粒径范围70-100μm，每克硅胶粉偶联deae基团2-3μmol。4.根据权利要求1所述的基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包含：100-500mm的guanidine-hcl、10-50mm且ph为7.5-8.5的tris-cl、10-50mm的edta、100-500mm的nacl、0.15-1% (v/v)的triton
®
x-100、5-100mm的dtt。5.根据权利要求1所述的基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述平衡结合液包含：300-700mm的nacl、50-100mm且ph为6.5-7.5的mops、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇、0.05-0.15% (v/v)的tritonx-100。6.根据权利要求1所述的基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液包含：700-1200mm的nacl、50-100mm且ph为4.5-5.5的naac、10-15%(v/v) 的异丙醇或者无水乙醇。7.根据权利要求1所述的基因组dna提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液包含：1200-1700mm的nacl、50-100mm且ph为8.0-9.0的mops、10-15%(v/v)的异丙醇或者无水乙醇。8.如权利要求1-7任一项所述的基因组dna提取试剂盒在基因组dna提取方法中的应用。9.根据权利要求8所述的基因组dna的提取方法，其特征在于，具体包括以下步骤：向样本中加入所述组织保存液保护核酸，然后加入所述裂解液和蛋白酶k进行裂解，然后加入所述平衡结合液，混匀得到待纯化液；利用所述cs1组织过滤器将所述待纯化液注射到所述deae弱阴离子交换树脂中，至所有溶液流过，弃流出液；向所述deae弱阴离子交换树脂中加入所述漂洗液，至所有溶液流过，弃漂洗流出液；向所述deae弱阴离子交换树脂中加入所述洗脱液，至所有溶液流过，收集洗脱流出液；将所述洗脱流出液依次经过异丙醇洗涤、乙醇漂洗、晾干、溶解，即得所述基因组dna。10.根据权利要求9所述的基因组dna的提取方法，其特征在于，所述样本选自海洋动物样本和昆虫样本中的任意一种。

技术总结
本申请涉及DNA提取的技术领域，具体公开了一种基因组DNA提取试剂盒及基因组DNA的提取方法。本申请提供的基因组DNA提取试剂盒，包括组织保存液；所述组织保存液包含500-1000mM的NaCl、5-15mM且pH为8.3的Tris-Cl、10-75mM的EDTA、0.5-2%(v/v)的Triton


技术研发人员：高玉洁 邹爱兰 刘玉方 李晓晨 孙克非
受保护的技术使用者：天根生化科技（北京）有限公司
技术研发日：2023.06.09
技术公布日：2023/7/12