一套用于矮脚鸡品种鉴定的SNP位点引物组合及其应用的制作方法

一套用于矮脚鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用
技术领域
1.本发明涉及家禽品种鉴定方法，具体地，涉及一套用于矮脚鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用。


背景技术：

2.矮脚鸡是我国著名的地方鸡种，也是贵州省兴义市的地方特色品种，其主要分布于贵州省兴义市，主要特征是胫短，整个体躯似匍匐地面，公鸡胫长6.5cm左右，母鸡胫长5.9cm左右，具有节粮、生产性能好，肉质鲜美，耐粗饲，抗病性能良好的特点，广受人们喜爱。近十多年来，一方面受时代市场经济需求，大量外来品种进入，对兴义市养鸡业的发展和农民增收取到极大的推动作用；另一方面，在外来品种引进的情况下，对兴义矮脚鸡缺乏应有的保护措施，导致矮脚鸡品质退化，数量锐减。矮脚鸡品种作为进入国家品种资源名录的珍贵资源，应充分利用其优势进行保种和培育，对其实施标准化、规模化养殖是保护我国珍稀家禽品种、丰富种质资源库的有效性措施。这些工作的基础是收集和保护纯种矮脚鸡，因此矮脚鸡的品种鉴定必不可少。
3.目前矮脚鸡的品种鉴定多采用外观观察方式，缺乏科学有效的技术手段，导致鉴定错误率高，开发一种能有效准确鉴定矮脚鸡品种的方法，应用于矮脚鸡品种鉴定工作具有十分重要的意义。


技术实现要素：

4.针对上述矮脚鸡的品种鉴定缺乏科学有效的手段的问题，本发明提供了一套用于矮脚鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用，通过检测提供的矮脚鸡9个snp位点的基因型来联合判断待测个体是否属于矮脚鸡。该方法操作简便，准确性高，可以准确鉴定矮脚鸡品种。
5.为了实现上述目的，本发明一方面提供一套用于矮脚鸡品种鉴定的snp位点引物组合，所述引物组合扩增选自如下aj1位点到aj9位点中的任意4到9种：
各snp位点引物的核苷酸序列如下：本发明还提供了一种上述snp位点引物组合在矮脚鸡品种鉴定中的应用。
6.具体地，鉴定方法包括以下步骤：(1)提取待测鸡基因组总dna；(2)根据所选snp组合，利用对应的引物对分别进行pcr扩增；(3)将pcr扩增产物测序后、判断基因型；(4)根据基因型结果，判断个体是否属于矮脚鸡品种。
7.步骤（4）中的具体判断方法为：如果所选snp组合对应的基因型有一个不符合矮脚鸡对应的基因型，则判定该个体不属于矮脚鸡；如果所选至少4个snp位点组合对应的基因型全部符合矮脚鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于矮脚鸡的概率。
8.优选地，所述步骤(1)中待测鸡的基因组dna由该鸡种的个体翅静脉采血得到。
9.步骤（2）中，aj1~aj9的pcr产物长度分别为215 bp、192 bp、175 bp、199 bp、219 bp、204 bp、187 bp、250 bp、173 bp。
10.优选地，所述矮脚鸡中9个snp位点aj1～aj9的基因型依次为aa、aa、cc、tt、tt、gg、ag、ct、aa。
11.通过上述技术方案，本发明实现了以下有益效果：采用本发明的snp位点引物进行矮脚鸡的品种鉴定，任意1个snp位点基因型判定为矮脚鸡的概率最低70.04％，最高79.60％；任意2个snp位点联合基因型判定为矮脚鸡的概率达到87.93％以上；任意3个snp位点联合基因型判定为矮脚鸡的概率达到95.08％以
上；任意4个snp位点联合基因型判定为矮脚鸡的概率达到98.56％以上；任意5个snp位点联合基因型判定为矮脚鸡的概率达到99.62％以上；任意6个snp位点联合基因型判定为矮脚鸡的概率达到99.80％以上；任意7个snp位点联合基因型判定为矮脚鸡的概率达到99.97％以上；任意8个snp位点的联合基因型判定为矮脚鸡的概率达到99.99％以上；全部9个snp位点的联合基因型判定为矮脚鸡的概率为100％。任意一个snp位点基因型排除矮脚鸡的概率即达到100％。
12.因此，只要有一个snp位点基因型不符合矮脚鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于矮脚鸡；任选4个snp位点组合，符合矮脚鸡基因型的判定概率即可达到98％以上。这种方法操作简便，准确性高。
具体实施方式
13.本发明提供了一套用于矮脚鸡品种鉴定的snp位点引物组合及其应用，所述引物组合扩增选自aj1位点到aj9位点中的任意4到9种。
14.9个snp位点的筛选方法为：利用京芯一号芯片（55k，北京康普森生物技术有限公司）对不同鸡品种（矮脚鸡、高脚鸡、竹香鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、乌蒙凤鸡等国内代表性鸡品种以及国外代表性引进用于杂交配套的哈伯德、来航鸡品种合计12个品种）的55000个snp位点进行筛选确定，根据每个品种跟其他品种对比，取差异最大的位点的集合，群体间遗传分化指数（fst）前1%，最小等位基因频率（maf）》0.4，缺失率（miss rate）《0.2 进行筛选，确定68个snp位点，为了进一步筛选出矮脚鸡核心位点信息，优先选择矮脚鸡参考基因组位点等位基因频率为0或1，然后确定其他11个品种的每个位点的不同等位基因频率均值，再通过该均值与矮脚鸡每个位点的不同等位基因频率进行比较，筛选等位基因频率差异较大的snp位点，其他群体该等位基因频率为接近1或接近0的位点，最终确定用于矮脚鸡品种鉴定的9个snp位点。9个snp位点信息见下表。
15.根据9个snp位点的物理位置，基于红色原鸡参考基因组序列(galgal5)，利用ucsc网站https://genome-asia.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway?hgsid=791993043_mvnmfj6qpmrqsauoxqixq3gpteuu，获得9个snp位点dna序列，然后利用primer5.0设计引物。各snp引物序列、pcr产物长度和退火温度见下表：
用上述snp引物组合进行矮脚鸡品种鉴定具体方法包括如下步骤：(1)提取待测鸡基因组总dna；(2)根据所选snp组合，利用对应的引物对分别进行pcr扩增；(3)将pcr扩增产物测序后、判断基因型；(4)根据基因型结果，判断个体是否属于矮脚鸡品种。
16.在本发明鉴定方法中，优选从待测鸡的翅静脉采血获得全血提取基因组dna，本发明对基因组dna的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规提取方法即可，在本发明实施例中，优选酚-氯仿法提取基因组dna。
17.本发明中，应用时采用aj1～aj9中的一个位点或者几个位点进行矮脚鸡品种的鉴定，并采用对应的上下游引物进行pcr扩增。pcr扩增采用本领域常规pcr扩增方法即可。
18.本发明中，矮脚鸡中9个snp位点aj1～aj9的基因型依次为aa、aa、cc、tt、tt、gg、ag、ct、aa。
19.通过对待测鸡pcr扩增产物测序后、判断基因型，与所选snp组合对应的基因型进行比对，如果有一个不符合矮脚鸡对应的基因型，则判定该个体不属于矮脚鸡；如果所选snp组合对应的基因型全部符合矮脚鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于矮脚鸡的概率。计算公式如下：
其中，pi表示snp组合中第i个snp中其他品种对应基因型的频率。
20.所述snp位点在矮脚鸡及其他品种中的基因型频率如下表：例如，选择aj2、aj4、aj6、aj8合计4个snp位点，如果联合基因型为aattggct，则该个体属于矮脚鸡的概率为p＝1/(1+0.33
×
0.27
×
0.28
×
0.43)＝0.9894。
21.其中，其他品种的基因型频率是指选择高脚鸡、竹香鸡、威宁鸡、黔东南小香鸡、金湖乌凤鸡、丝羽乌骨鸡、乌蒙乌骨鸡、兴文乌骨鸡、乌蒙凤鸡、哈伯德、来航鸡等国内外11个代表性品种，不同品种合并计算得到的每个位点的基因型频率均值。
22.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
23.实施例1随机选择江苏省重点实验室家禽种质资源遗传材料库保存的矮脚鸡25只、高脚鸡25只、黔东南小香鸡25只、竹香鸡25只、乌蒙凤鸡25只、乌蒙乌骨鸡25只、兴文乌骨鸡25只、哈伯德25只，翅静脉采血，酚-氯仿法提取基因组dna，选择aj1、aj3、aj5、aj7合计4个snp位点的引物进行pcr扩增。
24.pcr总反应体系50μl：dna模板2μl，dntp（2 mmol/l）4μl，mg
2+
（3 mmol
·
l-1
）0.6μl，1
×
pcr反应缓冲液5μl，上、下游引物（10 μmol
·
l-1
）各1μl，taq聚合酶（1u
·
μl-1
）2.5μl，补超纯水至50μl。
25.pcr反应程序：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸5 min。pcr扩增目的片段用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。
26.pcr产物送生物公司进行测序，同时序列进行多态性检测和基因型判定。根据测序结果，4个位点联合基因型为aaccttag的25个个体判定为矮脚鸡的概率为p＝1/(1+0.32
×
0.31
×
0.25
×
0.36)＝0.9912，99.12%可以将25个个体全部鉴定为矮脚鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合aaccttag基因型，因此判定为非矮脚鸡。
27.实施例2其他条件同实施例1，区别在于，采用aj1、aj2、aj3、aj4、aj5、aj6对应的6个snp位点的引物进行pcr扩增。根据测序结果，6个位点联合基因型为aaaaccttttgg的25个个体判定为矮脚鸡的概率为p＝1/(1+0.32
×
0.31
×
0.31
×
0.26
×
0.25
×
0.30)＝0.9994，99.94%可以将25个个体全部鉴定为矮脚鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合aaaaccttttgg基因型，因此判定为非矮脚鸡。
28.实施例3其他条件同实施例1，区别在于，采用aj1~aj9对应的9个snp位点的引物进行pcr扩增。根据测序结果，9个位点联合基因型为aaaaccttttggagctaa的25个个体判定为矮脚鸡的概率为p＝1/(1+0.32
×
0.31
×
0.31
×
0.26
×
0.25
×
0.30
×
0.36
×
0.41
×
0.32)＝1.0000，100%可以将25个个体全部鉴定为矮脚鸡，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合aaaaccttttggagctaa基因型，因此判定为非矮脚鸡。
29.以上结合实施例详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
30.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
31.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

技术特征：
1.一套用于矮脚鸡品种鉴定的snp位点引物组合，其特征在于，所述引物组合扩增选自如下aj1位点到aj9位点中的任意4到9种：aj1位于nc_006096.4染色体9上第19307655位，其为c或a多态；aj2位于nc_006089.4染色体2上第20495792位，其为g或a多态；aj3位于nc_006094.4染色体7上第25731998位，其为g或c多态；aj4位于nc_006090.4染色体3上第86708187位，其为c或t多态；aj5位于nc_006089.4染色体2上第10600720位，其为c或t多态；aj6位于nc_006090.4染色体3上第25863511位，其为a或g多态；aj7位于nc_006092.4染色体5上第14021184位，其为a或g多态；aj8位于nc_006091.4染色体4上第87270080位，其为c或t多态；aj9位于nc_006089.4染色体2上第146612964位，其为a或g多态。2. 根据权利要求1所述的snp位点引物组合，其特征在于，各snp位点引物的核苷酸序列为：aj1-f：5’aaagccaaacctgtggttga 3’aj1-r：5’tcggtctgccagaactgaat 3’aj2-f：5’agggccattccttgactctt 3’aj2-r：5’cccaggactctctgaagcac 3’aj3-f：5’ggcatcctcttgaaaacagc 3’aj3
ꢀ‑
r：5’ctgggacctgtgttggtctt 3’aj4-f：5’ctttttggcaggactgttcc 3’aj4-r：5’gacatgcacagaagatgaagga 3’aj5-f：5’acgagaagccagagcatcat 3’aj5-r：5’ccttgcagcacaggtattga 3’aj6-f：5’tctgccaaagcagactgatg 3’aj6-r：5’acagatgagccggaaaagtg 3’aj7-f：5’aaaaacaggcggctttgtaa 3’aj7-r：5’tattcccactttccccagtg 3’aj8-f：5’ttcacttcttcactagctgctca 3’aj8-r：5’tcctgtgggtgaattctcag 3’aj9-f：5’tcattgggaagaaggggttt 3’aj9-r：5’ggctgatttgaaaggagcag 3’。3.权利要求1或2所述的snp位点引物组合在矮脚鸡品种鉴定中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，鉴定方法包括如下步骤：（1）提取待测鸡基因组总dna；（2）根据所选snp组合，利用权利要求2对应的引物对分别进行pcr扩增；（3）将pcr扩增产物测序后、判断基因型；（4）根据基因型结果，判断个体是否属于矮脚鸡品种。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中待测鸡的基因组dna由该鸡种的个体翅静脉采血得到。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述矮脚鸡中9个snp位点aj1~aj9的基因型依次为aa、aa、cc、tt、tt、gg、ag、ct、aa。7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，aj1~aj9的pcr产物长度分别为215 bp、192 bp、175 bp、199 bp、219 bp、204 bp、187 bp、250 bp、173 bp。8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，判断方法为：如果所选snp组合对应的基因型有一个不符合矮脚鸡对应的基因型，则判定该个体不属于矮脚鸡；如果所选的至少4个snp位点组合的基因型符合矮脚鸡对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定该个体属于矮脚鸡的概率。

技术总结
本发明公开了一套用于矮脚鸡品种鉴定的SNP位点引物组合及其应用。所述引物组合扩增选自AJ1位点到AJ9位点中的任意4到9种。采用本发明提供的SNP位点引物组合进行矮脚鸡的鉴定，只要有一个SNP位点基因型不符合矮脚鸡相应的基因型，即可完全排除该个体属于矮脚鸡；任选4个SNP位点组合，符合矮脚鸡基因型的判定概率即可达到98％以上。概率即可达到98％以上。


技术研发人员：屠云洁 束婧婷 章明 姬改革 单艳菊 肖芹 巨晓军 刘一帆 盛中伟 邹剑敏 卢永胜 戴利霞 卢新旺
受保护的技术使用者：和盛食品集团有限公司
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/7/13